本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種乙肝病毒的PRINS檢測方法及其引物和檢測試劑盒。
背景技術：
乙肝病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是一種重要的傳染性疾病，可以經過血液等各種體液傳播，引起急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等，嚴重威脅世界人類的身體健康和生命安全。其中，我國又是乙肝病毒的高發(fā)地區(qū)，據(jù)估計，約有60%的人曾經感染乙肝病毒，攜帶者高達10%，已感染人群中至少15～25% 最終死于HBV相關的肝病，大部分為肝細胞癌口。因此，準確、迅速診斷對乙肝的治療和預防顯得極為重要。
當前，對HBV的檢測手段主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和聚合酶鏈式反應(PCR)。其中ELISA方案的依據(jù)是根據(jù)抗原抗體反應來檢測乙肝病毒的血清標志物(HBV—M) 即HBsAg、HBeAg、HBcAb、HBsAb、HBeAb的濃度，因此該方案反映的主要是人體對HBV感染的免疫狀態(tài)，但不能直接反映HBV在患者體內的復制情況，更不能作為判斷患者是否具有傳染性的直接證據(jù)。PCR方案直接擴增并檢測血清中HBV的DNA，因此能夠反應出在體內的真實擴增和是否有傳染性等情況。由此結果判斷體內HBV是否正在復制、復制程度、或者經治療后HBV是否被清除等方面均有重要作用，并為臨床觀察藥物療效、病情轉化等提供依據(jù)。
但是，在血清樣品內本身的游離DNA很少，在抽提HBV DNA時，容易導致DNA的丟失從而導致檢測結果中的HBV DNA含量比實際值降低甚至由于丟失而導致假陰性結果?；赒-PCR方案的檢測體系，進口試劑盒靈敏度僅僅在300拷貝/ml，其靈敏度不滿足臨床檢驗的需要。
技術實現(xiàn)要素：
因此，針對目前HBV檢測方法靈敏度不高的問題，本發(fā)明提供了一種新的乙肝病毒的PRINS檢測方法及其引物和乙肝病毒PRINS檢測試劑盒。 為解決上述技術問題，本發(fā)明采取的技術方案：一種乙肝病毒的PRINS檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟S1、采集血樣，將血樣離心后的血清涂布于載玻片，利用固定液將載玻片中的血清固定5-110分鐘，固定后用PBS溶液浸泡洗滌，洗滌后的載玻片利用質量百分比0.001-0.25%的蛋白酶K孵育，然后用變性緩沖液處理5-15分鐘，處理后的載玻片在90℃-98℃下熱處理，使蛋白酶K滅活，然后用PBS溶液浸泡洗滌該載玻片；
步驟S2、將步驟S1處理后的載玻片上加入第一PRINS反應液，在載玻片上放置蓋玻片，靜置1-90分鐘，然后用洗滌液洗滌；
步驟S3、在步驟S2處理后的載玻片上加入第二PRINS反應液，在載玻片上放置蓋玻片，進行原位擴增標記反應，將反應后的載玻片放入終止反應液中浸泡，使原位擴增標記反應終止，然后將載玻片置于洗滌液中洗滌；
步驟S4、將步驟S3處理后的載玻片置于0.1-2mg/mL的碘化丙啶溶液中孵育，孵育后用水清洗，加蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。
其中，步驟S1中所述的固定液為137mmol/L 的NaCl，2.7mmol/L 的KCl，10mmol/L 的Na2HPO4， 2 mmol/L 的KH2PO4 ，4%的多聚甲醛和0.2 mol/L的戊二醛組成的溶液，pH=7.2～7.4，所述的百分數(shù)為質量百分數(shù)。
其中，步驟S1中所述的PBS溶液為137mmol/L 的NaCl，2.7mmol/L的KCl，10mmol/L的Na2HPO4， 2mmol/L的KH2PO4組成的溶液，pH7.2～7.4 。
其中，步驟S1中所述的變性緩沖液為20mmol/L的甲酰胺，3mmol/L的NaCl和0.3mmol/L的檸檬酸鈉組成的溶液。
其中，步驟S2中所述的第一PRINS反應液為：1-100m mol/L TrisCl（pH8.8），5-100 m mol/L KCl，1-5 m mol/L MgCl2，0.01-1% 牛血清白蛋白，0.5-2.5 mol/L甘油，0.5-3mol/L 甜菜堿，0.1-3mol/L海藻糖，0.05-0.5 mmol/L ddATP、0.05-0.5 mmol/L ddCTP、0.05-0.5 mmol/L ddGTP和0.05-0.5 mmol/L ddTTP，以及0.5-5U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比為質量百分比。
其中，步驟S3中所述的第二PRINS反應液為：10nM-100μM的上游檢測引物，10nM-100μM的下游檢測引物，50nM-1mM的封閉引物，1-100m mol/L TrisCl（pH8.8），5-100 m mol/L KCl，1-5 m mol/L MgCl2，0.01-1% 牛血清白蛋白，0.5-2.5 mol/L甘油，0.5-3mol/L 甜菜堿，0.1-3mol/L海藻糖，0.05-0.5 mmol/L dATP、0.05-0.5 mmol/L dCTP、0.05-0.5 mmol/L dGTP，0.01-0.5 mmol/L dTTP，0.01-0.5 mmol/L 熒光素標記的dUTP，以及0.5-5U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比為質量百分比。
其中，所述的上游檢測引物為SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，所述的下游檢測引物為SEQ ID No:7所示的核苷酸序列，所述的封閉引物為SEQ ID No:2，SEQ ID No:3，SEQ ID No:4，SEQ ID No:5，SEQ ID No:6，SEQ ID No:8，SEQ ID No:9，SEQ ID No:10，SEQ ID No:11和SEQ ID No:12中所示的一種或多種核苷酸序列的組合。
