專利名稱：：含釩的磷酸酶抑制劑的增強(qiáng)作用的制作方法200810003838.0含釩的磷酸酶抑制劑的增強(qiáng)作用本發(fā)明涉及磷酸酶的生物化學(xué)。具體而言，本發(fā)明涉及可與不同磷酸酶的含釩的抑制刑共存的、用作添加劑的化合物。如本發(fā)明中用作添加劑的化合物可增強(qiáng)抑制作用。因此，較低濃度的含釩化合物即可充分抑制磷酸酶。
背景技術(shù)：
：磷酸酶是可將磷酸單酯水解為磷酸根離子和含自由輕基的分子的酶。該作用與可將磷酸基團(tuán)通過例如ATP之類的化學(xué)能貯存分子加到其底物上的磷酸化酶和激酶的作用截然相反。磷酸酶可分為兩個(gè)主要的類別金屬酶(在其活性部位需要存在兩個(gè)或多個(gè)金屬離子以產(chǎn)生活性)和非金屬酶。這些類別可進(jìn)一步劃分為亞類。迄今金屬酶包括了大部分的磷酸酶，并包括例如堿性磷酸酶(含三個(gè)金屬離子，其中只有兩個(gè)是具有催化活性的)、絲氨酸蘇氨酸磷酸酶和肌醇單磷酸酶這樣的酶。了解最清楚的非金屬酶是蛋白酪氨酸磷酸酶，可水解磷酸-酪氨酸殘基。已知蛋白上的磷酸基團(tuán)的存在與否可在多個(gè)生化途徑、特別是信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起調(diào)控作用。酪氨酸殘基可通過蛋白激酶連接磷酸基團(tuán)(磷酸化)。在磷酸化狀態(tài)下，酪氨酸殘基稱為磷酸酪氨酸(phosphotyrosine)。酪氨酸磷酸化被認(rèn)為是信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)控酶活性的關(guān)鍵步驟之一。磷酸酪氨酸可通過特定抗體進(jìn)行檢測(cè)。特定的激酶和磷酸酶一起可調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)途徑的酶、受體和其它組分、轉(zhuǎn)錄因子及其它功能蛋白的活性。因此，有多種生化方法可檢測(cè)生物樣品中的磷酸化蛋白。例如，裂解樣品細(xì)胞材料，將蛋白組分進(jìn)行一維(例如SDS-PAGE)或二維(例如，第一維為等電聚焦，第二維為SDS-PAGE)分離，通過磷酸絲氨酸或磷酸酪氨酸特異抗體檢測(cè)每個(gè)條帶或點(diǎn)的磷酸化蛋白。其它特異的檢測(cè)方法使用與特定磷酸化蛋白特異結(jié)合的抗體。這種抗體通常用于來自活組織檢查材料的福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片中的磷酸化把蛋白的組織化學(xué)檢測(cè)。不管使用哪種檢測(cè)方法，都希望磷酸化蛋白的分析結(jié)果可反映實(shí)驗(yàn)4開始的時(shí)間點(diǎn)，即細(xì)胞裂解或組織固定和切片時(shí)的磷酸化狀態(tài)。更通常是希望在特定時(shí)間點(diǎn)保持蛋白磷酸化的狀態(tài)?？赏ㄟ^抑制磷酸酯從其靶蛋白上水解來進(jìn)行保持。為了該目的，本
技術(shù)領(lǐng)域：
提供了多種可抑制磷酸酶活性的物質(zhì)。抑制劑通?？捎糜跈z測(cè)磷酸化蛋白的檢測(cè)方法中，也可用于大量純化磷酸化蛋白的過程中。在磷酸酶活性的含釩抑制劑中，過釩酸鹽和釩酸鹽是了解最多應(yīng)用最廣泛的物質(zhì)。釩酸鹽是可模擬磷酸鹽水解的過渡態(tài)的磷酸鹽類似物，因此被認(rèn)為是通用的磷酸酶抑制劑。不過，公認(rèn)的是釩酸鹽特別適于抑制酪氨酸磷酸酶(Huyer,G.,etal.，J.Biol.Chem.272(1997)843-851)和堿性磷酸酶(例如，Stankiewicz,P.J.,etal.,inMet.IonsBiol.Syst31(1995)287-324)。但也報(bào)道了對(duì)其它磷酸酶，例如ATPases、葡萄糖-6-磷酸酶、酸性磷酸酶或果糖-2,6-二磷酸酶的抑制。但不利之處在于，為了提供有效量的釩酸鹽，其濃度必須在微摩爾、甚至毫摩爾的范圍。在這點(diǎn)上，"有效量"可理解為在水溶液中的抑制劑濃度在lx(1倍)和50x(50倍)之間，在lx濃度中的有效量可以20為倍數(shù)降低磷酸酶活性。相對(duì)于釩酸鹽，已知其它的磷酸酶活性抑制劑在納摩爾濃度有效。例如斑蝥素。