專利名稱：肝細(xì)胞核因子1α治療人體惡性實體瘤的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及利用肝細(xì)胞核因子1 α Ofepatocyte Nuclear Factor-I α，HNFl α )誘導(dǎo)人體惡性實體瘤細(xì)胞發(fā)生分化，從而應(yīng)用于實體腫瘤治療的方法和用途。
背景技術(shù)：
惡性實體瘤的治療是目前臨床的難點之一，尤其對于手術(shù)無法切除的惡性實體瘤，臨床尚缺乏有效的治療手段。選擇與腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白、分子和基因進(jìn)行特異性靶向調(diào)控是惡性實體瘤治療的核心問題之一。腫瘤誘導(dǎo)分化治療(differentiation therapy)是近20年來腫瘤臨床治療方面的重要突破。誘導(dǎo)分化治療是通過誘導(dǎo)分化方法促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向成熟階段分化，恢復(fù)正常的細(xì)胞表型和功能并抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。誘導(dǎo)分化治療打破了腫瘤發(fā)展不可逆的傳統(tǒng)認(rèn)識，有力的推動了整個癌癥研究領(lǐng)域的發(fā)展。我國學(xué)者曾率先運用全反式維甲酸誘導(dǎo)分化治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病，取得了較好的療效。然而，盡管白血病的分化治療取得了很大進(jìn)展，但惡性實體瘤的分化治療仍然是腫瘤治療研究領(lǐng)域的難題。迄今為止，對于諸如肝癌、胃癌、腸癌、腎癌以及胰腺癌等人體惡性實體腫瘤的誘導(dǎo)分化治療仍未見明確報道。迄今實驗表明，全反式維甲酸對惡性實體瘤的分化無明顯作用。選擇合適的藥物或相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行特異性靶向調(diào)控是腫瘤誘導(dǎo)分化治療的難點。有研究利用藥物或蛋白體外調(diào)控實體腫瘤的分化狀態(tài)，但效果有限。體內(nèi)實驗大多提示上述方法在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤組織壞死方面有一定的作用，但是很難實現(xiàn)顯著調(diào)控或逆轉(zhuǎn)實體瘤低分化程度。在眾多候選物質(zhì)中篩選出有效的誘導(dǎo)腫瘤分化的試劑是非常困難的，也是收效甚微的。因此，選擇出與腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白、分子和基因進(jìn)行特異性靶向調(diào)控是腫瘤誘導(dǎo)分化治療的核心問題之一。近年來，隨著人類基因組計劃研究的不斷深入，為人們利用基因技術(shù)手段調(diào)控甚至改變細(xì)胞重要基因的表達(dá)以改變其表型、分化狀態(tài)和生物學(xué)功能創(chuàng)造了條件。然而，雖然已經(jīng)證實有一些物質(zhì)或基因在體外實驗中可改善腫瘤細(xì)胞的某些生物性特性(如增殖及克隆形成能力降低、部分正常細(xì)胞功能基因表達(dá)上調(diào))，一些物質(zhì)甚至證實了可降低癌細(xì)胞在動物體內(nèi)的成瘤作用，但是往往發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)對正常細(xì)胞也有影響(副作用)，并不能特異性地在體內(nèi)誘導(dǎo)實體腫瘤發(fā)生分化。本發(fā)明人曾研究了全反式維甲酸、生長抑素、腫瘤壞死因子以及三氧化二砷等物質(zhì)體外對肝癌細(xì)胞株分化的調(diào)控作用，均未篩選出有明確分化治療作用的藥物或蛋白，同時體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)不能有效地誘導(dǎo)實體腫瘤發(fā)生分化。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)與惡性實體瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化密切相關(guān)的特定蛋白或基因，能夠作為特異性調(diào)控的靶標(biāo)，從而有效地誘導(dǎo)分化實體瘤。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與惡性實體瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化密切相關(guān)的特定的基因-HNFl α基因及其編碼產(chǎn)物HNFl α蛋白，以及HNFl α基因/蛋白在誘導(dǎo)分化實體瘤中的用途。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種通過HNFl α基因/蛋白分化誘導(dǎo)惡性實體瘤從而治療腫瘤的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種肝細(xì)胞核因子1 α (Hepatocyte NuclearFactor-I α，HNFl α )基因和/或蛋白的用途，它們被用于制備誘導(dǎo)惡性實體瘤細(xì)胞分化的誘導(dǎo)分化試劑或組合物。