優(yōu)選的是，所述的上游檢測引物為SEQ ID No:13所示的核苷酸序列，所述的下游檢測引物為SEQ ID No:19所示的核苷酸序列，所述的封閉引物為SEQ ID No:14，SEQ ID No:15，SEQ ID No:16，SEQ ID No:17，SEQ ID No:18，SEQ ID No:20，SEQ ID No:21，SEQ ID No:22，SEQ ID No:23和SEQ ID No:24中所示的一種或多種核苷酸序列的組合。
優(yōu)選的是，所述的上游檢測引物為SEQ ID No:25所示的核苷酸序列，所述的下游檢測引物為SEQ ID No:31所示的核苷酸序列，所述的封閉引物為SEQ ID No:26，SEQ ID No:27，SEQ ID No:28，SEQ ID No:29，SEQ ID No:30，SEQ ID No:32，SEQ ID No:33，SEQ ID No:34，SEQ ID No:35和SEQ ID No:36中所示的一種或多種核苷酸序列的組合。
優(yōu)選的是，所述的封閉引物為引物3’端堿基被氨基、磷酸或者雙脫氧封閉，使其喪失進行PCR反應的能力。
其中，步驟S3中所述的原位擴增標記反應包括以下步驟：（1）90-98°C預變性0.5-10分鐘；（2）90-96°C變性1-90秒；（3）45-68°C退火0.5-3分鐘；（4）55-73°C延伸1-5分鐘，（2）-（4）循環(huán)1-38次；（5）60-73℃延伸1-5分鐘。
其中，步驟S3中所述的終止反應液為 0.15-0.75 mol/L NaCl和0.01-0.1 mol/L EDTA 組成的溶液，pH=6.8-8.0。
一種檢測乙肝病毒的特異性引物，其特征在于，所述的特異性引物由上游檢測引物，下游檢測引物和封閉引物組成。
其中，所述的上游檢測引物為SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，所述的下游檢測引物為SEQ ID No:7所示的核苷酸序列，所述的封閉引物為SEQ ID No:2，SEQ ID No:3，SEQ ID No:4，SEQ ID No:5，SEQ ID No:6，SEQ ID No:8，SEQ ID No:9，SEQ ID No:10，SEQ ID No:11和SEQ ID No:12中所示的一種或多種核苷酸序列的組合。
優(yōu)選的是，所述的上游檢測引物為SEQ ID No:13所示的核苷酸序列，所述的下游檢測引物為SEQ ID No:19所示的核苷酸序列，所述的封閉引物為SEQ ID No:14，SEQ ID No:15，SEQ ID No:16，SEQ ID No:17，SEQ ID No:18，SEQ ID No:20，SEQ ID No:21，SEQ ID No:22，SEQ ID No:23和SEQ ID No:24中所示的一種或多種核苷酸序列的組合。
優(yōu)選的是，所述的上游檢測引物為SEQ ID No:25所示的核苷酸序列，所述的下游檢測引物為SEQ ID No:31所示的核苷酸序列，所述的封閉引物為SEQ ID No:26，SEQ ID No:27，SEQ ID No:28，SEQ ID No:29，SEQ ID No:30，SEQ ID No:32，SEQ ID No:33，SEQ ID No:34，SEQ ID No:35和SEQ ID No:36中所示的一種或多種核苷酸序列的組合。
一種乙肝病毒的PRINS檢測試劑盒，其特征在于，所述PRINS檢測試劑盒包括載玻片、蓋玻片、固定液、蛋白酶K、第一PRINS反應液、第二PRINS反應液、陰性對照和陽性對照。
其中，所述的固定液為137mmol/L 的NaCl，2.7mmol/L 的KCl，10mmol/L 的Na2HPO4， 2 mmol/L 的KH2PO4 ，4%的多聚甲醛和0.2 mol/L的戊二醛組成的溶液，pH=7.2～7.4，所述的百分數(shù)為質量百分數(shù)。
其中，所述的第一PRINS反應液為：1-100m mol/L TrisCl（pH8.8），5-100 m mol/L KCl，1-5 m mol/L MgCl2，0.01-1% 牛血清白蛋白，0.5-2.5 mol/L甘油，0.5-3mol/L 甜菜堿，0.1-3mol/L海藻糖，0.05-0.5 mmol/L ddATP、0.05-0.5 mmol/L ddCTP、0.05-0.5 mmol/L ddGTP和0.05-0.5 mmol/L ddTTP，以及0.5-5U的Taq DNA 聚合酶；所述的第二PRINS反應液為：10nM-100μM的上游檢測引物，10nM-100μM的下游檢測引物，50nM-1mM的封閉引物，1-100m mol/L TrisCl（pH8.8），5-100 m mol/L KCl，1-5 m mol/L MgCl2，0.01-1% 牛血清白蛋白，0.5-2.5 mol/L甘油，0.5-3mol/L 甜菜堿，0.1-3mol/L海藻糖，0.05-0.5 mmol/L dATP、0.05-0.5 mmol/L dCTP、0.05-0.5 mmol/L dGTP，0.01-0.5 mmol/L dTTP，0.01-0.5 mmol/L 熒光素標記的dUTP，以及0.5-5U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比為質量百分比。
其中，所述的上游檢測引物為SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，所述的下游檢測引物為SEQ ID No:7所示的核苷酸序列，所述的封閉引物為SEQ ID No:2，SEQ ID No:3，SEQ ID No:4，SEQ ID No:5，SEQ ID No:6，SEQ ID No:8，SEQ ID No:9，SEQ ID No:10，SEQ ID No:11和SEQ ID No:12中所示的一種或多種核苷酸序列的組合。
優(yōu)選的是，所述的上游檢測引物為SEQ ID No:13所示的核苷酸序列，所述的下游檢測引物為SEQ ID No:19所示的核苷酸序列，所述的封閉引物為SEQ ID No:14，SEQ ID No:15，SEQ ID No:16，SEQ ID No:17，SEQ ID No:18，SEQ ID No:20，SEQ ID No:21，SEQ ID No:22，SEQ ID No:23和SEQ ID No:24中所示的一種或多種核苷酸序列的組合。