然而，已報(bào)道可通過形成穩(wěn)定的含釩絡(luò)合物來增強(qiáng)抑制作用。例如，二過氧(二嘧咬)含氧釩酸鉀(potassiumbisperoxo(bipyridine)oxovanadate)(V)和二過氧(1,10菲咯啉)含氧釩酸鉀(potassiumbisperoxo(1,10phenanthroline)oxovanadate)(V)均比原釩酸鹽更有效。但釩酸鹽的絡(luò)合作用不是提高有效性所必需的前提條件。例如，輕胺或二甲基羥胺可與釩酸鹽自發(fā)形成絡(luò)合物。這些絡(luò)合物的有效性保持原水平或有一定程度降低(Cuncic，C.，etal.，Biochem.Pharmacol.58(1999)1859-1867)。在細(xì)胞水平的檢測(cè)法中，已發(fā)現(xiàn)這兩種化合物可增強(qiáng)細(xì)胞腔對(duì)釩酸鹽的吸收(Nxumalo,F.，etal.，J.Biol.Inorg.Chem.3(1998)534-542;Cuncic，C.，etal.,Biochem.Pharmacol.58(1999)1859-1867)。進(jìn)一步已知在存在特定的絡(luò)合物形成試劑，例如EDTA時(shí)，釩酸鹽抑制磷酸酶的作用可降低約1,000倍(Huyer,G.,etal.,J.Biol.Chem.272(1997)843-851)。這是非常不利的，因?yàn)镋DTA在生物化學(xué)中通常用來作為穩(wěn)定劑，以及作為諸如磷酸酶和蛋白酶這樣的金屬酶的抑制劑。另一種重要的用于制備細(xì)胞裂解物的穩(wěn)定劑是二硫蘇糖醇(DTT)。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)DTT也可顯著降低釩酸鹽對(duì)磷酸酶的抑制作用。考慮到現(xiàn)有技術(shù)的不利因素，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可增強(qiáng)含釩化合物對(duì)具有磷酸酶活性的酶的抑制作用的替代化合物。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供可抵消EDTA和DTT對(duì)含釩化合物的負(fù)面作用的化合物。本發(fā)明人驚訝的發(fā)現(xiàn)，在存在多羥基化合物(polyol)時(shí)，釩酸鹽對(duì)磷酸酶，特別是磷酸酪氨酸特異的磷酸酶的抑制作用增強(qiáng)了。該作用甚至可在非常簡(jiǎn)單的多羥基化合物、例如甘油，以及含糖醇，例如甘露醇中觀察到。尤為更令人驚訝的是發(fā)現(xiàn)EDTA和DTT對(duì)釩酸鹽的負(fù)面作用顯著降低，或甚至完全消失。發(fā)明概述本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案是使用含(i)選自氧釩根(vanadyl)(11)、釩酸鹽(IV)、釩酸鹽(V)、低聚釩酸鹽(V)及其混合物的離子化合物，及(ii)多羥基化合物的組合物來抑制具有磷酸酶活性的酶。本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案是含(i)選自氧釩根(II)、釩酸鹽(IV)、釩酸鹽(V)、低聚釩酸鹽(V)及其混合物的離子化合物，及(ii)多輕基化合物的組合物，其特征在于多羥基化合物和含釩化合物的摩爾比等于或大于1:1。本發(fā)明的第三個(gè)實(shí)施方案是抑制具有磷酸酶活性的酶的方法，包括步驟(a)在水溶液中溶解含(i)選自氧釩根(II)、釩酸鹽(IV)、釩酸鹽(V)、低聚釩酸鹽(V)及其混合物的離子化合物及(ii)多羥基化合物的組合物，及(b)將具有磷酸酶活性的酶與步驟(a)中的溶液接觸。本發(fā)明的第四個(gè)實(shí)施方案是含包裝材料和組分的試劑盒，其中組分含有(i)選自氧釩根(II)、釩酸鹽(IV)、釩酸鹽(V)、低聚釩酸鹽(V)及其混合物的離子化合物及(ii)多羥基化合物的組合物。發(fā)明的詳細(xì)描述在本發(fā)明說明書中的特定術(shù)語具有特定含義，或是首次進(jìn)行定義。為了理解本發(fā)明，用于描述本發(fā)明的術(shù)語當(dāng)存在本領(lǐng)域接受的含義時(shí)，以該含義進(jìn)行定義，除非那些定義與以下列出的定義相矛盾或部分矛盾。