專利名稱：檢測和/或定量細(xì)胞中靶蛋白候選物的表達的方法和鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白的方法
檢測和/或定量細(xì)胞中靶蛋白候選物的表達的方法和 鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測和/或定量細(xì)胞中靶蛋白候選物的表達的方法和鑒 定小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白的方法。
細(xì)胞和蛋白質(zhì)功能、尤其哺乳動物細(xì)胞和蛋白質(zhì)功能的許多方面的 分子基礎(chǔ)在許多情況下仍然是難以捉摸的，并且需要在蛋白質(zhì)功能的基 于細(xì)胞的可視篩選背景中允許開發(fā)基因組工具的方法。這對于鑒定在目 標(biāo)細(xì)胞生物學(xué)系統(tǒng)周圍和內(nèi)部運行的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和鑒定通過化學(xué)遺傳
(Eggert和Mitchison, 2006)和類似的高通量篩選方法鑒定的小分子調(diào)節(jié) 劑的靶是有益的。當(dāng)前在蛋白質(zhì)功能的基于細(xì)胞的高含量篩選中的瓶頸 是這些靶的鑒定(Peterson等人，2006)。
此外，在許多情況下，甚至難以可靠和定量地檢測細(xì)胞中靶蛋白的 表達?，F(xiàn)有技術(shù)中的一些方法已集中在使用核酸陣列，和對于外部試劑 或者致病狀態(tài)對陣列內(nèi)核酸的表達概況的影響的作用。該方法在許多情 況中最多是僅僅定性的。此外，此種核酸陣列實驗的輸出產(chǎn)生了大量數(shù) 據(jù)，其大部分不適于直接進行進一步的分析。此外，該類型的實驗僅僅 提供了對核酸表達的了解，并且關(guān)于蛋白質(zhì)表達的任何推論僅僅是間接 的。因此，本領(lǐng)域中需要提供檢測和/或定量細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達的方法， 該方法容易進行和分析。
小分子是研究動態(tài)生物學(xué)過程的具有高的時間分辨率的有價值的 工具。小分子也可以促成治療性藥物的發(fā)現(xiàn)。通過在純蛋白質(zhì)體外測定
選所希望的表型可以發(fā)現(xiàn)藥學(xué)活性小分子 在過去t通常已經(jīng)確立了^ 于細(xì)胞的測定來報告對單個途徑或過程的活性的作用，通常使用作為在 平板讀出器中測量的讀出的發(fā)光或者熒光信號。在細(xì)胞成像測定中，使 用附著到不同的大分子的熒光標(biāo)記和自動化的顯微術(shù)顯現(xiàn)細(xì)胞視野。此 種數(shù)椐潛在含有與希望的以及意外的表型改變相關(guān)的大量信息，并且該 方法有時被稱作"高含量篩選"。該方法在學(xué)術(shù)界和工業(yè)中發(fā)現(xiàn)和表征有 用化合物的潛力是高的，但是仍然存在許多挑戰(zhàn)，尤其在靶鑒定和數(shù)椐 分析的水平上。小分子成像篩選通常涉及許多步驟。首先，通常將細(xì)胞鋪平板在透
明底(optical-bottom )的多孔板中，用小分子處理并溫育合適的時間段。 然后通過小分子焚光探針的某種組合使得目的蛋白發(fā)熒光，用抗體使得 發(fā)免疫熒光，和/或在細(xì)胞中表達熒光蛋白(例如，GFP)-標(biāo)記蛋白。后 一方法可以應(yīng)用于活細(xì)胞和固定的細(xì)胞。在第二步中，通過自動化顯微 術(shù)捕獲熒光圖像，于是分析圖像以提供對表型改變的度量，簦定含有所 希望的、不希望的或者意外表型的孔。在小分子篩選方法中，最終必須 鑒定引起表型改變的生物化學(xué)靶。這是具有挑戰(zhàn)性的，尤其是如果表型 改變由一種以上大分子的擾亂引起的話。
因此，在現(xiàn)有技術(shù)中存在提供鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白的改進方 法的需要，所迷方法容易進行并且適于容易的分析。所以，本發(fā)明的目 的是提供允許靶鑒定，即鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的大分子靶，而不需要復(fù)雜 的生物化學(xué)測定的方法。此外，本發(fā)明的目的是提供作為靶鑒定的全基 因組方法的方法，其避免了勞動密集型生物化學(xué)方法，如現(xiàn)有技術(shù)中存 在的那些方法。描迷了允許通過鑒定調(diào)節(jié)小分子調(diào)節(jié)劑活性的那些基因 鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的大分子靶的方法，通過一組潛在靶核酸、優(yōu)選cDNA 的表達，或者它們的表達的抑制來進行所迷鑒定。具體地，小分子的分 子單巴通過它們使小分子表型回轉(zhuǎn)或者加強該表型的能力來鑒定。與現(xiàn)有 技術(shù)中存在的勞動密集型生物化學(xué)方法相反，該方法允許靶鑒定而不需 要復(fù)雜的生物化學(xué)測定，且從而作為靶鑒定的全基因組方法(Peterson等 人，2006)。
通過檢測和/或定量細(xì)胞中革巴蛋白候選物的表達的方法解決了本發(fā) 明的目的，所迷方法包括
-向栽體中導(dǎo)入編碼標(biāo)記蛋白的第 一個核酸，
—向所述栽體中導(dǎo)入編碼要檢測和/或定量其表達的所迷靶蛋白候 選物的第二個核酸，從而使得所述第一個和第二個核酸可操作地連接， 從而使得所述標(biāo)記蛋白的表達指示所迷靶蛋白候選物的表達，
-向細(xì)胞中導(dǎo)入所述栽體，
-檢測和/或定量所迷標(biāo)記蛋白的表達，
-將所述標(biāo)記蛋白的表達與所迷靶蛋白候選物的表達聯(lián)系起來，且 由此檢測和/或定量所述耙蛋白候選物的表達。
在一個實施方案中，所迷第一個和第二個核酸通過下面的排列之一
8在所迷栽體內(nèi)可操作地連接
a) 所迷第一個核酸處于第一個啟動子的控制下，且所迷第二個核酸 處于第二個啟動子的控制下，所述第二個啟動子與所述第一個啟動子的
位置分開，并且所述第一個和第二個啟動子序列相同或者具有相同的活 性，
b) 所述第一個核酸處于第一個啟動子的控制下，且所迷第二個核酸 處于第二個啟動子的控制下，所述第二個啟動子與所述第一個啟動子的
位置分開，并且所述第一個和第二個啟動子序列不同，每個所述啟動子 的活性是可預(yù)測的，
c) 所迷第一個和所迷第二個核酸處于單個啟動子的控制下，并且所 述第一個和所述第二個核酸通過含有內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)的一段 核苷酸相互分開。
在一個實施方案中，所述標(biāo)記蛋白是熒光蛋白、抗體的片段、表位、 酶、單體抗生物素蛋白、肽生物素模擬物(mimic)、通過直接結(jié)合可 被檢測的肽或者通過與含有化學(xué)熒光團或者類似結(jié)構(gòu)的有機分子化學(xué) 結(jié)合或反應(yīng)從而使得產(chǎn)生光學(xué)上可檢測信號而被檢測的肽。
在一個實施方案中，所述IRES選自來自病毒的IRES、來自細(xì)胞 mRNAs的IRES,尤其來自如下病毒的IRES:小RNA病毒，如脊髓灰 質(zhì)炎病毒、EMCV和FMDV,黃病毒屬，如丙型肝炎病毒(HCV),痘病 毒屬，如經(jīng)典豬瘟病毒(CSFV),反轉(zhuǎn)錄病毒，如鼠白血病病毒(MLV), 慢病毒，如猿猴免疫缺陷病毒(SIV),和昆蟲RNA病毒，如蟋蟀麻痹 病毒(CRPV),和來自細(xì)胞mRNA的IRES,所迷mRNA如翻譯起始因子， 如elF4G，和DAP5，轉(zhuǎn)錄因子，如c-Myc,和NF-kB-抑制因子(NRF)， 生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF-2), 血小板衍生生長因子B(PDGF-B)，同源異形基因，如觸角足，存活蛋白， 如細(xì)胞凋亡的X連鎖的抑制劑(XIAP),和Apaf-l,和其他細(xì)胞mRNA， 如BiP。