優(yōu)選的是，所述的上游檢測引物為SEQ ID No:25所示的核苷酸序列，所述的下游檢測引物為SEQ ID No:31所示的核苷酸序列，所述的封閉引物為SEQ ID No:26，SEQ ID No:27，SEQ ID No:28，SEQ ID No:29，SEQ ID No:30，SEQ ID No:32，SEQ ID No:33，SEQ ID No:34，SEQ ID No:35和SEQ ID No:36中所示的一種或多種核苷酸序列的組合。
其中，所述的陰性對照為沒有HBV污染的健康人血清。
其中，所述的陽性對照為陽性對照血清，該陽性對照血清中HBV DNA濃度為30拷貝/ml、40拷貝/ml和50拷貝/ml。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明實現(xiàn)的有益效果：
（1）靈敏度高，按照本發(fā)明的方法抽提HBV DNA，并進行PRINS反應，在待檢血清中的HBV DNA達到30-50拷貝/ml時，即可以檢測出來，靈敏度比現(xiàn)有進口的試劑盒的相應指標有明顯提高。
（2）操作簡單，常規(guī)的檢驗實驗室即可完成該操作，操作人員不需要特殊培訓，因而保證了可操作性。
（3）在PRINS階段，如果沒有進口的原位PCR儀，采用國產的同類型PCR儀即可。另外，除了熒光顯微鏡外，不需要其它的貴重設備，便于普及。
（4）本方案基于載玻片的PRINS方案，直接將待檢血清涂布于經處理的載玻片上，保證了樣品的完整性，提高了檢測靈敏度。由于檢測靈敏度的提高，可以在HBV的潛伏期內就可以被檢測到，從而可以提前預警，本技術已經穩(wěn)定在30-50拷貝/ml的靈敏度。
具體實施方式
如下涉及到的載玻片、蓋玻片為本領域常規(guī)的載玻片、蓋玻片，其處理方法也是本領域的公知常識。
實施例1
特異性引物：所述的上游檢測引物、下游檢測引物、封閉引物分別為SEQ ID No:1、SEQ ID No:7和 SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。
引物的制備：
人工合成上游檢測引物、下游檢測引物和封閉引物，詳細序列見序列表（SEQ ID No:1，SEQ ID No:7和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列）。合成后的引物進行稀釋處理，分別為上游檢測引物10nmol/L，下游檢測引物10nmol/L和封閉引物50nmol/L。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下試劑：
1）固定液:137mmol/L 的NaCl，2.7mmol/L 的KCl，10mmol/L 的Na2HPO4， 2 mmol/L 的KH2PO4 ，4%的多聚甲醛和0.2 mol/L的戊二醛組成的溶液，pH=7.2～7.4，所述的百分數(shù)為質量百分數(shù)。
2）變性緩沖液：20mmol/L的甲酰胺，3mmol/L的NaCl和0.3mmol/L的檸檬酸鈉組成的溶液。
3）PBS 溶液：137mmol/L 的NaCl，2.7mmol/L的KCl，10mmol/L的Na2HPO4， 2mmol/L的KH2PO4組成的溶液，pH7.2～7.4 。
4）蛋白酶 K：質量百分數(shù)0.025%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
5）第一PRINS反應液（50μl）：10mmol/L TrisCl（pH8.8），50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.1% 牛血清白蛋白，2mol/L甘油，2mol/L 甜菜堿，0.5mol/L海藻糖，0.2mmol/L ddATP、0.2mmol/L ddCTP、0.2mmol/L ddGTP和0.2mmol/L ddTTP，以及2.5U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比為質量百分比。
6) 第二PRINS反應液（50μl）：10nmol/L的上游檢測引物，10nmol/L的下游檢測引物，50nmol/L的封閉引物，2.5mmol/L TrisCl（pH8.8），5m mol/L KCl，1.2mmol/L MgCl2，0.5% 牛血清白蛋白，0.5mol/L甘油，0.5mol/L 甜菜堿，0.1mol/L海藻糖，0.05mmol/L dATP、0.05mmol/L dCTP、0.05mmol/L dGTP，0.01mmol/L dTTP，0.04mmol/L 熒光素標記的dUTP，以及0.5U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比為質量百分比。
7）洗滌液：0.3mol/L的NaCl，0.03mol/L的檸檬酸鈉，0.05%的Tween-20組成的溶液，pH=7.2，其中所述百分比為質量百分比。
8）終止反應液:0.5mol/L NaCl 和0.05mol/L EDTA (pH8.1)組成的溶液；
9）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，濃度1 mg/mL。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下步驟：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，靜置30分鐘后，在3000轉下離心5分鐘，取50μ離心后的血清均勻涂布于載玻片中，利用固定液室溫固定5分鐘，固定后用25℃的 PBS溶液洗滌3次，每次5分鐘，洗滌后的載玻片利用蛋白酶K在4°C下孵育15分鐘，然后用變性緩沖液于75℃下處理5分鐘，處理后的載玻片在96°C條件下干熱20分鐘，使蛋白酶K滅活，然后在4℃下用PBS溶液洗滌3次，5分鐘/次；
2）在載玻片上加入50μl第一PRINS反應液，以ddNTPs為底物在60℃下做PRINS反應1小時，反應后于25℃下用洗滌液洗滌3次，5分鐘/次；