在定義中存在矛盾的情況下，術(shù)語的含義首先通過以下列出的定義來進(jìn)行定義。本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書中所用術(shù)語"含有"是指"包括，但不限定于"。不定冠詞"a"與用于指示諸如抑制劑或添加劑這樣的化學(xué)化合物的術(shù)語一起使用，是用于表示"一個(gè)或多個(gè)"。"磷酸酶抑制劑"是一種有效抑制通過磷酸酶活性進(jìn)行的磷酸酯水解、從而從耙分子中釋放磷酸根離子的物質(zhì)。"水"溶液是指其中液體溶劑是至少含80°/。[v/v]水，更優(yōu)選地含95%[v/v]、更優(yōu)選地含99%[v/v]、更優(yōu)選地含100%[v/v]的溶液。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，溶液進(jìn)一步可含有一種或多種諸如鹽、緩沖液、抑制劑、添加劑及生物分子這樣的化合物，其中一種或多種化合物可溶解在液體溶劑中。如本發(fā)明所述的組合物含有選自氧釩根(II)、釩酸鹽(IV)、釩酸鹽(V)、低聚釩酸鹽(V)及其混合物的離子化合物。更優(yōu)選地，含釩離子化合物是原釩酸鹽(V)及其寡聚體。優(yōu)選的寡聚體選自二、三及四聚釩酸鹽離子。另一個(gè)特別優(yōu)選的如本發(fā)明所述的組合物中的離子化合物是過氧釩酸鹽離子。不過，最優(yōu)選的是原釩酸鹽(vo43-)。如本發(fā)明所述組合物中的"多羥基化合物"是水溶性有機(jī)化合物，其中兩個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)與碳原子共價(jià)連接。優(yōu)選地，如本發(fā)明所述的多鞋基化合物的兩個(gè)羥基基團(tuán)與兩個(gè)鄰近的碳原子連接。即，優(yōu)選的多羥基化合物含有兩個(gè)鄰近的羥基基團(tuán)。但具有多于兩個(gè)鄰近的羥基基團(tuán)的多羥基化合物是優(yōu)選的。已十分了解并且特別優(yōu)選的具有鄰近羥基基團(tuán)的多羥基化合物是糖醇。"糖醇"是碳水化合物的氫化形式，其羰基基團(tuán)(醛或酮)被還原為初級(jí)或次級(jí)羥基基團(tuán)。碳水化合物的非氫化形式也稱為"還原"糖。如本發(fā)明所述的組合物優(yōu)選地含有具有4-100個(gè)碳原子的糖醇。在這種情況下，非還原單、二、三及四糖是非常優(yōu)選的。一種非常優(yōu)選的糖醇是非還原單糖。這種糖醇是C4糖醇，優(yōu)選地選自蘇糖醇和赤蘚糖醇。同樣優(yōu)選地，糖醇是C5糖醇，優(yōu)選地選自核糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇和lyxitol。同樣優(yōu)選地，糖醇是C5脫氧糖醇，優(yōu)選地選自脫氧核糖醇和脫氧阿拉伯糖醇。同樣優(yōu)選地，糖醇是C6糖醇，優(yōu)選地選自蒜糖醇、阿卓糖醇、甘露醇、山梨糖醇、gulitol、艾杜醇、半乳糖醇和塔羅糖醇。根據(jù)本發(fā)明，脫氧糖醇包括在術(shù)語糖醇中，只要脫氧糖提供了四對(duì)或多對(duì)鄰近的羥基基團(tuán)即可。優(yōu)選的糖醇是C6脫氧糖醇，優(yōu)選地選自脫氧山梨糖醇和脫氧甘露醇。同樣優(yōu)選的糖醇是在C2位置具有其它取代基團(tuán)的糖醇，優(yōu)選的例子是N-乙酰山梨糖醇胺2，其它在C2位置具有其它取代基團(tuán)，例如N-乙酰山梨糖醇胺2。二糖和單糖均可形成糖醇；但從二糖(例如甘露醇和乳糖醇)衍生的糖醇不是完全氫化的，因?yàn)橛捎谔擒真I的原因，僅有一個(gè)醛基基團(tuán)可被還原。對(duì)三糖和更高的糖同樣如此。因此，具有多達(dá)100個(gè)C原子的非還原二糖或三糖或者具有非還原性的更高的寡糖在實(shí)施本發(fā)明時(shí)非常有利。蔗糖是十分優(yōu)選的糖醇。值得注意的是，蔗糖與大多數(shù)多糖不同，糖苷鍵是在葡萄糖和果糖的還原末端形成的，而不是在一個(gè)的還原末端和另一個(gè)的非還原末端形成的。這種作用抑制了與其它糖單元的進(jìn)一步成鍵。由于蔗糖不含有自由的異頭碳原子，因此屬于非還原糖。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的多羥基化合物與含釩離子化合物的摩爾比高于1:1。