在一個實施方案中，
-如果所述第一個和第二個啟動子序列相同，那么它們選自包含 CMV、 EF1、 SV40、人H1和U6啟動子的組，
-如果所述第一個和第二個啟動子具有相同活性，那么它們每個獨 立地選自包含CMV、 EF1、 SV40、人H1和U6啟動子的組，-如果所迷第一個和第二個啟動子序列不同并且所述啟動子的活
性是可預(yù)測的，那么每個所述啟動子獨立地選自包含CMV、EF1、 SV40、 人Hl和U6啟動子的組，
-所述單個啟動子選自包含CMV、 EF1、 SV40、人H1和U6啟動 子的組，并且所述IRES選自包含核酸的組，所述核酸具有選自包含SEQ IDNO: 1-15的組的序列。在優(yōu)選實施方案中，所述單個啟動子是CMV 啟動子并且所迷IRES來自EMCV。在尤其優(yōu)選的實施方案中，所述啟 動子是CMV立即早期(IE)啟動子(pCMVm)并且IRES來自EMCV; 優(yōu)選地，所述來自EMCV的IRES是具有選自SEQIDNO:9、 14和15, 更優(yōu)選14和15且最優(yōu)選M的序列的核酸。
在一個實施方案中，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)、 沖擊(ballistic)遞送將所迷栽體導(dǎo)入所述細(xì)胞中。
優(yōu)選地，通過能夠定量測量的任一種光學(xué)檢測方法，尤其具有空間 分辨率的光學(xué)檢測、顯微術(shù)、焚光激活細(xì)胞分選、UV-Vis光諳測定法、 焚光或磷光測量、生物發(fā)光測量進行所述檢測和/或定量，其中更優(yōu)選地， 所迷顯微術(shù)選自包含下述的組光學(xué)顯微術(shù)、亮視野顯微術(shù)、偏振光顯 微術(shù)、熒光顯微術(shù)，尤其共焦熒光顯微術(shù)、漸消波激發(fā)顯微術(shù)、焚光相 關(guān)光譜學(xué)、熒光壽命顯微術(shù)、熒光交叉相關(guān)顯微術(shù)、熒光漂白恢復(fù)顯微 術(shù)、行掃描成像、點掃描成像、結(jié)構(gòu)化照明、去褶合顯微術(shù)、光子計數(shù) 成像。
在一個實施方案中，所述把蛋白候選物和所述標(biāo)記蛋白在所迷細(xì)胞 中作為單獨的蛋白表達。
通過鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白的方法也解決了本發(fā)明的目的，所 迷方法包括步驟
-提供如下類型的第一個細(xì)胞，當(dāng)所述第一個細(xì)胞暴露于小分子調(diào) 節(jié)劑時能夠產(chǎn)生信號，其中所述信號是可以優(yōu)選通過顯微術(shù)在空間上分 辨并任選定量的信號，
-將所迷第一個細(xì)胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑，并在空間上分辨和任選 定量所述第一個細(xì)胞作為應(yīng)答所述小分子調(diào)節(jié)劑而產(chǎn)生的第一種信號，
-提供與所述第一個細(xì)胞相同類型的第二個細(xì)胞并
-對所述第二個細(xì)胞進行根椐權(quán)利要求1 -9任一項的方法，
-在對所迷第二個細(xì)胞進行根椐權(quán)利要求1 -9任一項的方法期間，將所述栽體導(dǎo)入所迷第二個細(xì)胞后，將所迷第二個細(xì)胞暴露于所迷小分 子調(diào)節(jié)刑，并在空間上分辨且任選定量所迷第二個細(xì)胞作為應(yīng)答所述小 分子調(diào)節(jié)劑而產(chǎn)生的第二種信號，
-比較所述第一種信號與第二種信號，并且如果所迷第一種信號與 第二種信號之間存在差異，那么將所述差異歸因于所述靶蛋白候選物在 所述第二個細(xì)胞中的表達，從而將所述靶蛋白候選物鑒定為所述小分子 調(diào)節(jié)劑的靶蛋白。
優(yōu)選地，所迷第一種信號與所述第二種信號是光學(xué)信號，其可以通 過顯微術(shù)檢測、在空間上分辨和任選定量，其中更優(yōu)選地，所述第一種 信號與所述第二種信號是熒光信號。
在一個實施方案中，所述標(biāo)記蛋白的表達產(chǎn)生第三種信號，其可以 在空間上分辨并且與所述第一種和第二種信號不同，其中優(yōu)選地，所述 第三種信號可以通過顯微術(shù)檢測、在空間上分辨和任選定量。
在優(yōu)選實施方案中，所迷第三種信號是熒光信號，并且所述第一種 和第二種信號是熒光信號，并且所述第三種信號與所述第一種和第二種 信號在光語上不同。
在一個實施方案中，所迷第一種信號與所迷第二種信號僅可以通過 它們各自的量相互區(qū)分。
優(yōu)選地，對于給定的小分子調(diào)節(jié)劑，用一種以上、優(yōu)選多種靶蛋白 候選物進行本發(fā)明的方法，其中，更優(yōu)選地，對于給定的小分子調(diào)節(jié)劑， 該方法用生物基因組的所有可能的靶蛋白候選物進行。
在一個實施方案中，用一種以上、優(yōu)選多種小分子調(diào)節(jié)劑進行本發(fā) 明的方法。
通過鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白的方法也解決的了本發(fā)明的目的，
所迷方法包括步驟
-提供如下類型的第一個細(xì)胞，當(dāng)所迷細(xì)胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑時 能夠產(chǎn)生信號，其中所迷信號是可以優(yōu)選通過顯微術(shù)在空間上分辨并任 選定量的信號，
-將所述第一個細(xì)胞暴露于小分子調(diào)節(jié)刑，并在空間上分辨和任選 定量所迷第一個細(xì)胞作為應(yīng)答所述小分子調(diào)節(jié)劑而產(chǎn)生的第一種信號， 在所述小分子調(diào)節(jié)劑的許多不同濃度下進行該步驟以確定所述小分子 調(diào)節(jié)劑的第 一 個半最大活性濃度(ACw)，其是不存在所迷靶蛋白候選物的表達抑制時的半最大活性濃度，
-測定所述第一個半最大活性濃度，
-提供與所述第一個細(xì)胞相同類型的第二個細(xì)胞并
-向所迷第二個細(xì)胞導(dǎo)入小抑制性RNA (siRNA),其經(jīng)選擇以便抑 制所述第二個細(xì)胞中靶蛋白候選物的表達，優(yōu)選用小抑制性RNA (siRNA)轉(zhuǎn)染所述第二個細(xì)胞，所述小抑制性RNA經(jīng)選擇以便抑制所迷 第二個細(xì)胞中靶蛋白候選物的表達，
-將所述第二個細(xì)胞暴露于所述小分子調(diào)節(jié)劑，并在空間上分辨和 任選定量所述第二個細(xì)胞作為應(yīng)答所迷小分子調(diào)節(jié)劑而產(chǎn)生的第二種 信號，在所迷小分子調(diào)節(jié)劑的許多不同濃度下進行該步驟以確定所述小 分子調(diào)節(jié)劑的第二個半最大活性濃度(AC5o),其是存在所述靶蛋白候選 物的表達抑制時的半最大活性濃度，
-測定所述第二個半最大活性濃度，
-比較所述第一個半最大活性濃度與所述第二個半最大活性濃度， 并且如果所述第一個半最大活性濃度與所迷第二個半最大活性濃度之 間存在差異，那么將所迷差異歸因于所述靶蛋白候選物表達的抑制，從 而將所述靶蛋白候選物鑒定為所迷小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白。
優(yōu)選地，所述第一個和第二個半最大活性濃度是半最大抑制濃度 (IC5o)，并且所迷小分子調(diào)節(jié)劑是抑制刑。
在另一實施方案中，所述第一個和第二個半最大活性濃度是半最大 增強濃度(EC5o)并且所述小分子調(diào)節(jié)劑是增強劑。