3）在載玻片上加入50μl第二PRINS反應液，這里以dNTPs和熒光標記的dUTP為底物，放置蓋玻片，用橡皮泥封閉，將樣品加熱到95°C預變性5分鐘, 95°C下變性1分鐘，58°C下退火3分鐘，64°C下延伸3分鐘，做28個循環(huán)，最后64°C下延伸5分鐘；
4）去掉蓋玻片，將樣品載玻片放入50ml，65°C的終止反應液，浸泡1分鐘，使原位擴增標記反應終止，然后將載玻片置于25℃的洗滌液中洗滌3次，10分鐘/次；
5）將載玻片置于碘化丙啶溶液中，10℃下于暗盒中孵育15分鐘，孵育后用水沖洗3次，5分鐘/次，加蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察，以藍色和紅/綠色重疊為陽性信號。
實施例2
特異性引物：上游檢測引物、下游檢測引物、封閉引物分別為SEQ ID No:13、SEQ ID No:19和SEQ ID No:14所示的核苷酸序列。
引物的制備：
人工合成上游檢測引物、下游檢測引物和封閉引物，詳細序列見序列表（SEQ ID No:13，SEQ ID No:19和SEQ ID No:14所示的核苷酸序列）。合成后的引物進行稀釋處理，分別為上游檢測引物50nmol/L，下游檢測引物50nmol/L和封閉引物250nmol/L。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下試劑：
1）固定液、變性緩沖液、PBS 溶液、洗滌液和終止反應液包括的組分和含量與實施例1中的組分和含量一致。
2）蛋白酶 K：質量百分數(shù)0.1%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反應液（50μl）：1.5mmol/L TrisCl（pH8.8），5mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，0.05% 牛血清白蛋白，0.5mol/L甘油，0.5mol/L 甜菜堿，3mol/L海藻糖，0.15mmol/L ddATP、0. 15mmol/L ddCTP、0. 15mmol/L ddGTP和0.15mmol/L ddTTP，以及5U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比為質量百分比。
4) 第二PRINS反應液（50μl）：50nmol/L的上游檢測引物，50nmol/L的下游檢測引物，250nmol/L的封閉引物，3mmol/L TrisCl（pH8.8），20mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，0.05% 牛血清白蛋白，2.5mol/L甘油，1.5mol/L 甜菜堿，1mol/L海藻糖，0.08mmol/L dATP、0.08mmol/L dCTP、0.08mmol/L dGTP，0.05mmol/L dTTP，0.03mmol/L 熒光素標記的dUTP，以及5U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比為質量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，濃度0.15mg/mL。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下步驟：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，靜置30分鐘后，在3000轉離心5分鐘，取50μl離心后的血清均勻涂布于載玻片中，利用固定液室溫固定10分鐘，固定后用35℃的PBS溶液洗滌5次，30分鐘/次，洗滌后的載玻片利用蛋白酶K在65°C下孵育0.5分鐘，然后用變性緩沖液于65℃處理10分鐘，處理后的載玻片在90°C條件下干熱30分鐘，使蛋白酶K滅活，然后在10℃下用PBS溶液洗滌3次，0.5分鐘/次；
2）在載玻片上加入50μl第一PRINS反應液，以ddNTPs為底物在35℃下做PRINS反應1分鐘，反應后于5℃下用洗滌液下洗滌4次，3分鐘/次；
3）在載玻片上加入50μl第二PRINS反應液，這里以dNTPs和熒光標記的dUTP為底物，放置蓋玻片，用橡皮泥封閉，將樣品加熱到90°C預變性0.5分鐘，90°C下變性1.5分鐘，45°C下退火0.5分鐘，55°C 下延伸5分鐘，做38個循環(huán)，最后60°C下延伸1分鐘；
4）去掉蓋玻片，將樣品載玻片放入50ml，0°C的終止反應液中，浸泡30分鐘，使原位擴增標記反應終止，然后將載玻片置于35℃的洗滌液中洗滌3次，1分鐘/次；
5）將載玻片置于碘化丙啶溶液中，55℃下于暗盒中孵育1分鐘，孵育后用水沖洗3次，5分鐘/次，加蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察，以藍色和紅/綠色重疊為陽性信號。
實施例3
特異性引物：上游檢測引物、下游檢測引物和封閉引物分別為SEQ ID No:25、SEQ ID No:31和SEQ ID No:26所示的核苷酸序列。
引物的制備：
人工合成上游檢測引物、下游檢測引物和封閉引物，詳細序列見序列表（SEQ ID No:25，SEQ ID No:31和SEQ ID No:26所示的核苷酸序列）。合成后的引物進行稀釋處理，分別為上游檢測引物1000nmol/L，下游檢測引物1000nmol/L和封閉引物5000nmol/L。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下試劑：
1）固定液、變性緩沖液、PBS 溶液、洗滌液和終止反應液包括的組分和含量與實施例1中的組分和含量一致。
2）蛋白酶 K：質量百分數(shù)0.002%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反應液（50μl）：20mmol/L TrisCl（pH8.8），5mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，0.01% 牛血清白蛋白，1mol/L甘油，1.5mol/L 甜菜堿，0.15mol/L海藻糖，0.1mmol/L ddATP、0.1mmol/L ddCTP、0. 1mmol/L ddGTP和0.1mmol/L ddTTP，以及3U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比為質量百分比。