本發(fā)明還提供肝細(xì)胞核因子1 α (Hepatocyte Nuclear Factor-I α，HNFl α )基因和/或蛋白的用途，它們被用于制備使惡性實體瘤的腫瘤細(xì)胞阻滯于G2/M期的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物含有(a)HNFl α蛋白、HNFl α編碼序列或含所述編碼序列的表達(dá)載體以及(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體包括病毒載體和非病毒載體。較佳地，所述的非病毒載體為脂質(zhì)體。在另一優(yōu)選例中，所述的實體瘤選自肝癌、胃癌、腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌或生殖腺腫瘤。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還用于體內(nèi)抑制實體瘤的形成。在另一優(yōu)選例中，所述的肝細(xì)胞核因子1 α是人的肝細(xì)胞核因子1 α。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物的劑型為注射劑。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還含有化療劑。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種誘導(dǎo)或促進(jìn)哺乳動物中實體瘤分化的方法，它包括步驟給需要治療的哺乳動物對象施用肝細(xì)胞核因子Ia蛋白、其編碼序列或含所述編碼序列的表達(dá)載體。在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動物是人。


圖1. Real-time RT-PCR檢測人肝腫瘤細(xì)胞株HNFl α基因表達(dá)。圖2. Real-time RT-PCR檢測人肝癌及癌旁組織HNFl α基因表達(dá)。圖3.免疫組化檢測人肝癌及癌旁組織HNFl α蛋白表達(dá)(I 癌旁組織HNFl α表達(dá)高于肝癌組織；II 肝癌及癌旁組織HNFl α表達(dá)相當(dāng)；III癌旁組織HNFl α表達(dá)低于肝癌組織)。圖4.免疫組化檢測大鼠DEN誘導(dǎo)肝癌模型過程中HNFl α基因表達(dá)逐步下調(diào)。圖 5. RT-PCR 獲得 HNFlacDNA 片段。圖6.體外連接獲得穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-HNFlaBglII、kpnI酶切鑒定。圖7. Pac I酶切鑒定重組腺病毒質(zhì)粒pAdHNFl α。圖8.酶切鑒定重組腺病毒質(zhì)粒pAdHNFl α。
圖 9. AdHNFl α 分別感染 H印(A、B)、Huh7 (C、D)、MHCC_H(E、F)；及 MHCC-L (G、H) 細(xì)胞3d后GFP表達(dá)。圖10. AdHNFl α感染肝腫瘤細(xì)胞3d后western blot檢測HNFl α蛋白表達(dá)。圖11. AdHNFl α感染肝腫瘤細(xì)胞3d后HNFl α蛋白表達(dá)定量分析。圖12. AdHNFl α感染肝腫瘤細(xì)胞3d后免疫熒光檢測HNFl α蛋白表達(dá)定位。圖13. AdHNFl α感染人肝腫瘤細(xì)胞株后HNFl α基因和肝細(xì)胞相關(guān)功能基因mRNA 表達(dá)定量分析圖14. AdHNFl α感染肝腫瘤細(xì)胞株3d后細(xì)胞凋亡變化。圖15. AdHNFl α感染肝腫瘤細(xì)胞株3d后細(xì)胞周期變化。圖 16. Real-time RT-PCR 及 western blot 檢測 AdHNFl α 感染肝腫瘤細(xì)胞株 3d 對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響。圖17.外源導(dǎo)入HNFl α對不同人肝腫瘤細(xì)胞株細(xì)胞增殖能力的影響。圖18.外源導(dǎo)入HNFl α對不同人肝腫瘤細(xì)胞株細(xì)胞克隆形成的影響。圖19. AdHNFl α感染肝腫瘤細(xì)胞IfepIBB后體內(nèi)接種成瘤實驗。圖20. AdHNFl α感染肝腫瘤細(xì)胞Huh7后體內(nèi)接種成瘤實驗。圖21. AdHNFl α瘤內(nèi)注射基因治療皮下成瘤模型。圖22. HNFl α基因治療肝腫瘤細(xì)胞肝臟原位注射致實驗性肝腫瘤模型。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)了 HNFl α基因/蛋白可有效地在體內(nèi)誘導(dǎo)或促進(jìn)惡性實體瘤向正常細(xì)胞分化。實驗表明，HNFl α不僅對腫瘤細(xì)胞凋亡有影響，更可對實體瘤細(xì)胞的分化產(chǎn)生誘導(dǎo)或促進(jìn)作用(細(xì)胞形態(tài)變化、肝細(xì)胞相關(guān)功能基因表達(dá)明顯上調(diào)及體內(nèi)對腫瘤的預(yù)防、干預(yù)和治療作用)。因此HNFl α作為首次被證實的可有效地在體內(nèi)誘導(dǎo)或促進(jìn)惡性實體瘤向正常細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因/蛋白，具有潛在的應(yīng)用前景。 本發(fā)明人在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，術(shù)語“基因/蛋白”指基因和/或蛋白。