應(yīng)該注意，如本文所述的術(shù)語"半最大活性濃度(AC5G)"在一些實 施方案中也可以指另一活性比例。例如，它可以指"90。/。最大活性濃度 (AC9。)"或者可以用作有差別值的另一百分?jǐn)?shù)值，如60%、 70%或80%等 (AC6o、 AC7Q、 ACso等)。再次，在該情況下，該百分?jǐn)?shù)也可以應(yīng)用于術(shù) 語"ICx"和"ECx"，其中"x"表示最大活性濃度的前迷百分?jǐn)?shù)，并且其中 "IC"表示在該情況中小分子調(diào)節(jié)劑是抑制劑，且"EC"表示小分子調(diào)節(jié) 劑是增強劑。在優(yōu)選實施方案中，"半最大活性濃度"是具有等于或大 于最大值50%的活性的濃度，即，"ACyo"。
基因沉默是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且可以通過多種方法實現(xiàn)(在 Echeverri & Perrimon Nature, Reviews Genetics 2006中綜述)。
優(yōu)選地，所述第一種信號和所述第二種信號是光學(xué)信號，其可以通過顯微術(shù)檢測、在空間上分辨和任選定量。
更優(yōu)選地，所述第一種信號和所述第二種信號是熒光信號。
發(fā)明人已經(jīng)設(shè)法設(shè)計了允許通過鑒定調(diào)節(jié)小分子調(diào)節(jié)劑活性的那
些基因鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的大分子靶的方法，通過一組潛在靶cDNA的 表達，或者它們的表達的抑制來進行所述鑒定。具體地，小分子的分子 靶通過它們使小分子表型回轉(zhuǎn)或者加強該表型的能力來鑒定。與現(xiàn)有技 術(shù)中存在的勞動密集型生物化學(xué)方法相反，該方法允許靶鑒定而不需要 復(fù)雜的生物化學(xué)測定，且從而作為靶鑒定的全基因組方法(Peterson等 人，2006)。
具體地，在其中所述第一和所述第二核酸處于單個啟動子控制下， 且所述第一和所述第二核酸通過含有內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)的一 段核苷酸相互分開的實施方案中，本發(fā)明人已經(jīng)設(shè)法設(shè)計了尤其可用于 高含量篩選的系統(tǒng)，因為所述第一核酸的表達水平與所述第二核酸的表 達水平匹配^如本文所用的術(shù)語"核酸的表達水平"意指對應(yīng)于所迷核酸 的mRNA或蛋白質(zhì)的表達水平。在該"IRES實施方案"中，在來自所述 第一和所述第二核酸的每一個的表達和表達水平之間存在1關(guān)系。與 此相反，涉及兩種不同啟動子的使用的其他方法可以與許多問題相關(guān)。 例如，可以發(fā)生啟動子干擾現(xiàn)象，并且兩個核酸的可靠的共表達沒有保 證。因此，此種"雙啟動子方法"當(dāng)用于鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白方法 中時，盡管被本發(fā)明包括，但是與兩個核酸處于單個啟動子控制下并且 通過含有內(nèi)部核糖體進入位點的一段核苷酸相互分開的方法相比，是較 不優(yōu)選的。在例如雙啟動子方法中，與表達目的基因的轉(zhuǎn)錄單位不同的 轉(zhuǎn)錄單位上抗性基因的存在不能確保表達目的基因的轉(zhuǎn)錄單位將實際 上被抗性細(xì)胞表達。例如，如果目的基因?qū)?xì)胞增殖具有抑制作用，或 者具有細(xì)胞毒性作用，那么單獨的轉(zhuǎn)錄單位上的選擇壓力不能防止目的 基因的反選擇，其因此導(dǎo)致僅僅表達抗性基因的抗性克隆。"IRES方法" 不具有這些問題的任一種，并且因此，是該具體實施方案的優(yōu)點之一。
此外，關(guān)于涉及siRNA的本發(fā)明的另一方面，發(fā)明人已經(jīng)設(shè)計了一 種方法，其中通過測量靶基因沉默中的半最大活性濃度(AC50)的改變鑒 定小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白。在高含量篩選或高通量篩選的發(fā)明人已知的 所有現(xiàn)有技術(shù)方法中，沒有測量AC5o的此種改變，并且如果測量的話， 也僅僅測量了單點濃度。如果此種單點濃度測量在高濃度水平下進行，
13那么這通常導(dǎo)致高的假陽性率，即，此種方法根本不是靶特異的。同樣，
一些小分子調(diào)節(jié)劑可以在遠(yuǎn)高于它們的"正確"AC5o濃度下使用，在該情
況中，可以觀察到毒性作用并且可能檢測不到靶。此外，有時候關(guān)于此 種單濃度測量，有效使用的濃度可能太低，在該情況下不能檢測到作用 并且因此靶可以逃避它們的鑒定。本發(fā)明人已經(jīng)設(shè)計了一種方法，其中
通過進行AC5o滴定實驗，它們組合了 ACso的改變與表型的可滴定改變。 僅僅正確的靶改變AC5o并且因此可以與其他基因區(qū)分開，所述其他基 因在單點濃度測量中，有可能并且不正確地也表現(xiàn)為靶。所以，通過在 使用siRNA鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白的方法中進行ACso測量，本發(fā) 明人已經(jīng)設(shè)計了尤其可靠的高含量篩選方法。
如本文所用，術(shù)語"靶蛋白候選物"意指人們希望檢測和/或定量其 表達的任何蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，隨后懷疑此種蛋白是小分子化合物作用的 靶。術(shù)語"小分子化合物"和"小分子調(diào)節(jié)劑"被同義和可互換地使用。如 本文所用的"靶蛋白候選物"被懷疑是小分子調(diào)節(jié)劑的耙，但是還沒有 驗證此種懷疑。如果將"靶蛋白候選物"鑒定為小分子調(diào)節(jié)劑的實際耙， 那么此種"靶蛋白候選物"是所檢查的小分子調(diào)節(jié)劑的"靶蛋白"。
如本文所用的術(shù)語"可操作地連接"意指兩個編碼核酸相互的排列，
根椐一種核酸編碼的一種蛋白質(zhì)的表達的檢測和/或定量，人們可以推導(dǎo) 出另一核酸編碼的第二種蛋白質(zhì)的表達的存在和/或量。在最簡單形式 中，此種比例關(guān)系可以是線性關(guān)系，但是本發(fā)明不必局限于線性關(guān)系。 如本文所用的"內(nèi)部核糖體進入位點"或"IRES"意指編碼序列內(nèi)的 一段核苷酸，其允許此種編碼序列內(nèi)在mRNA水平上的翻譯起始。此種 IRES起始的翻譯得到的蛋白質(zhì)與這樣的蛋白質(zhì)不同，前一蛋白質(zhì)位于 后一蛋白質(zhì)的mRNA序列中。通常，在真核生物中，翻譯可以僅在mRNA 分子的5，末端起始，因為5，帽識別是起始復(fù)合物的裝配所需的。當(dāng)前認(rèn) 為IRES位點模擬5，帽結(jié)構(gòu)。此種IRES序列首先在RNA病毒中發(fā)現(xiàn)， 但是隨后已在許多生物中被鑒定。IRES位點位于RNA的5'非翻譯區(qū)并 且允許RNA以不依賴帽的方式翻譯。已經(jīng)鑒定了許多IRES位點，并且 其特征在于它們以不依賴帽的方式起始mRNA內(nèi)的翻譯的前迷能力。已 經(jīng)詳盡綜述了 IRES位點((Martinez-Salas等人，Journal of General Virology, 2001, Vol. 82, 973-984,和Jackson, R丄，Translational Control ofGene Expression, 2000, Sonenberg等人Eds.， pp. 127- 184， Cold Spring Harbor NY。此外，在http:〃www.iresite.org存在所鑒定的IRES位點的 定期更新的數(shù)據(jù)庫。