4) 第二PRINS反應液（50μl）：1000nmol/L的上游檢測引物，1000nmol/L的下游檢測引物，5000nmol/L的封閉引物，50mmol/L TrisCl（pH8.8），50mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，0.8% 牛血清白蛋白，1mol/L甘油，2mol/L 甜菜堿，2mol/L海藻糖，0.2mmol/L dATP、0.2mmol/LdCTP、0.2mmol/L dGTP，0.5mmol/L dTTP，0.1mmol/L 熒光素標記的dUTP，以及2U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比為質量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，濃度1.5mg/mL。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下步驟：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，靜置30分鐘后，在3000轉下離心5分鐘，取50μl離心后的血清均勻涂布于載玻片中，利用固定液0℃下固定15分鐘，固定后用4℃的PBS溶液洗滌4次， 0.5分鐘/次，洗滌后的載玻片利用蛋白酶K在45°C下孵育35分鐘，然后用變性緩沖液于75℃下處理15分鐘，處理后的載玻片在98°C條件下干熱1分鐘，使蛋白酶K滅活，然后在35℃下用PBS溶液洗滌3次，30分鐘/次；
2）在載玻片上加入50μl第一PRINS反應液，以ddNTPs為底物在73℃下做PRINS反應90分鐘，反應后于35℃下用洗滌液下洗滌5次，6分鐘/次；
3）在載玻片上加入50μl第二PRINS反應液，這里以dNTPs和熒光標記的dUTP為底物，放置蓋玻片，用橡皮泥封閉，將樣品加熱到98°C預變性10分鐘，93°C下變性1秒，68°C下退火1分鐘，73°C 下延伸1分鐘，做1個循環(huán)，最后73°C下延伸3分鐘；
4）去掉蓋玻片，將樣品載玻片放入50ml，73°C的終止反應液，浸泡10秒，使原位擴增標記反應終止，然后將載玻片置于30℃的洗滌液中洗滌5次，30分鐘/次；
5）將載玻片置于碘化丙啶溶液中，0℃下于暗盒中孵育45分鐘，孵育后用水沖洗洗3次，5分鐘/次，加蓋玻片，于在熒光顯微鏡下觀察，以藍色和紅/綠色重疊為陽性信號。
實施例4
特異性引物：上游檢測引物、下游檢測引物和封閉引物分別為SEQ ID No:1、SEQ ID No:7和SEQ ID No:11所示的核苷酸序列。
引物的制備：
人工合成上游檢測引物、下游檢測引物和封閉引物，詳細序列見序列表（SEQ ID No:1，SEQ ID No:7和SEQ ID No:11所示的核苷酸序列）。合成后的引物進行稀釋處理，分別為上游檢測引物100nmol/L，下游檢測引物100nmol/L和封閉引物800nmol/L。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下試劑：
1）固定液、變性緩沖液、PBS 溶液、洗滌液和終止反應液包括的組分和含量與實施例1中的組分和含量一致。
2）蛋白酶 K：質量百分數(shù)0.08%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反應液（50μl）：57mmol/L TrisCl（pH8.8），55mmol/L KCl，5mmol/L MgCl2，0.35% 牛血清白蛋白，1.2mol/L甘油，3mol/L 甜菜堿，2.2mol/L海藻糖，0.3mmol/L ddATP、0.3mmol/L ddCTP、0.3mmol/L ddGTP和0.3mmol/L ddTTP，以及3.5U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比為質量百分比。
4) 第二PRINS反應液（50μl）：100nmol/L的上游檢測引物，100nmol/L的下游檢測引物，800nmol/L的封閉引物，100mmol/L TrisCl（pH8.8），100mmol/L KCl，5mmol/L MgCl2，0.65% 牛血清白蛋白，1.3mol/L甘油，2.9mol/L 甜菜堿，3mol/L海藻糖，0.4mmol/L dATP、0.4mmol/LdCTP、0.4mmol/L dGTP，0.3mmol/L dTTP，0.1mmol/L 熒光素標記的dUTP，以及1.2U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比為質量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，濃度0.5mg/mL。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下步驟：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，靜置30分鐘后，在3000轉下離心5分鐘，取50μl離心后的血清均勻涂布于載玻片中，利用固定液于55℃下固定40分鐘，固定后用10℃的PBS溶液洗滌3次，10分鐘/次，洗滌后的載玻片利用蛋白酶K在15°C下孵育10分鐘，然后用變性緩沖液于75℃下處理5分鐘，處理后的載玻片在96°C條件下干熱10分鐘，使蛋白酶K滅活，然后在4℃下用PBS溶液洗滌4次，5分鐘/次；
2）在載玻片上加入50μl第一PRINS反應液，以ddNTPs為底物在55℃下做PRINS反應15分鐘，反應后于25℃下用洗滌液洗滌3次，5分鐘/次；
3）在載玻片上加入50μl第二PRINS反應液，這里以dNTPs和熒光標記的dUTP為底物，放置蓋玻片，用橡皮泥封閉，將樣品加熱到92°C預變性5分鐘，95°C下變性1分鐘，50°C下退火3分鐘，60°C下延伸3分鐘，做2個循環(huán)，最后68°C下延伸3分鐘；
4）去掉蓋玻片，將樣品載玻片放入50ml，15°C終止反應液，浸泡5分鐘，使原位擴增標記反應終止，然后將載玻片置于25℃的洗滌液中洗滌4次，5分鐘/次；