特別優(yōu)選地，摩爾比在100:1和1:1之間。更優(yōu)選地，摩爾比為70:1和5:1之間。更優(yōu)選地，摩爾比為50:1和10:1之間。以不存在含釩抑制劑的樣品中的磷酸酶活性為參照(100%),當(dāng)將如本發(fā)明所迷的選自氧釩根(II)、釩酸鹽(IV)、釩酸鹽(V)、低聚釩酸鹽(V)的離子化合物與多羥基化合物的組合物加到樣品中時(shí)，可實(shí)質(zhì)上降低所述磷酸酶活性。優(yōu)選地，所述活性降低的值為1.5%到40%、更優(yōu)選地，該值為1.5%到30%、更優(yōu)選地，該值為1.5%到20°/。、更優(yōu)選地，該值為1.5%到10%。在一方面，多羥基化合物可增強(qiáng)含釩離子化合物對(duì)磷酸酶活性的抑制作用。另一方面，多羥基化合物可降低絡(luò)合物形成試劑的負(fù)面影響。即，對(duì)磷酸酶活性的抑制不因存在針對(duì)二價(jià)或三價(jià)正電荷金屬離子的螯合劑而受到不利影響。因此，二價(jià)離子的絡(luò)合物的形成可以，例如，無副作用地抑制多種蛋白酶的非所要求的活性。所以，本發(fā)明的組合物另外含有二價(jià)或三價(jià)正電荷金屬離子的螯合劑。優(yōu)選的螯合劑選自EDTA、檸檬酸鹽、EGTA和1，10-菲咯啉。如本發(fā)明所述的組合物中螯合劑的優(yōu)選濃度是0,1mM到50mM、更優(yōu)選地是0.2mM到10mM,最優(yōu)選地是約1mM。另外，組合物中的多羥基化合物可降低還原劑對(duì)含釩離子化合物的負(fù)面影響。特別是DTT可降低原釩酸鹽對(duì)磷酸酶活性的抑制作用。但在存在多輕基化合物時(shí)，還原作用會(huì)受到逆轉(zhuǎn)。優(yōu)選的還原劑選自DTT(二硫蘇糖醇)、P-巰基乙醇、谷光甘肽和硫氧還蛋白。如本發(fā)明所述的組合物中還原劑的優(yōu)選濃度為0.1mM到30mM、更優(yōu)選地為0.2mM到10mM、最優(yōu)選地為約1mM。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，以便利形式為終端用戶提供了組合物。因此另一個(gè)實(shí)施例是含有測(cè)定量的組合物的包裝。優(yōu)選包裝材料以防止與水蒸氣的水接觸。另外，一種或多種包裝可在存在諸如硅膠或其它合適物質(zhì)這樣的干材料的情況下貯存。組合物可以是自由流動(dòng)性顆粒形式。更優(yōu)選地，組合物是片劑形式。在這種情況下，組合物可另外含有其它利于片劑形成的材料。此外，本發(fā)明的組合物可含有一種或多種其它除了含釩化合物之外的磷酸酶抑制劑。優(yōu)選地，一種或多種其它磷酸酶抑制劑是例如NaF之類的離子抑制劑。同樣優(yōu)選地，抑制劑也可以是選自斑螯素、磷酸萘(napthylphosphate)和微嚢藻素毒的低分子量化合物。同樣優(yōu)選地，抑制劑也可以是選自4丐調(diào)神經(jīng)磷酸酶自抑制肽和蛋白磷酸酶抑制劑2的peptidic化合物。因此如本發(fā)明所述的組合物適于抑制具有磷酸酶活性的酶。組合物特別適于抑制選自酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、磷酸酪氨酸磷酸酶、ATPase、磷酸絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶和二元磷酸酶這樣的磷酸酶。最優(yōu)選地，組合物可用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶，即它可以水解磷酸酪氨酸殘基的磷酸酯，而磷酸酪氨酸殘基是磷酸化多肽的一部分。含有磷酸化酪氨酸殘基、素、pErkl、pErk2和pJak2的磷酸化受體。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是抑制具有磷酸酶活性的酶的方法，包括步驟(a)在水溶液中溶解含(i)選自氧釩根(n)、釩酸鹽(IV)、釩酸鹽(V)、低聚釩酸鹽(V)及其混合物的離子化合物，及(ii)多羥基化合物的組合物，及(b)將具有磷酸酶活性的酶與步驟(a)中的溶液接觸。因此，本發(fā)明的又一實(shí)施方案是含如本發(fā)明所述的組合物及水溶液的液體組合物。