用于本發(fā)明方法中的尤其優(yōu)選的IRES位點是來自病毒RNA的 IRES，如小RNA病毒、黃病毒屬、痤病毒屬、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和 昆蟲RNA病毒，和來自細(xì)胞mRNA的IRES位點，如來自翻譯起始因 子、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、同源異形基因和存活蛋白。尤其優(yōu)選的IRES 位點是來自小RNA病毒和黃病毒屬如EMCV和HCV的IRES位點。用 于本發(fā)明的優(yōu)選的IRES位點是來自下述的IRES位點黑腹杲蠅 (Drosophilamelanogaster)觸角足、同源異形基因觸角足和超雙胸、人 c-myc癌基因、人v-myc髓細(xì)胞瘤病病毒相關(guān)癌基因、人髓磷脂轉(zhuǎn)錄因 子2(MYT2)人細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子l(Apaf-l)、人柯薩奇病毒B2林 20、腦心肌炎病毒(EMCV)、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹瀉病毒1型、 豬痘病毒(經(jīng)典豬瘟病毒)、和肝炎GB病毒B(GBV-B)。
更具體地，來自EMCV的IRES位點是尤其優(yōu)選的，其中優(yōu)選地， 所述來自EMCV的IRES是具有選自SEQ ID NO: 9、 14和15,更優(yōu)選 14和15,且最優(yōu)選14的序列的核酸。
成為本發(fā)明基礎(chǔ)的一個想法是編碼真核mRNA分子的兩個蛋白的 兩個核酸之間的IRES位點的排列作為雙順反子mRNA。在該情況中， 此種IRES位點可以獨立于結(jié)合到mRNA分子5'端的5'帽結(jié)構(gòu)驅(qū)動下游 蛋白質(zhì)編碼區(qū)的翻譯。在該設(shè)置中，兩種蛋白質(zhì)都在細(xì)胞中產(chǎn)生，并且 它們的表達是單一偶聯(lián)的。位于第一個順反子中的第一個蛋白質(zhì)通過依 賴于帽的起始方法合成，而第二個蛋白質(zhì)的翻譯起始受到位于兩個蛋白 質(zhì)編碼區(qū)之間的順反子間間隔區(qū)中的IRES位點的指導(dǎo)。
向細(xì)胞導(dǎo)入核酸的方法，如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo) 和/或沖擊遞送是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且例如在Sambrook和 Russell, 2006中綜迷。
如本文所用的"小分子調(diào)節(jié)劑，，意指不是蛋白質(zhì)并且分子量不超過 10,000的分子。在確定分子是否為"小分子調(diào)節(jié)劑"的過程中，考慮所 稱作的Lipinsky規(guī)則也是有幫助的。Christopher Lipinsky搜索負(fù)藥物設(shè) 計規(guī)則，并且制定了 5組參數(shù)規(guī)則以排除由于弱的吸收或滲透而不可能 成功的化合物。因此，根據(jù)Lipinsky氏規(guī)則，如果分子具有如下各項則不可能有效作為小分子藥物或調(diào)節(jié)劑
1. 大于5個氬鍵供體(通常NH和OH的總和)，
2. 大于10個氫鍵受體(通常N和O的總和)，
3. 分子量(MW)〉 500，
4. 計算的logP>,和
5. 弱4卬制(< 100 nM) (Lipinsky等人，1997， experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. ADV. Drug Delivery REV.23 (1-3)。 (P-疏水和親水環(huán)境之間分子的分配系數(shù)。然而，偏離這些Lipinsky規(guī) 則，如本文所用的"小分子調(diào)節(jié)劑"也具有〉500但是不超過10000的 分子量。更具體地，然而，如本文所用的"小分子調(diào)節(jié)劑"也指分子量 不超過10,000的寡肽或者寡核苷酸。
如杲小分子對蛋白質(zhì)的活性和/或細(xì)胞代謝和/或表型具有作用，那
么將此種小分子也在本文稱作"調(diào)節(jié)劑"。在實驗上，通常使用應(yīng)用于化
學(xué)文庫的高通量篩選方法鑒定蛋白質(zhì)的小分子調(diào)節(jié)劑。此種文庫可以在
固相或溶液相中開發(fā)并且可以由天然化合物和它們的衍生物或合成分
子組成(Hall等人，2001, J. Comb. Chem., 3: 125-150)。通常使用組合化學(xué)
產(chǎn)生化學(xué)文庫，從而，順序改變前體化合物的官能團和分子骨架(Burke
等人，2003, Science, 302:613-618; Schreiber, 2000, Science,
287:1964-1969)。已經(jīng)證明高通量篩選是有用的，特別在藥物發(fā)現(xiàn)、農(nóng) 用化學(xué)品和食物研究領(lǐng)域。
通常用于進行本發(fā)明方法的方法是顯微術(shù)。存在許多類型的顯微術(shù) 并且它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。術(shù)語"顯微術(shù)"包括但不限于光學(xué)顯 微術(shù)、共焦顯微術(shù)和自動化的顯微術(shù)篩選方法。顯微術(shù)的尤其優(yōu)選的形 式是熒光顯微術(shù)，尤其共焦熒光顯微術(shù)，光學(xué)顯微術(shù)、熒光壽命顯微術(shù)、 熒光交叉相關(guān)顯微術(shù)和偏振光顯微術(shù) 顯微術(shù)受到它的分辨本領(lǐng)的限 制，分辨本領(lǐng)由分辨率決定。通常，取決于使用的顯微術(shù)的具體類型， 分辨率界限是300 nm-10 pm,優(yōu)選300 nm-lnm。在該上下文中，如本 文所用的術(shù)語"空間分辨信號"意指信號在空間上的分辨率至低至300 nm-10nm，優(yōu)選300 nm-lpm的界限，且通常通過Abb6界限限定。在本 申請中，有時提及"提供如下類型的第一個細(xì)胞，..."和"提供如下類型的 第二個細(xì)胞，...，，。本領(lǐng)域枝術(shù)人員將清楚的是，在每個這些步驟中，可以提供一個以上的具體類型的細(xì)胞，并且所以，根據(jù)本發(fā)明的方法的 性能不限于僅僅使用單個細(xì)胞。實際上，根據(jù)本發(fā)明方法進行的許多實 驗將在細(xì)胞培養(yǎng)物上進行，其中細(xì)胞培養(yǎng)物中將存在特定類型的許多細(xì) 胞。所以，"提供如下類型的第一個細(xì)胞，..."和"提供如下類型的第二個 細(xì)胞，..."也可以用"提供如下類型的第一組細(xì)胞，..."和"提供如下類型 的第二組細(xì)胞，..."代替。
如本文所用，術(shù)語"siRNA"意指一段RNA，其可以用于沉默基因表 達和/或干擾基因的表達。所以，siRNA有時也被稱作"小干擾RNA"。 此種siRNA可以以多種方法導(dǎo)入細(xì)胞， 一種方法是用此種siRNA轉(zhuǎn)染 細(xì)胞。然而，在另一實施方案中，通過將siRNA首先導(dǎo)入細(xì)胞并允許其 在細(xì)胞中表達從而使得短發(fā)夾RNA實際上在細(xì)胞內(nèi)通過合適的栽體如 質(zhì)粒表達，可以實現(xiàn)此種基因沉默。
如本文所用的，術(shù)語"半最大活性濃度"或"AC5o"意指顯示出其 半最大活性的小分子調(diào)節(jié)劑濃度。例如，此種小分子調(diào)節(jié)劑可以是抑制 劑，在該情況下活性是抑制。因此，此種小分子抑制劑的半最大活性濃 度是"半最大抑制濃度"或"ic50"。如果小分子調(diào)節(jié)劑是增強劑，則此種 半最大活性濃度是"半最大增強濃度"或"EC5o"。