5）將載玻片置于碘化丙啶溶液中，30℃下于暗盒中孵育15分鐘，孵育后用水沖洗3次，5分鐘/次，加蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察，以藍色和紅/綠色重疊為陽性信號。
實施例5
特異性引物：上游檢測引物和下游檢測引物分別為SEQ ID No:1、SEQ ID No:7所示的核苷酸序列，所述的封閉引物為SEQ ID No:8所示的核苷酸序列和SEQ ID No:10所示的核苷酸序列的等量混合。
引物的制備：
人工合成上游檢測引物、下游檢測引物和封閉引物，詳細序列見序列表（SEQ ID No:1，SEQ ID No:7，SEQ ID No:8和SEQ ID No:10所示的核苷酸序列）。合成后的引物進行稀釋處理，分別為上游檢測引物5000nmol/L，下游檢測引物5000nmol/L和封閉引物2.8×104nmol/L。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下試劑：
1）固定液、變性緩沖液、PBS 溶液、洗滌液和終止反應液包括的組分和含量與實施例1中的組分和含量一致。
2）蛋白酶 K：質量百分數(shù)0.12%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反應液（50μl）：15mmol/L TrisCl（pH8.8），50mmol/L KCl，1mmol/L MgCl2，0.58% 牛血清白蛋白，0.5mol/L甘油，1.8mol/L 甜菜堿，1.5mol/L海藻糖，0.45mmol/L ddATP、0.45mmol/L ddCTP、0.45mmol/L ddGTP和0.45mmol/L ddTTP，以及2U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比為質量百分比。
4) 第二PRINS反應液（50μl）：5000nmol/L的上游檢測引物，5000nmol/L的下游檢測引物，2.8×104nmol/L的封閉引物，88mmol/L TrisCl（pH8.8），55mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，0.25% 牛血清白蛋白，1.8mol/L甘油，2.5mol/L 甜菜堿，0.3mol/L海藻糖，0.45mmol/L dATP、0.45mmol/LdCTP、0.45mmol/L dGTP，0.35mmol/L dTTP，0.25mmol/L 熒光素標記的dUTP，以及1.8U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比為質量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，濃度2mg/mL。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下步驟：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，靜置30分鐘后，在3000轉下離心5分鐘，取50μl離心后的血清均勻涂布于載玻片中，利用固定液于55℃下固定60分鐘，固定后用10℃的PBS溶液洗滌3次，10分鐘/次，洗滌后的載玻片利用蛋白酶K液在10°C下孵育15分鐘后，然后用變性緩沖液于75℃處理5分鐘，處理后的載玻片在96°C條件下干熱10分鐘，使蛋白酶K滅活，然后在4℃下用PBS溶液洗滌4次，5分鐘/次；
2）在載玻片上加入50μl第一PRINS反應液，以ddNTPs為底物在45℃下做PRINS反應10分鐘，反應后于25℃下用洗滌液洗滌3次，5分鐘/次；
3）在載玻片上加入50μl第二PRINS反應液，這里以dNTPs和熒光標記的dUTP為底物，放置蓋玻片，用橡皮泥封閉，將樣品加熱到98°C預變性10分鐘，90°C下變性1.5分鐘，60°C下退火3分鐘，73°C下延伸3分鐘，做2個循環(huán)，最后68°C下延伸3分鐘；
4）去掉蓋玻片，將樣品載玻片放入50ml，15°C的終止反應液，浸泡5分鐘，使原位擴增標記反應終止，然后將載玻片置于25℃的洗滌液中洗滌4次，5分鐘/次；
5）將載玻片置于碘化丙啶溶液中，30℃下于暗盒中孵育15分鐘，孵育后用水沖洗3次，5分鐘/次，加蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察，以藍色和紅/綠色重疊為陽性信號。
實施例6
特異性引物：上游檢測引物、下游檢測引物和封閉引物分別為SEQ ID No:13、SEQ ID No:19和SEQ ID No:23所示的核苷酸序列。
引物的制備：
人工合成上游檢測引物、下游檢測引物和封閉引物，詳細序列見序列表（SEQ ID No:13，SEQ ID No:19，SEQ ID No:23所示的核苷酸序列）。合成后的引物進行稀釋處理，分別為上游檢測引物500nmol/L，下游檢測引物500nmol/L和封閉引物2600nmol/L。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下試劑：
1）固定液、變性緩沖液、PBS 溶液、洗滌液和終止反應液包括的組分和含量與實施例1中的組分和含量一致。
2）蛋白酶 K：質量百分數(shù)0.11%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反應液（50μl）：29mmol/L TrisCl（pH8.8），37mmol/L KCl，1.2mmol/L MgCl2，0.08% 牛血清白蛋白，1.4mol/L甘油，3mol/L 甜菜堿，1.3mol/L海藻糖，0.14mmol/L ddATP、0.14mmol/L ddCTP、0.14mmol/L ddGTP和0.14mmol/L ddTTP，以及4.2U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比為質量百分比。