如本文所用，術(shù)語“HNFIa蛋白”、“HNFl α多肽”、“本發(fā)明多肽”、“本發(fā)明蛋白”可互換使用，都指肝細(xì)胞核因子la (Hepatocyte NuclearFactor-I α )蛋白。它們可包括含有或不含起始甲硫氨酸(Met)的HNFl α。狹義上，所述術(shù)語指人的HNFl α ；廣義上，所述術(shù)語不僅包括人的HNFl α，還包括其他哺乳動物的HNFl α，尤其是靈長類動物的HNFl α，如猿或猴的HNFl α。該術(shù)語還包括HNFl α蛋白的活性片段、活性衍生物和類似物。本發(fā)明多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如， 細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然 HNFla蛋白(如人HNFl α)相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。這些多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。例如，在本發(fā)明中，術(shù)語“人HNFla多肽”指具有野生型HNFl α序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人HNFl α蛋白相同的誘導(dǎo)實體瘤分化功能的、野生型序列的變異形式。 這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地 1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如， 在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。同樣，該術(shù)語還包括人HNFl α蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明還包括人HNFl α蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人HNFl α多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，“人HNFl α蛋白保守性變異多肽”指與野生型氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表 權(quán)利要求
1.一種肝細(xì)胞核因子 1 α Ofepatocyte Nuclear Factor-I α，HNFl α )基因和 / 或蛋白的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo)惡性實體瘤細(xì)胞分化的誘導(dǎo)分化試劑或組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物是藥物組合物。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物含有(a)HNFla蛋白、 HNFla編碼序列或含所述編碼序列的表達(dá)載體以及(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的表達(dá)載體包括病毒載體和非病毒載體。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的實體瘤選自肝癌、胃癌、腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌或生殖腺腫瘤。
6.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物還用于體內(nèi)抑制實體瘤的形成。
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝細(xì)胞核因子Ia是人的肝細(xì)胞核因子1 a。
8.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物的劑型為注射劑。
9.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物還含有化療劑。
10.一種誘導(dǎo)或促進(jìn)哺乳動物中實體瘤分化的方法，其特征在于，它包括步驟給需要治療的哺乳動物對象施用肝細(xì)胞核因子Ia蛋白、其編碼序列或含所述編碼序列的表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及肝細(xì)胞核因子1α治療人體惡性實體瘤。具體地，本發(fā)明涉及利用肝細(xì)胞核因子1α(Hepatocyte Nuclear Factor-1α，HNF1α)誘導(dǎo)人體惡性實體瘤細(xì)胞發(fā)生分化，從而應(yīng)用于惡性實體腫瘤治療的方法和用途。本發(fā)明的研究表明，通過調(diào)控惡性實體腫瘤細(xì)胞HNF1α基因表達(dá)，可有效地對腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生誘導(dǎo)分化作用，從而提供了一種腫瘤誘導(dǎo)分化治療的新手段。
文檔編號A61K48/00GK102475893SQ20101055904
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月25日
發(fā)明者尹川, 曾欣, 林勇, 謝渭芬, 陳岳祥 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)