應(yīng)該指出，如本文所用的術(shù)語"半最大活性濃度(AC50)"在一些實 施方案中也可以指另一活性比例。例如，它可以指"90%最大活性濃度 (AC9o)"或者可以用作有差別值的另一百分?jǐn)?shù)值，如60%、 70%或80%等 (AC6q、 AC7Q、 ACso等)。再次，在該情況下，該百分?jǐn)?shù)也可以應(yīng)用于術(shù) 語"ICx"和"ECx"，其中"x"表示最大活性濃度的前述百分?jǐn)?shù)，并且其中 "IC"表示在該情況中小分子調(diào)節(jié)劑是抑制劑，且"EC"表示小分子調(diào)節(jié) 劑是增強劑。在優(yōu)選實施方案中，"半最大活性濃度"是具有等于或大 于最大值的50%活性的濃度，即，"AC25o"
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過檢查蛋白質(zhì)表達對基于細(xì)胞的測定的影響， 可能鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白，其中基于細(xì)胞的測定是基于細(xì)胞暴露 于小分子調(diào)節(jié)劑，作為該暴露的結(jié)果，細(xì)胞產(chǎn)生信號。依賴于靶蛋白候 選物的表達程度(或者表達的不存在)測量此種基于細(xì)胞的測定的結(jié)果。 如果靶蛋白候選物的表達或表達的不存在對基于細(xì)胞的測定的結(jié)果具 有可檢測的影響，那么其表達被人工誘導(dǎo)或增加或沉默的把蛋白候選物 是用于基于細(xì)胞的測定的小分子調(diào)節(jié)劑的靶。在下文參考附圖，其中


圖1顯示了細(xì)胞的共焦激光掃描顯微術(shù)照片，其中綠色熒光蛋白和
紅色熒光蛋白通過IRES位點可操作地連接，并且它們?nèi)我环N的表達都 可以用作IRES栽體中第二個插入片段的表達的度量；小圖A(左上角) 顯示了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中GFP熒光的共焦圖像，小圖B (右上角)是相同細(xì)胞 中RFP焚光的共焦圖像，且小圖C (左下角)顯示了 A和B中圖像的 比例圖像，代表GFP:RFP比的任意偽彩色比例尺。每個像素的GFP和 RFP強度之間的相關(guān)性在小圖D (右下角)中顯示，其中X軸上的GFP 強度對RFP焚光作圖。如本文所述，D中強度之間的相關(guān)性為0.92 +-0.023 (n=5)。
圖2顯示了三種IRES載體向內(nèi)皮縮血管肽A受體-GFP細(xì)胞系(GFP =綠色熒光蛋白)中的轉(zhuǎn)染和表達效果；"etar"是用內(nèi)皮縮血管肽A受 體:IRES:RFP載體(RFP =紅色熒光蛋白)轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細(xì)胞系，"etbr"是 用內(nèi)皮縮血管肽B受體:IRES:RFP栽體轉(zhuǎn)染的相同細(xì)胞系，且"kOPr" 是用k阿片樣物質(zhì)受體IRES:RFP載體轉(zhuǎn)染的相同細(xì)胞系(圖2a);
圖2B顯示了相同類型的實驗，但是這次用k阿片樣物質(zhì)受體GFP 細(xì)胞系形成；
圖3顯示了三種IRES栽體的轉(zhuǎn)染結(jié)果，每種栽體中具有不同的Got 蛋白質(zhì)組分Gas、 Gai和Gaq(Gs、 Gi和Gq)。 圖4顯示了使用IRES方法鑒定乾蛋白；
圖4A顯示了化合物G66976對激動劑誘導(dǎo)的內(nèi)皮縮血管肽A-受體 的內(nèi)化的作用的結(jié)果；(DMSO-二甲基亞砜，ET-l-內(nèi)皮縮血管肽-1);
圖4B顯示了用帶有蛋白激酶c-a或蛋白激酶c-卩的IRES:RFP構(gòu)建 體對內(nèi)皮縮血管肽A-受體-GFP細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果；
圖4c顯示了與圖4B相同的結(jié)果，但是這次將內(nèi)體數(shù)目對每種濃度 下的對照標(biāo)準(zhǔn)化(Go = G66976);
圖5顯示了高通量免疫熒光測定中NF-k-B核質(zhì)轉(zhuǎn)運的定量；
圖6顯示了平行實驗的結(jié)果，其中將細(xì)胞用特異性siRNA或者非特 異性雜亂siRNA轉(zhuǎn)染，并且測量細(xì)霉素敏感性NFk - B轉(zhuǎn)運，
圖7顯示了用于實施例1中利用紅色焚光蛋白和綠色焚光蛋白的實 驗中的構(gòu)建體的示意圖示，
圖8顯示了可以用于通過IRES位點連接的兩個蛋白質(zhì)插入片段的雙順反子表達的商業(yè)上可利用的栽體的實例。例如，可以使用可以從
Clontech Laboratories, Inc., USA商業(yè)上得到的商業(yè)上可利用的栽體 pIRES2-DsRed-Express-Vector?；蛘?，如果在限ES上游插入可測量/可 檢測的蛋白質(zhì)，如GFP或RFP，那么DsRed-Express-Gene,即紅色熒光 蛋白可以由任意其他目的基因代替。有商業(yè)上可利用的栽體，從而其在 IRES位點上游和下游具有多克隆位點，如Clontech Laboratories, Inc., USA的pIRES栽體。
圖9顯示了當(dāng)機理上相關(guān)的備選siRNA在與圖6中相同條件下被沉 默時，siRNA對細(xì)霉素B對NfkB的核輸入的ICso的作用。
此外，參考下面的序列，其中SEQIDNO: 1是來自NM—206445黑 腹果蠅觸角足CG1028-RJ轉(zhuǎn)錄變體J(Antp) mRNA的IRES。 IRES名稱 Antp-D (1323-1574， 252bp)，如Oh S. K., Scott M. P., Sarnow P. (1992) Homeotic gene Antennapedia mRNA contains 5'-noncoding sequences that confer translational initiation by internal ribosome binding. Genes. Dev. 6(9).' 1643-1653中引用。
SEQIDNO:2是IRES，名稱Antp-DE (1323-1730, 408bp),如Oh S. K., Scott M P.， Sarnow P. (1992) Homeotic gene Antennapedia mRNA contains 5'-noncoding sequences that confer translational initiation by internal ribosome binding. Genes, Dev. 6(9): 1643-1653，和Ye X., Fong P., lizuka N., Choate D., Cavener D. R. (1997) Ultrabithorax and Antennapedia 5' untranslated regions promote developmentally regulated internal translation initiation. Mol. Cell. Biol. 17(3): 1714-1721中引用，
SEQIDNO:3是IRES，名稱Antp-CDE (1-1730, 1730bp)，如Oh S. K.， Scott M. P.， Sarnow P. (1992) Homeotic gene Antennapedia mRNA contains 5'-noncoding sequences that confer translational initiation by internal ribosome binding. Genes. Dev. 6(9): 1643-1653,和Ye X., Fong P.， Iizuka N., Choate D.， Cavener D. R. (1997) Ultrabithorax and Antennapedia 5' untranslated regions promote developmentally regulated internal translation initiation. Mol. Cell. Biol. 17(3): 1714-1721中引用，
