本發(fā)明涉及實驗用具領(lǐng)域，具體地說，涉及一種顯微觀察的細(xì)胞切片。

背景技術(shù)：

多年生黑麥草是一種重要的冷季型草坪草種，原產(chǎn)于歐洲、溫帶亞洲和北非。黑麥草適宜無嚴(yán)冬酷夏的涼爽環(huán)境。作為草坪建植的重要草種之一，多年生黑麥草成坪快，耐低修剪，能夠形成致密的草皮，常作為冷季型混播草坪先鋒草種建植足球場草坪，也可以用作補播和交播材料。同時，葉片油亮，色澤墨綠的特點，也使其廣泛應(yīng)用于景觀草坪、運動場草坪以及高爾夫球場球道草坪。由于多年生黑麥草應(yīng)用廣泛，葉片形態(tài)與生理特性具有相關(guān)性，因此研究人員需要對其葉片表皮細(xì)胞進(jìn)行觀察。

葉片表皮細(xì)胞特征觀察包括細(xì)胞數(shù)量、大小、形態(tài)、細(xì)胞分類(如：長細(xì)胞、短細(xì)胞)、表皮毛數(shù)量、大小、形態(tài)以及氣孔數(shù)量、大小、形態(tài)等特征的觀察。不同品種多年生黑麥草葉片表皮細(xì)胞形態(tài)存在一定的差異，而這種差異有可能造成不同品種多年生黑麥草間的生理抗性的差異。因此，觀察和研究多年生黑麥草表皮細(xì)胞具有重要的意義。

有大量研究人員通過直接刮取草坪草葉片表面制作徒手切片，觀察草坪草葉片表皮細(xì)胞。但這種方法并不適用于多年生黑麥草，多年生黑麥草葉片含水量較多，表皮細(xì)胞排列緊密，通過直接刮表皮無法獲得完整表皮細(xì)胞，同時，會存留大量葉綠素，影響視野清晰度及表皮細(xì)胞的完整性。

多年生黑麥草葉片表面含有蠟質(zhì)，表皮毛等附屬器官，保護(hù)葉片表皮，因而使得葉片表皮切片的制作具有困難。透明膠帶法和指甲油印跡法都是通過利用透明膠帶和指甲油對葉片表面的粘合性撕取葉片表皮細(xì)胞，制成裝片進(jìn)行顯微觀察。但這兩種方法缺點明顯，首先，多年生黑麥草葉片表皮蠟質(zhì)較多，使得透明膠帶和指甲油對葉片表面的粘合性不強，無法獲取多年生黑麥草完整的表皮細(xì)胞；其次，撕取部分表皮細(xì)胞后，會將大量的葉綠素一同撕取下來，造成觀察過程中的視野阻礙，影響表皮細(xì)胞觀察清晰度。

次氯酸離析葉片表皮細(xì)胞的方法是通過離析法，離析葉片表皮細(xì)胞與葉肉，撕取表皮細(xì)胞后，進(jìn)行染色，制成裝片觀察。此種方法的缺點為，使用次氯酸鈉會對多年生黑麥草葉片表皮細(xì)胞造成不可逆的損傷，破壞程度隨次氯酸鈉濃度的增加而加深，但離析效果同樣因次氯酸鈉濃度的增加效果更加顯著，這便造成了互相矛盾的結(jié)果。

因此，亟需開發(fā)一種適用于多年生黑麥草的葉片表皮細(xì)胞徒手切片制作方法，在對表皮細(xì)胞傷害程度盡可能小的基礎(chǔ)上，快速獲得完整、且視野內(nèi)清晰度高的表皮細(xì)胞徒手切片。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種多年生黑麥草表皮細(xì)胞切片的制備方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明首先提供一種多年生黑麥草表皮細(xì)胞切片的制備方法，包括如下步驟：

(1)選取多年生黑麥草葉片，投入fpa固定液中固定至少24小時，取出進(jìn)行徒手切片，獲得待觀察多年生黑麥草葉片，

(2)沖洗葉片表面殘留的固定液，刮去葉片一側(cè)表皮及部分葉肉后，投入濃度為0.9～1.1％的混合酶液中，在26～28℃條件下解離1～3h后，清洗去除混合酶液；

具體而言，若欲觀察葉片上表皮，則刮去葉片下表皮及部分葉肉，若欲觀察葉片下表皮，則刮去葉片上表皮及部分葉肉；

(3)刮去殘存組織，直至葉片表皮呈現(xiàn)透明狀，即得多年生黑麥草表皮細(xì)胞切片；

其中，所述混合酶液中含有等質(zhì)量比的果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶。即果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶按1:1:1的質(zhì)量比組成混和酶。