優(yōu)選地，液體組合物的pH值是其中磷酸酶(一種或多種靶磷酸酶)具有活性的pH值。pH優(yōu)選地是pH5.5-pH8.5,更優(yōu)選地是pH6.7-pH8.0。提供以下實(shí)施例、附圖和序列列表用于理解本發(fā)明，本發(fā)明的請(qǐng)求保護(hù)的范圍于后附的權(quán)利要求所示。應(yīng)理解到，在不偏離本發(fā)明的主旨的情況下可進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?。圖l在存在和不存在多輕基化合物時(shí)，原釩酸鹽對(duì)磷酸酪氨酸特異的蛋白磷酸酶的抑制。實(shí)驗(yàn)原理見實(shí)施例l?？v坐標(biāo)表示殘余的磷酸酶活性。線條表示由以下組合物獲得的結(jié)果(l)不加抑制劑(對(duì)照，100%殘余活性)；(2)1mM原釩酸鹽；(3)2mM原釩酸鹽；(4)1mM原釩酸鹽，27mM甘露醇；(5)1mM原釩酸鹽，54mM甘油。圖2在存在和不存在多羥基化合物及存在EDTA和DTT時(shí)，原釩酸鹽對(duì)磷酸酪氨酸特異的蛋白磷酸酶的抑制。實(shí)驗(yàn)原理見實(shí)施例2?？v坐標(biāo)表示殘余的磷酸酶活性。線條表示由以下組合物獲得的結(jié)果(l)不加抑制劑(對(duì)照，100%殘余活性)；(2)lmM原釩酸鹽；(3)2mM原釩酸鹽；(4)1mM原釩酸鹽，27mM甘露醇；(5)1mM原釩酸鹽，54mM甘油。圖3在存在和不存在多羥基化合物及存在EDTA、有或無DTT時(shí)，原釩酸鹽對(duì)磷酸酪氨酸特異的蛋白磷酸酶的抑制。實(shí)驗(yàn)原理見實(shí)施例3?？v坐標(biāo)表示殘余的磷酸酶活性。線條表示由以下組合物獲得的結(jié)果(1)lmM原釩酸鹽，含EDTA的Hepes緩沖液；(2)1mM原釩酸鹽，含EDTA和DTT的Hepes緩沖液；(3)lmM原釩酸鹽，含EDTA的Hepes緩沖液，存在27mM甘露醇；(4)1mM原釩酸鹽，含EDTA和DTT的Hepes緩沖液，存在27mM甘露醇；(5)1mM原釩酸鹽，含EDTA的Hepes緩沖液，存在54mM甘油；(6)1mM原釩酸鹽，含EDTA和DTT的Hepes緩沖液，存在54mM甘油。圖4在存在和不存在甘露醇時(shí)，原釩酸鹽在昆蟲細(xì)胞裂解物中對(duì)磷酸酶活性的抑制。實(shí)驗(yàn)原理見實(shí)施例5?？v坐標(biāo)表示殘余的磷酸酶活性。線條表示由以下組合物獲得的結(jié)果(l)不加抑制劑(對(duì)照，100%殘余活性)；(2)lmM原釩酸鹽；(3)1mM原釩酸鹽，27mM甘露醇。圖5在存在和不存在甘露醇時(shí)，原釩酸鹽在COS7細(xì)胞裂解物中對(duì)磷酸酶活性的抑制。實(shí)驗(yàn)原理見實(shí)施例6。縱坐標(biāo)表示殘余的磷酸酶活性。線條表示由以下組合物獲得的結(jié)果(l)不加抑制劑(對(duì)照，100%殘余活性)；(2)1mM原釩酸鹽；(3)1mM原釩酸鹽，27mM甘露醇。實(shí)施例l10磷酸酪氨酸特異的蛋白磷酸酶的抑制作用將重組產(chǎn)生的磷酸酪氨酸特異的蛋白磷酸酶(人T細(xì)胞；CalbiochemNo.Cat539732)儲(chǔ)液在含0.1mMCaCl"50mMTrispH7.0的緩沖液中按1:200稀釋。在單獨(dú)的反應(yīng)管中制備以下混合物(a-e):36pi稀釋的酶溶液與4pi的(a)水(作為100%對(duì)照)，或(b)10mM原釩酸鹽；(c)20mM原釩酸鹽(d)10mM原釩酸鹽，270mM甘露醇；(e)10mM原釩酸鹽，540mM甘油中的一種溶液。將各混合物在室溫(RT)溫育15分鐘。然后，從每種混合物中轉(zhuǎn)移10Ml的一小份到微孔板中。向每個(gè)孔中加入5^含磷酸酪氨酸殘基的待測(cè)肽(肽序列為R-R-L-I-E-D-A-E-pY-A-A-R-G;1mM,溶在水中)溶液及10pi含0.1mMCaCl2、50mMTdspH7.0的緩沖液，在37°C溫育30分鐘。通過加入100pi另外含有0.034%[w/v]孔雀綠、10mM鉬酸鈉及3.40/。[v/v]乙醇的1MHC1溶液，來對(duì)由磷酸酯鍵的酶水解所得到的游離磷酸鹽進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。