4) 第二PRINS反應液（50μl）：500nmol/L的上游檢測引物，500nmol/L的下游檢測引物，2600nmol/L的封閉引物，47mmol/L TrisCl（pH8.8），65mmol/L KCl，2.9mmol/L MgCl2，0.28% 牛血清白蛋白，0.8mol/L甘油，0.9mol/L 甜菜堿，0.8mol/L海藻糖，0.45mmol/L dATP、0.45mmol/LdCTP、0.45mmol/L dGTP，0.1mmol/L dTTP，0.35mmol/L 熒光素標記的dUTP，以及3.6U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比為質量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，濃度1.9mg/mL。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下步驟：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，靜置30分鐘后，在3000轉下離心5分鐘，取50μl離心后的血清均勻涂布于載玻片中，利用固定液于55℃下固定95分鐘，固定后用10℃的PBS溶液洗滌3次，10分鐘/次，洗滌后的載玻片利用蛋白酶K在10°C下孵育15分鐘，然后用變性緩沖液于75℃處理5分鐘，處理后的載玻片在96°C條件下干熱10分鐘，滅活蛋白酶K，然后在4℃下用PBS溶液洗滌4次，5分鐘/次；
2）在載玻片上加入50μl第一PRINS反應液，以ddNTPs為底物在45℃下做PRINS反應10分鐘，反應后于25℃下用洗滌液洗滌3次，5分鐘/次；
3）在載玻片上加入50μl第二PRINS反應液，這里以dNTPs和熒光標記的dUTP為底物，放置蓋玻片，用橡皮泥封閉，將樣品加熱到92°C預變性5分鐘，95°C下變性1分鐘，50°C下退火3分鐘，60°C下延伸3分鐘，做2個循環(huán)，最后68°C下延伸3分鐘；
4）去掉蓋玻片，將樣品載玻片放入50ml，15°C的終止反應液，浸泡5分鐘，使原位擴增標記反應終止，然后將載玻片置于25℃的洗滌液中洗滌4次，5分鐘/次；
5）將載玻片置于碘化丙啶溶液中，30℃下于暗盒中孵育15分鐘，然后用水沖洗3次，5分鐘/次，加蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察，以藍色和紅/綠色重疊為陽性信號。
實施例7
特異性引物：上游檢測引物、下游檢測引物分別為SEQ ID No:13、SEQ ID No:19所示的核苷酸序列，所述的封閉引物為SEQ ID No:15所示的核苷酸序列和SEQ ID No:17所示的核苷酸序列的等量混合。
引物的制備：
人工合成上游檢測引物、下游檢測引物和封閉引物，詳細序列見序列表（SEQ ID No:13，SEQ ID No:19，SEQ ID No:15和SEQ ID No:17所示的核苷酸序列）。合成后的引物進行稀釋處理，分別為上游檢測引物80nmol/L，下游檢測引物80nmol/L和封閉引物450nmol/L。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下試劑：
1）固定液、變性緩沖液、PBS 溶液、洗滌液和終止反應液包括的組分和含量與實施例1中的組分和含量一致。
2）蛋白酶 K：質量百分數(shù)0.18%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反應液（50μl）：56mmol/L TrisCl（pH8.8），100mmol/L KCl，2.8mmol/L MgCl2，1% 牛血清白蛋白，2.5mol/L甘油，1.9mol/L 甜菜堿，1.8mol/L海藻糖，0.05mmol/L ddATP、0.05mmol/L ddCTP、0.05mmol/L ddGTP和0.05mmol/L ddTTP，以及3.2U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比為質量百分比。
4) 第二PRINS反應液（50μl）：80nmol/L的上游檢測引物，80nmol/L的下游檢測引物，450nmol/L的封閉引物，36mmol/L TrisCl（pH8.8），49mmol/L KCl，2.8mmol/L MgCl2，0.08% 牛血清白蛋白，1.4mol/L甘油，1.9mol/L 甜菜堿，1.8mol/L海藻糖，0.5mmol/L dATP、0.5mmol/LdCTP、0.5mmol/L dGTP，0.1mmol/L dTTP，0.5mmol/L 熒光素標記的dUTP，以及2.4U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比為質量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，濃度1.2mg/mL。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下步驟：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，靜置30分鐘后，在3000轉下離心5分鐘，取50μl離心后的血清均勻涂布于載玻片中，利用固定液于55℃下固定95分鐘，固定后用30℃的PBS溶液洗滌3次，15分鐘/次，洗滌后的載玻片利用蛋白酶K液在30°C下孵育25分鐘后，然后用用變性緩沖液于75℃處理5分鐘，處理后的載玻片在96°C條件下干熱10分鐘，滅活蛋白酶K，然后在20℃下用PBS溶液洗滌4次，5分鐘/次；
2）在載玻片上加入50μl第一PRINS反應液，以ddNTPs為底物在45℃下做PRINS反應60分鐘，反應后于20℃下用洗滌液洗滌3次，5分鐘/次；
3）在載玻片上加入50μl第二PRINS反應液，這里以dNTPs和熒光標記的dUTP為底物，放置蓋玻片，用橡皮泥封閉，將樣品加熱到92°C預變性5分鐘，95°C下變性1分鐘，50°C下退火3分鐘，60°C下延伸3分鐘，做25個循環(huán)，最后68°C下延伸3分鐘；
4）去掉蓋玻片，將樣品載玻片放入50ml終止反應液，15°C，浸泡5分鐘，使原位擴增標記反應終止，然后將載玻片置于25℃的洗滌液中洗滌4次，5分鐘/次；
5）將載玻片置于碘化丙啶溶液中，30℃下于暗盒中孵育15分鐘，孵育后用水沖洗3次，5分鐘/次，加蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察，以藍色和紅/綠色重疊為陽性信號。
實施例8