SEQ ID NO: 4是來自編碼c-myc癌基因的V00568人mRNA的 IRES。 IRES名稱c-myc(卜395, 395bp),如Stoneley M., Paulin F. E., Le Quesne丄P., Chappell S. A.， WUlis A. E. (1998) C-Myc 5' untranslatedregion contains an internal ribosome entry segment. Oncogene. 16(3):423-428中引用，
SEQ ID NO: 5是來自NM—005378智人(Homo sapiens) v-myc髓細(xì)胞 瘤病病毒相關(guān)癌基因，成神經(jīng)細(xì)胞瘤來源的(烏)(MYCN)， mRNA的 IRES。
IRES名稱N-myc (989-1308, 319bp),如Jopling C， L.， Willis A. E. (2001) N-myc translation is initiated via an internal ribosome entry segment that displays enhanced activity in neuronal cells. Oncogene. 20(21 ):2664-2670中引用，
SEQ ID NO: 6是來自AF006822智人髓磷脂轉(zhuǎn)錄因子2 (MYT2) mRNA完整cds的IRES，
限ES名稱MYT2_997-1152 (997-1152， 156bp)，如Kim J. G.， Armstrong R. C, Berndt J. A.， Kim N. W., Hudson L. D. (1998) A secreted DNA- binding protein that is translated through an internal ribosome entry site (IRES) and distributed in a discrete pattern in the central nervous system. Mol. Cell. Neurosci. 12(3): 119-140中引用，
SEQ ID NO: 7是來自AF013263智人細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子 l(Apaf-l) mRNA完整cds的IRES。 IRES名稱Apaf-1 (345-577, 233bp)， r^口 Coldwell M. J., Mitchell S. A., Stoneley M.， MacFarhne M.， Willis A. E. (2000) Initiation of Apaf-1 translation by internal ribosome entry. Oncogene. 19(7):899-905中引用，
SEQ IDNO: 8是來自AY752946人柯薩奇病毒B3抹20的完整基因 組的IRES。 IRES名稱CVB3 (1-750, 750bp),如Jang G. M.， Leong L. E., Hoang L. T.， Wang P. H., Gutman G. A.， Semler B. L. (2004) Structurally distinct elements mediate internal ribosome entry within the 5'-noncoding region of a voltage-gated potassium channel mRNA.丄 Biol. Chem. 279(46):47419-47430，和Jimenez J., Jang G. M.， Semler B. L.， Waterman M. L. (2005) An internal ribosome entry site mediates translation of lymphoid enhancer factor-1. RNA. 11(9): 1385-1399中引用，
SEQ ID NO: 9是來自NC—001479腦心肌炎病毒完整基因組的 IRES。 IRES名稱EMCV (257-832, 576bp)，如Wang Z., Weaver M.， Magnuson N. S. (2005) Cryptic promoter activity in the DNA sequencecorresponding to the pim-1 5'-UTR. Nucleic Acids Res. 33(7):2248-2258中引用，SEQ ID NO: 10是來自NC—003924蟋蟀麻瘠病毒完整基因組的 IRES。 IRES名稱CrPV—5NCR (〗-708， 708bp)，如Wilson丄E., Powell M.丄，Hoover S. E., Samow P. (2000) Naturally occurring dicistronic cricket paralysis virus RNA is regulated by two internal ribosome entry sites. Mol. Cell. Biol. 20(14):4990-4999中引用，SEQ ID NO: 11來自NC—001461牛病毒性腹瀉病毒1完整基因組的 IRES。 IRES名稱BVDV1—1-385 (1-385, 385bp),如Chon S. K., Perez D. R.， Donis R. O. (1998) Genetic analysis of the internal ribosome entry segment of bovine viral diarrhea virus. Virology. 251 (2):370-382中引用，SEQ ID NO: 12是來自Z46258豬瘟病毒(經(jīng)典豬瘟病毒)"中國，，林 (C-林;EP 0 351 901 Bl)編碼多蛋白的IRES。 IRES名稱:CSFV(l-373, 373bp)，如Rijnbrand R.， Bredenbeek P. J., Haasnoot P. C， Kieft丄S.， Spaan W.丄，Lemon S. M. (2001) The influence of downstream protein-coding sequence on internal ribosome entry on hepatitis C virus and other flavivirus RNAs. RNA. 7(4):585-597中引用，SEQ ID NO: 13是來自NC 001655肝炎GB病毒B完整基因組的 IRES， RES名稱GBV-B (1023-1467， 445bp)，如RijnbrandR., Abell G.， Lemon S. M. (2000) Mutational analysis of the GB virus B internal ribosome entry site. J. Virol. 74(2):773-783中引用。SEQ ID NO: 14是來自如用于下面實施例的EMCV的IRES,和SEQ !DNO: 15是來自如ww.iresite.org中公開的EMCV的IRES。此外，參考下面的實施例，給出這些實施例用于闡明而不是限制本 發(fā)明。實施例 實施例1蛋白質(zhì)功能的基于細(xì)胞的測定和蛋白質(zhì)表達的定量 激動劑誘導(dǎo)的受體內(nèi)化 設(shè)計和應(yīng)用蛋白質(zhì)功能-如激動劑誘導(dǎo)的G蛋白偶聯(lián)受體內(nèi)化-的基于細(xì)胞的測定，從而使得可以在高含量(視覺)測定中測量或顯現(xiàn) 并測量蛋白質(zhì)的希望的活性。