作為優(yōu)選，所述混合酶液中混合酶的濃度為1％，溶劑為ph5.7的pbs緩沖液。所述濃度為1％理解為每100ml的混合酶液中含有1mg的混和酶，前述濃度為0.9～1.1％的混合酶液理解為每100ml的混合酶液中含有0.9～1.1mg的混和酶。由于本發(fā)明通過試驗發(fā)現(xiàn)了最佳的混和酶濃度為1％，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行些許微量的調(diào)整(濃度為0.9～1.1％)也同樣能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果。

所述fpa固定液、pbs緩沖液、果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶為本領(lǐng)域常規(guī)使用試劑與酶類，均屬于市售可得的商品，本發(fā)明對此不另作限定。

作為優(yōu)選，所述步驟(2)中，在26～28℃水浴環(huán)境中解離，水浴環(huán)境將提供更佳良好的恒溫效果，利于解離。

更為優(yōu)選，在27℃水浴環(huán)境中解離2h，能夠得到最佳的解離效果。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中，投入fpa固定液中固定24～48小時固定效果較佳。

按照上述方法制備得到的多年生黑麥草表皮細(xì)胞切片，可以在顯微鏡下觀察到清晰的氣孔、表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、表皮毛等附屬器官。

基于此，由上述方法制備得到的多年生黑麥草表皮細(xì)胞切片也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供一種多年生黑麥草表皮細(xì)胞切片的制備方法，通過該方法可以獲得完整且視野清晰的多年生黑麥草葉片表皮細(xì)胞切片，可以在顯微鏡下觀察到清晰的氣孔、表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、表皮毛等附屬器官。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實驗例1中實施例1所得切片的顯微觀察圖。

圖2為本發(fā)明對比例1中試驗組2所得切片的顯微觀察圖。

圖3為本發(fā)明對比例1中試驗組3所得切片的顯微觀察圖。

圖4為本發(fā)明對比例1中試驗組4所得切片的顯微觀察圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1

本實施例以制備多年生黑麥草上表皮細(xì)胞切片為例，用于說明本發(fā)明所述的多年生黑麥草表皮細(xì)胞切片的制備方法。

具體操作如下：

1、制備混合酶液：

將果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶按照1:1:1的比例混合，溶于ph5.7的pbs緩沖液中，制備得到濃度為1％混合酶液(每300ml混合酶液中，含有1mg果膠酶、1mg纖維素酶和1mg半纖維素酶)。

2、制備多年生黑麥草上表皮細(xì)胞切片：

取多年生黑麥草葉片投入fpa固定液中，固定24小時后，取出進(jìn)行徒手切片的制作。用蒸餾水沖洗數(shù)次以清除葉片表面的固定液。用刀片輕輕刮去葉片背面部分葉表皮及部分葉肉后，

投入步驟1所得的混合酶液(1/3果膠酶+1/3纖維素酶+1/3半纖維素酶)中，在27℃水浴環(huán)境中解離2h后取出。將解離后的葉片組織段浸入盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中進(jìn)行清洗，去除混合酶液。將葉片組織段平鋪于載玻片上，輕輕刮去葉片背面殘存的葉肉及其他組織，反復(fù)進(jìn)行此過程，直至葉片表皮呈現(xiàn)透明狀，即得多年生黑麥草上表皮細(xì)胞切片。

實驗例1

將實施例1制備的多年生黑麥草表皮細(xì)胞切片置于10×20倍的奧林巴斯顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，其中的表皮毛、葉片氣孔、葉片表皮細(xì)胞、運動細(xì)胞清晰可見。

對比例1

本對比例用于探討相同酶解時間條件下，相同濃度不同酶液對同等操作下制備切片的影響。

試驗組1：同實施例1；

試驗組2：與實施例1的區(qū)別在于1％混合酶液由1/2果膠酶和1/2纖維素酶組成；

試驗組3：與實施例1的區(qū)別在于1％混合酶液由1/3果膠酶和2/3纖維素酶組成；

試驗組4：與實施例1的區(qū)別在于1％混合酶液由2/3果膠酶和1/3纖維素酶組成。

在顯微鏡下觀察試驗組1～4制備得到的切片，結(jié)果分別如圖1～4所示，由圖可知，當(dāng)混合酶液由纖維素酶、果膠酶和半纖維素酶組成時，切片中表皮毛、葉片氣孔、葉片表皮細(xì)胞、運動細(xì)胞等結(jié)構(gòu)相對其他處理得到的切片更為清晰，具有最佳的觀察效果。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。