檢測(cè)反應(yīng)在室溫進(jìn)行10分鐘，其間持續(xù)振蕩微孔板。通過測(cè)定每個(gè)反應(yīng)孔的消光(620nm)來檢測(cè)磷酸的相對(duì)濃度。實(shí)施例2在存在EDTA和DTT時(shí)對(duì)磷酸酪氨酸特異的蛋白磷酸酶的抑制作用將重組產(chǎn)生的磷酸酪氨酸特異的蛋白磷酸酶(人T細(xì)胞；CalbiochenvNo.Cat539732)儲(chǔ)液在含25mMHepes、50mMNaCl、2.5mMEDTA、5mMDTT、pH7.2的緩沖液中按1:200稀釋。在單獨(dú)的反應(yīng)管中制備以下混合物(a-e):36pl稀釋酶溶液與4pl(a)水(作為100%對(duì)照)，或(b)10mM原釩酸鹽；(c)20mM原釩酸鹽(d)10mM原釩酸鹽，270mM甘露醇；(e)10mM原釩酸鹽，540mM甘油中的一種溶液。將混合物在室溫(RT)溫育15分鐘。然后，從每種混合物中轉(zhuǎn)移10pl的一小份到微孔板中。向每個(gè)孔中加入5pl含磷酸酪氨酸殘基的待測(cè)肽(肽序列為R-R-L-I-E-D-A-E-pY-A-A-R-G;1mM,溶在水中)溶液及10pl含25mMHepes、50mMNaCl、2.5mMEDTA、5mMDTT、pH7.2的緩沖液，在37。C溫育30分鐘。通過加入100ilU另外含有0.034%[w/v〗孔雀綠、10mM鉬酸鈉及3.4Q/。[v/v]乙醇的1MHC1溶液，來對(duì)由磷酸酯鍵的酶水解所得到的游離磷酸鹽進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。檢測(cè)反應(yīng)在室溫進(jìn)行IO分鐘，其間持續(xù)振蕩微孔板。通過測(cè)定每個(gè)反應(yīng)孔的消光(620nm)來檢測(cè)磷酸的相對(duì)濃度。實(shí)施例3在存在EDTA、有或無DTT時(shí)對(duì)磷酸酪氨酸特異的蛋白磷酸酶的抑制作用將重組產(chǎn)生的磷酸酪氨酸特異的蛋白磷酸酶(人T細(xì)胞；CalbiochemNo.Cat539732)儲(chǔ)液在含25mMHepes、50mMNaCl、2.5mMEDTA、5mMDTT、pH7.2的緩沖液(酶溶液(i))中或在具有相同組分，但不含DTT的緩沖液(酶溶液(ii))中按1:200稀釋。在單獨(dú)的反應(yīng)管中制備以下混合物(a-f):36pl稀釋酶溶液(i)或(ii)以及4pl以下某種溶液(a、d)10mM原釩酸鹽；(b、e)10mM原釩酸鹽，270mM甘露醇；(c、f)10mM原釩酸鹽，540mM甘油。將混合物在室溫(RT)溫育15分鐘。然后，從每種混合物中轉(zhuǎn)移10pl到微孔板中。向每個(gè)孔中加入5pl含磷酸酪氨酸殘基的待測(cè)肽(肽序列為R-R-L-I-E-D-A-E-pY-A-A-R-G;1mM，溶在水中)溶液及10…含25mMHepes、50mMNaCl、2.5mMEDTA、5mMDTT、pH7.2的緩沖液(與酶溶液(i)反應(yīng))或10pl含25mMHepes、50mMNaCl、2.5mMEDTA、pH7.2的緩沖液(與酶溶液(ii)反應(yīng))，在37°C溫育30分鐘。通過加入100^1另外含有0.034%[w/v]孔雀綠、10mM鉬酸鈉及3.4。/o[v/v〗乙醇的1MHC1溶液，來對(duì)由磷酸酯鍵的酶水解所得到的游離磷酸鹽進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。檢測(cè)反應(yīng)在室溫進(jìn)行10分鐘，其間持續(xù)振蕩微孔板。通過測(cè)定每個(gè)反應(yīng)孔的消光(620nm)來檢測(cè)磷酸的相對(duì)濃度。實(shí)施例4原釩酸鹽對(duì)磷酸酪氨酸特異的蛋白磷酸酶的抑制作用表l磷酸酶活性如下所示。表格中數(shù)據(jù)參考圖l-3給出的圖示,200810003838緩沖液活性.圖l:l)無抑制劑50mMTris;0,1mMCaCl2pH7,0100%2)Na3V041mM50mMTris;0,1mMCaCl2pH7,0I6，6%3)Na.