通常，對于激動劑誘導(dǎo)的受體內(nèi)化，這可 以包括視覺鑒定作為細(xì)胞群體的部分的其中受體被內(nèi)化的細(xì)胞。這可以 例如通過計算機輔助圖像識別定量。該測定可以是使用與受體的融合蛋 白，其可以在細(xì)胞中表達并且在顯微鏡中直接顯現(xiàn)，如綠色熒光蛋白(GFP)。它也可以是這樣的測定，其中通過間接方法如免疫標(biāo)記或者 使用熒光激動刑顯現(xiàn)內(nèi)源細(xì)胞受體。測定細(xì)胞系通常是被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的。 在一個實施方案中，使用488 nM激發(fā)和合適的發(fā)射光濾光器顯現(xiàn)受體測定。該概念給出了檢查蛋白質(zhì)表達(靶)對測定的影響的下述方法。耙 與轉(zhuǎn)錄上相關(guān)的報道分子表達，所迷報道分子的光諍與用于測定法中的 報道分子不同。這樣設(shè)計從而使得在靶表達和報道分子表達之間接近線 性相關(guān)。實現(xiàn)其的方法包括使用內(nèi)部核糖體進入位點、驅(qū)動l巴和報道分的情況下，報道;子的表達是-量耙表4的測量/表達尺:這里，本發(fā)明人描述了使用內(nèi)部核糖體進入位點。如下進行實驗根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程將靶::報道分子構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染到測 定細(xì)胞中(如陽離子脂質(zhì)DNA復(fù)合體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、基于 聚合物的轉(zhuǎn)染方法、樹狀聚體，如Sambrook和Russell， Molecular Cloning 第三版，第16章.CSH press. 2001所述)。這些方法不是高度有效的并 且因此檢測到 一 系列報道分子表達。這提供了在可測量的水平上表達革巴 的一系列細(xì)胞并從而通過在不同水平表達靶的細(xì)胞中顯現(xiàn)該測定可以 測定表達的影響。從而，由于顯微術(shù)的基于細(xì)胞的分辨率，其允許薟定 單個細(xì)胞，所以細(xì)胞轉(zhuǎn)染的通常的缺點被用作優(yōu)點。這樣，該測定在未 被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中和在被轉(zhuǎn)染并且表達靶的細(xì)胞中在單個實驗圖像中的 一系列濃度下測量。 、將綠色熒光蛋白的拷貝插入內(nèi)部核糖體進入栽體，從而使得IRES 和紅色熒光蛋白(dsRED表達-在下文中稱作RFP的單體紅色熒光蛋 白)處于它的下游(圖7)。將HEK293細(xì)胞用該栽體瞬時轉(zhuǎn)染，其中 插入片段的表達受到pCMV啟動子的控制(也見圖8),然后使用適于 單獨定量兩種焚光團表達的激發(fā)(488/532nm)和檢測光學(xué)器件，通過每個 視野大于25個細(xì)胞的共焦激光掃描顯微術(shù)測量綠色和紅色熒光蛋白的熒光強度(圖1) 在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的共焦圖像中的GFP和RFP強度之間， 所測定的相關(guān)系數(shù)為0.91 +- 0.023 (n=5)，從而表明RFP或者GFP表達 可以用作IRES栽體中其他各自的插入片段的表達的測量。將一系列cDNA克隆到IRES:RFP栽體中，該栽體編碼a)G蛋白偶 聯(lián)受體，b)小G蛋白或者c)蛋白激酶。用于這些和所有隨后實驗中的 IRES的序列是SEQIDNO: M，其是來自EMCV的IRES。最初，IRES 栽體在細(xì)胞系中瞬時表達，所述細(xì)胞系穩(wěn)定表達內(nèi)皮縮血管肽A受體和 綠色熒光蛋白的c-末端拷貝之間的融合蛋白。通過監(jiān)控用IRES栽體轉(zhuǎn) 染后表達RFP的細(xì)胞，向該細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率為細(xì)胞的約50%。這些 栽體包含IRES和RFP 5'的編碼內(nèi)皮縮血管肽B受體、K阿片樣物質(zhì)受 體或者內(nèi)皮縮血管肽A受體的cDNA。然后測量異源/外部受體的表達對 激動刑誘導(dǎo)的內(nèi)皮縮血管肽A受體的內(nèi)化的作用。用40 nM內(nèi)皮縮血管 肽-1刺激細(xì)胞后2小時，使用自動化共焦顯微鏡使細(xì)胞成像。在細(xì)胞 系中穩(wěn)定表達的GFP標(biāo)記的內(nèi)皮縮血管肽A受體的圖像然后可以用于 測定已經(jīng)發(fā)生受體胞吞的細(xì)胞的分?jǐn)?shù)并用RFP圖像確定相同圖像中 IRES栽體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中GFP標(biāo)記的內(nèi)皮縮血管肽A受體的胞吞作用的 程度。這用單盲手工計數(shù)和自動化圖像分析，使用商業(yè)圖像分析包中的定 制日志進行(Metamorph offline, Molecular Devices, CA) 將細(xì)胞鑒定為對 照(非RFP表達者)或表達者(RFP生產(chǎn)者)，并基于圖像中積分的 RFP強度/像素將表達者細(xì)胞進一步分為低、中等和高表達者類別。顯示 受體內(nèi)化的細(xì)胞數(shù)目在這四類中自動計數(shù)并表示為每個類別中細(xì)胞總 數(shù)的分?jǐn)?shù)。a) 三個IRES栽體單獨轉(zhuǎn)染到內(nèi)皮縮血管肽A受體-GFP細(xì)胞系 內(nèi)皮縮血管肽A受體:IRES:RFP,內(nèi)皮縮血管肽B受體:IRES:RFP,和k 阿片樣物質(zhì)受體IRES:RFP。當(dāng)與相同圖像中的對照細(xì)胞相比時， ETAR:1RES:RFP表達對ETAR-GFP內(nèi)化具有最小的作用，而內(nèi)皮縮血管 肽B受體和k阿片樣物質(zhì)受體都顯著減小了 ETAR-GFP內(nèi)化作用(圖 2A)。這表明蛋白質(zhì)表達本身是篩選途徑中涉及的蛋白質(zhì)的可行方法。b) 為了闡明該方法在整個測定中具有選擇性，將其用K阿片樣物質(zhì) 受體-GFP細(xì)胞系重復(fù)，其中在使用IRES栽體表達的任何受體的激動劑 誘導(dǎo)的阿片樣物質(zhì)受體內(nèi)化的測定中沒有測定到顯著差異(圖2 B)。為了進一步確定表達的有用性，構(gòu)建IRES:RFP栽體用于表達異源 三聚G蛋白的三種G-a蛋白質(zhì)組分Gas、 Gai和G叫。在ETAR-GFP 細(xì)胞系中表達時，與僅表達RFP的對照細(xì)胞系相比，兩種G蛋白顯著 降低了內(nèi)化(Gas、 Gai),而Gq沒有顯著作用(圖3A )。這證明該表達分析策略對于受體和小信號傳導(dǎo)蛋白發(fā)揮功能。 c)將包含插入1RES:RFP的5，的蛋白激酶C同工型，蛋白激酶Ca 或者蛋白激酶C卩的一系列栽體轉(zhuǎn)染到內(nèi)皮縮血管肽A-受體-GFP融 合蛋白穩(wěn)定細(xì)胞系中。如圖4中所示，當(dāng)與用在IRES之前不具有5，插白激酶C同工型的表達在內(nèi)皮縮血管肽A-受體融合蛋白的激動劑誘導(dǎo) 的內(nèi)化中沒有引起顯著改變。實施例2 小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白的鑒定 本發(fā)明人確定IRES方法也可以用于鑒定化合物的靶蛋白。 