特異性引物：上游檢測引物、下游檢測引物分別為SEQ ID No:25、SEQ ID No:31所示的核苷酸序列，所述的封閉引物為SEQ ID No:27所示的核苷酸序列和SEQ ID No:29所示的核苷酸序列的等量混合。
引物的制備：
人工合成上游檢測引物、下游檢測引物和封閉引物，詳細序列見序列表（SEQ ID No:25，SEQ ID No:31，SEQ ID No:27和 SEQ ID No:29所示的核苷酸序列）。合成后的引物進行稀釋處理，分別為上游檢測引物700nmol/L，下游檢測引物700nmol/L和封閉引物5600nmol/L。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下試劑：
1）固定液、變性緩沖液、PBS 溶液、洗滌液和終止反應液包括的組分和含量與實施例1中的組分和含量一致。
2）蛋白酶 K：質量百分數(shù)0.25%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反應液（50μl）：98mmol/L TrisCl（pH8.8），69mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，0.25% 牛血清白蛋白，1.9mol/L甘油，2.3mol/L 甜菜堿，1.2mol/L海藻糖，0.5mmol/L ddATP、0.5mmol/L ddCTP、0.5mmol/L ddGTP和0.5mmol/L ddTTP，以及1.2U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比為質量百分比。
4) 第二PRINS反應液（50μl）：1×105 nmol/L的上游檢測引物，1×105 nmol/L的下游檢測引物，1×106 nmol/L的封閉引物，48mmol/L TrisCl（pH8.8），57mmol/L KCl，4.3mmol/L MgCl2，0.1% 牛血清白蛋白，1.3mol/L甘油，0.8mol/L 甜菜堿，2.2mol/L海藻糖，0.5mmol/L dATP、0.5mmol/LdCTP、0.5mmol/L dGTP，0.114mmol/L dTTP，0.016mmol/L 熒光素標記的dUTP，以及3.5U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比為質量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，濃度0.8mg/mL。
乙肝病毒的PRINS檢測方法中包括如下步驟：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，靜置30分鐘后，在3000轉下離心5分鐘，取50μl離心后的血清均勻涂布于載玻片中，利用固定液于55℃下固定95分鐘，固定后用30℃的PBS溶液洗滌3次，15分鐘/次，洗滌后的載玻片利用蛋白酶K在30°C下孵育25分鐘，然后用變性緩沖液于75℃處理5分鐘，處理后的載玻片在96°C條件下干熱10分鐘，滅活蛋白酶K，然后在20℃下用PBS溶液洗滌4次，5分鐘/次；
2）在載玻片上加入50μl第一PRINS反應液，以ddNTPs為底物在45℃下做PRINS反應60分鐘，反應后于20℃下用洗滌液洗滌3次，5分鐘/次；
3）在載玻片上加入50μl第二PRINS反應液，這里以dNTPs和熒光標記的dUTP為底物，放置蓋玻片，用橡皮泥封閉，將樣品加熱到92°C預變性5分鐘；以95°C變性1分鐘，50°C退火3分鐘，60°C 延伸3分鐘，做25個循環(huán)，最后68°C延伸3分鐘；
4）去掉蓋玻片，將樣品載玻片放入50ml，15°C的終止反應液，浸泡5分鐘，使原位擴增標記反應終止，然后將載玻片置于25℃的洗滌液中洗滌4次，5分鐘/次；
5）將載玻片置于碘化丙啶溶液中，30℃下于暗盒中孵育15分鐘，孵育后用水沖洗3次，5分鐘/次，加蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察，以藍色和紅/綠色重疊為陽性信號。
除了dUTP可以標記用于測定之外，dATP，dCTP，dGTP，dTTP也可以用于標記。
應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
<110> 上海復陽生物科技有限公司
<120> 一種乙肝病毒的PRINS檢測方法及其引物和檢測試劑盒
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 27
tcgcttcacc tctgcacgtb hd 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 28
tcgcttcacc tctgcacgvb hd 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 29
tcgcttcacc tctgcachvb hd 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 30
tcgcttcacc tctgcadhvb hd 22
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 31
gcccngtaaa gtttcccacc ttatg 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 32
gcccngtaaa gtttcccacc ttavh 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 33
gcccngtaaa gtttcccacc ttbvh 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 34
gcccngtaaa gtttcccacc tvbvh 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 35
gcccngtaaa gtttcccacc vvbvh 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 36
gcccngtaaa gtttcccacd vvbvh