，V042mM50mMTris;O,〗mMCaCl2pH7，015,7%4)Na3V041mM十甘露醇27mM50mMTris;0,1mMCaCl2pH7,08,5%5)Na3V041mM+甘油54mM50mMTris;0,1mMCaCl2pH7,09,7%圖2:1)無抑制劑25Hepes;50mMNaCl;2,5mMEDTA;5mMDTTpH7,2100%2)Na3V041mM25mMHepes;50mMNaCl;2,5mMEDTA;5mMDTTpH7>287,7%3)Na3V042mM25mMHepes;50mMNaCl;2,5mMEDTA;5mMDTTpH7'258>0%4)Na3V041mM+甘露醇27mM25mMHepes;50mMNaCl;2,5mMEDTA;5mMDTTpH7,2I2'4%5)Na3V041mM+甘油54mM25mMHepes;50mMNaCl;2,5mMEDTA;5mMDTTpH7,29'3%圖3:1)Na3V041mM25mMHepes;50mMNaCl;2,5mMEDTA;pH7,229,5%2)Na3V041mM25mMHepes;50mMNaCl;2,5mMEDTA;5mMDTTpH7,246,3%3)Na3V041mM+甘露醇27mM25mMHepes;50mMNaCl;2,5mMEDTA;pH7,214,1%4)Na3V041mM+甘露醇27mM25mMHepes;50mMNaCl;2,5mMEDTA;5mMDTTpH7,25,8%5)Na3V041mM十甘油54mM25mMHepes;50mMNaCl;2'5mMEDTA;pH7,214,9%6)Na3V041mM+甘油54mM25mMHepes;50mMNaCl;2,5mMEDTA;5mMDTTpH7'27,3%13收集270mg昆蟲細(xì)胞(SF9)，用50mMHepes、50mMNaClpH7.0洗滌3次，并用2.5mlM-Per(Pierce)裂解10分鐘。離心后，收集裂解物上清。檢測(cè)磷酸酪氨酸活性向45^裂解物中加入5^1水或原釩酸鹽(10mM)或原釩酸鹽/甘露醇(10mM/270mM)，室溫溫育10分鐘然后，從每種混合物中轉(zhuǎn)移10…到微孔板中。向每個(gè)孔中加入5pl待測(cè)肽(R-R-L-I-E-D-A-E-pY-A-A-R-G;1mM，溶在水中)及10pl含0.1mMCaCl2、50mMTrispH7.0的緩沖液，在37。C溫育30分鐘。通過加入100pl另外含有0.034%[w/v]孔雀綠、10mM鉬酸鈉及3.4。/0[v/v]乙醇的1MHC1溶液，來對(duì)由酶水解所得到的游離磷酸鹽進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。檢測(cè)反應(yīng)在室溫進(jìn)行10分鐘，其間持續(xù)振蕩微孔板。通過測(cè)定每個(gè)反應(yīng)孔的消光(620nm)來檢測(cè)磷酸的相對(duì)濃度。表2在水溶性緩沖液中含有原釩酸鹽和其它化合物的組合物中殘余的磷酸酶活性如下所示。表格中數(shù)據(jù)參考圖4給出的圖示。磷酸酶活性無抑制劑(水對(duì)照)100%1mM原釩酸鹽14%1mM原釩酸鹽/27mM甘露醇2%實(shí)施例6磷酸酶在C0S7細(xì)胞裂解物中的抑制作用收集C0S7細(xì)胞，用50mMH叩es、50mMNaClpH7.0洗滌3次，并用5mlM-Per(Pierce)裂解IO分鐘。離心后，收集裂解物上清。檢測(cè)磷酸酪氨酸活性向45^1裂解物(1+4,含M-Per(Pierce))中加入5|li1水或原釩酸鹽(10mM)或原釩酸鹽/甘露醇(10mM/270mM),室溫溫育10分鐘。然后，從每種混合物中轉(zhuǎn)移10^到微孔板中。向每個(gè)孔中加入5待測(cè)肽(R-R-L-I-E-D-A-E-pY-A-A-R-G;1mM，溶在水中)及10pl含0.1mMCaCl2、50mMTrispH7.0的緩沖液，在37。C溫育30分鐘。通過加入100(itl另外含有0.034%[w/v]孔雀綠、10mM鉬酸鈉及3.40/。[v/v]乙醇的1MHC1溶液，來對(duì)由酶水解所得到的游離磷酸鹽進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。檢測(cè)反應(yīng)在室溫進(jìn)行10分鐘，其間持續(xù)振蕩微孔板。通過測(cè)定每個(gè)反應(yīng)孔的消光(620nm)來檢測(cè)磷酸的相對(duì)濃度。表3在水溶性緩沖液中含有原釩酸鹽和其它化合物的組合物中殘余的磷酸酶活性如下所示。表格中數(shù)椐參考圖5給出的圖示。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>序列表<110>RocheDiagnosticsGmbHF.Hoffmann-LaRocheAG<120>含釩磷酸酶抑制劑的增強(qiáng)作用<130>24107<150>EP07001593.8<151〉2007-01-25<160〉1<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>14<212>PRT<213〉人工<220><223>蛋白磷酸酶底物<220〉<221>MISCFEATURE<222>(IO)..(IO)<223>在底物肽中，酪氨酸殘基是磷酸化的<400>1ArgArgLeulieGluAspAlaGluProTyrAlaAlaArgGly1510權(quán)利要求1.含水溶劑、具有磷酸酶活性的酶、原釩酸鹽、甘露醇和二硫蘇糖醇的液體組合物，其特征在于甘露醇的濃度在1mM和100mM之間，甘露醇和原釩酸鹽的摩爾比等于或大于1∶1。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于原釩酸鹽的濃度在0.1mM到10mM之間。3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于原釩酸鹽的濃度在0.5mM到5mM之間。4.如權(quán)利要求到3任何一項(xiàng)中所述的組合物，其特征在于所述組合物還含有二價(jià)或三價(jià)正電荷金屬離子的螯合劑。5.糖醇在增強(qiáng)選自釩酸鹽(V)、低聚釩酸鹽(V)及其混合物的離子化合物對(duì)具有磷酸酶活性的酶的抑制效果方面的體外用途，該酶可水解溶于具有中性pH并且含有Ca"離子濃度在0.7mM和1.2mM之間的緩沖水溶液的、序列為SEQIDNO:l的肽中磷酸酪氨酸殘基的磷酸酯鍵。6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于磷酸酶的活性降低1.5%到40%的值之間。7.—種體外增強(qiáng)選自釩酸鹽(V)、低聚釩酸鹽(V)及其混合物的離子化合物對(duì)具有磷酸酶活性的酶的抑制效果的方法，所述的酶能水解溶于具有中性pH并且含有0.7mM-1.2mM濃度的Ca"離子的緩沖水溶液的、序列如SEQIDNO:l所示肽中的、磷酸酪氨酸殘基的磷酸酯鍵，該方法包括下迷步驟(a)在水溶劑中溶解含(i)離子化合物和(ii)糖醇的組合物，其中糖醇和離子化合物的摩爾比等于或大于1:1,及(b)將具有磷酸酶活性的酶與步驟(a)的溶液接觸。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于溶液中糖醇的濃度在1mM到100mM之間。9.如權(quán)利要求7或8中所述的方法，其特征在于溶液中原釩酸鹽的濃度在0.1mM到10mM之間。10.如權(quán)利要求7到9任何一項(xiàng)中所述的方法，其特征在于離子化合物和糖醇以干物質(zhì)形式加入到含具有磷酸酶活性的酶的水性樣品中。11.一種試劑盒，其包括包裝材料及含(i)選自釩酸鹽(V)、低聚釩酸鹽(V)及其混合物和(ii)糖醇的組合物，其中糖醇和離子化合物的摩爾比等于大于1:1。12.如權(quán)利要求11所迷的試劑盒，其特征在于組合物還含有二價(jià)或三價(jià)正電荷金屬離子的還原劑和/或螯合劑。13.如權(quán)利要求11和12任何一項(xiàng)中所述的試劑盒，其特征在于所述組合物作為千物質(zhì)以片劑形式提供。全文摘要本發(fā)明涉及包括含釩磷酸酶抑制劑和多羥基化合物的組合物。在存在多羥基化合物時(shí)，即使存在螯合劑或還原劑，抑制劑的作用也得以增強(qiáng)。本發(fā)明也涉及發(fā)明的組合物在抑制磷酸酶方面的用途，以及含該組合物的試劑盒。文檔編號(hào)C12N9/16GK101492659SQ200810003838公開日2009年7月29日申請(qǐng)日期2008年1月24日優(yōu)先權(quán)日2007年1月25日發(fā)明者D·邁爾,E·弗恩霍爾茨申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司