當(dāng)細(xì)胞暴露于微摩爾濃度的化合物G66976 (圖4A)時，內(nèi)皮縮血管肽A受體的激動刑誘導(dǎo)的內(nèi)化被阻斷>85%，所述化合物G66976是蛋白激酶C抑制劑(Martiny-Baron等人，1993)。蛋白激酶C具有許多同工型并且為了確定蛋白激酶Ca或蛋白激酶C卩同工型是否可以是內(nèi)皮縮血管肽A受體內(nèi)化測定中G06976的靶，用帶有蛋白激酶Ca或蛋白激酶C卩的IRES:RFP構(gòu)建體轉(zhuǎn)染ETAR-GFP細(xì)胞。用標(biāo)準(zhǔn)方法(如Sambrook和Russell, 2006中綜述)，尤其脂轉(zhuǎn)染， 使用商業(yè)上可利用的方法和規(guī)程，如Roche Fugene6、把系統(tǒng)targefect 和其變型、lipofectamine等等轉(zhuǎn)染細(xì)胞。然后將包含轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和未轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞的細(xì)胞暴露于漸增濃度范圍的G66976,用激動劑內(nèi)皮縮血管 肽-1刺激細(xì)胞。通過半自動化圖像分析測定表達RFP的轉(zhuǎn)染細(xì)胞群體 與它們的對照的未轉(zhuǎn)染鄰近細(xì)胞相比，每個細(xì)胞的內(nèi)體數(shù)目 一作為內(nèi)皮 縮血管肽A受體活性的測量。使用自動化共焦顯微術(shù)，在G06976的整個實驗濃度范圍中相同的 視野中將蛋白激酶Ca在PKCa:IRES:RFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的表達的作用和 對照的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞進行比較。通常，首先將細(xì)胞暴露于1%血清培養(yǎng)基中某一濃度范圍的G66976 120分鐘，然后將培養(yǎng)基交換成含有相同濃 度G66976但是補加激動劑(10倍激動劑EC50: 40 nM)的培養(yǎng)基。溫育 后，用自動化高通量共焦顯微鏡使細(xì)胞成像(如，來自Evotec Technologies, Hamburg的Opera)。與光諳上單獨的RFP表達者細(xì)胞的 圖像一樣，獲得了限定內(nèi)皮縮血管肽A-受體-GFP分布的圖像。比對 每個細(xì)胞視野的兩色圖像以校正光學(xué)暈映圖像、機械失調(diào)(約l-3(tim的 XY移位；Metamorph Offline, Molecular devices corporation),將非RFP 表達者細(xì)胞定義為圖像中的對照群體并將RFP表達者細(xì)胞分段并基于 每個細(xì)胞的平均RFP強度分離為低、中等和高(較低20%，中值，較 高20% )表達者。如所預(yù)期的，隨著G66976濃度的升高，對照細(xì)胞中每個細(xì)胞的內(nèi) 體數(shù)目顯著減少(圖4B，左邊)。在表達PKCa:IRES:RFP的細(xì)胞中觀 察到類似的減少(圖4B，左邊)，從而表明蛋白激酶Ca沒有逆轉(zhuǎn)化合 物G66976的作用。相反，PKC(3:IRES:RFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞中蛋白激酶C卩的 表達的作用是不同的。盡管升高G。6976濃度減少了對照細(xì)胞中內(nèi)體的 數(shù)目，但是即使在最高濃度的G66976下，在表達PKCp:IRES:RFP的細(xì) 胞中也產(chǎn)生了內(nèi)體(圖4B)。從而，將蛋白激酶C卩鑒定為該測定中 Gd6976的靶,因為它提供了"功能獲得"并且逆轉(zhuǎn)了 G66976的表型和作 用。當(dāng)將每種濃度下的內(nèi)體數(shù)目對對照標(biāo)準(zhǔn)化時，有力地證明了將蛋白 激酶C卩鑒定為G06976的靶(圖4C)。如在圖4C中清楚的，使用該 系統(tǒng)的蛋白激酶Ca表達和分析沒有逆轉(zhuǎn)G06976的作用，而是蛋白激酶 C卩表達逆轉(zhuǎn)了表型并且因此是該測定中G06976的靶。實施例3使用siRNA鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的耙蛋白 轉(zhuǎn)錄因子核因子kB的核轉(zhuǎn)運 除了上述包含作為藥物靶的"功能獲得"篩選的基因表達的方法，本 發(fā)明人還證明一種方法，其中用RNA干擾降低蛋白質(zhì)表達且然后通過 給出該測定的50%抑制所需的化合物的AC50/IC50濃度的改變確定這 是否是所研究藥物的靶。這是"功能失去"篩選。在核轉(zhuǎn)運作為原理論證(proof of principle)的情況下，使用內(nèi)源表達的NF-kB復(fù)合體的高通量免疫焚光檢測測量轉(zhuǎn)錄因子核因子kB的轉(zhuǎn) 運。簡言之，將Hela細(xì)胞用PBS洗滌兩次，然后用溶于PBS中的4% (w/v) 低聚曱醛固定IO分鐘，然后用PBS洗涂。用0,1%TX-100 PBS進行透 化作用IO分鐘，然后將細(xì)胞用PBS洗滌并與10%山羊血清-PBS中兔抗 NF-kB的1:200稀釋物在4。C過夜溫育。在定軌旋轉(zhuǎn)器上用PBS洗滌板 3次，進行10分鐘。在室溫下將1:1000 Alexa-488山羊抗兔第二抗體與 細(xì)胞溫育60分鐘，在定軌搖床上用PBS洗滌細(xì)胞3次，進行10分鐘， 然后在37。C下加入溶于PBS中的5|tiM DRAQ5 (DRAQ5 -核染料)保持 10分鐘。細(xì)霉素B用于阻斷核轉(zhuǎn)運并得到2 ng/mL或4.4 nM的IC50(圖5 )。 通過靶向核輸出蛋白1序列的小抑制RNA的轉(zhuǎn)染降低核輸出蛋白核輸 出蛋白1/CRM1的表達，并如上述評估細(xì)霉素B對NFKB轉(zhuǎn)運的作用。 平行地使用GFP表達者穂定細(xì)胞系中GFP的沉默作為水準(zhǔn)點，估計使 用siRNA的核輸出蛋白1/CRM 1擊倒為50% (未顯示)。與用和人基 因沒有已知的同源性的雜亂siRNA轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞相比，核輸出蛋白 1/CRM擊例細(xì)胞中細(xì)霉素B的IC50被顯著降低-降低至小于1/10 (圖 6)。因此，如從文獻預(yù)測的(Fornerod等人，1997)，將CRMl/核輸出蛋 白1鑒定為細(xì)霉素B的靶，從而確定該靶鑒定方法是可行的，并且將在 全基因組篩選的更大背景中發(fā)揮功能。更具體地，圖5顯示了通過高通量免疫熒光測定對NF-KB核質(zhì)轉(zhuǎn)運 的定量。(a)在固定并用抗NF-kB和Alexa 488第二抗體檢測，且用lOpM Draq5進行核染色前，細(xì)胞質(zhì)NF-kB在用0 (左圖)、1 ng/mL (中間的 圖)或20 ng/mL細(xì)霉素B處理40分鐘的HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核中積累。定 標(biāo)線條20 pnu (b)模擬的細(xì)胞核定位圖像，紅色代表代表細(xì)胞核，綠 色代表NF-kB定位，其中NF-kB的細(xì)胞質(zhì)分布在從左到右的XZ (上面 行)和XY (中央行)模擬圖像系列中的細(xì)胞核上顯示形態(tài)(morph)。 下面行顯示了O、 1、 5、0、 20ng/mL細(xì)霉素B處理后細(xì)胞的標(biāo)記，綠 色NF-KB標(biāo)記覆蓋在從左到右的核染料上。定標(biāo)線條5iiM。 (c)模擬 圖像(上圖)和細(xì)胞圖像(下圖)上核輸入的定量，(d)微量滴定板 中與0-20 ng/mL細(xì)霉素B溫育、NF-kB的檢測和細(xì)胞核染色后在NF-kB 的細(xì)胞核定位方面細(xì)霉素的EC50測定。細(xì)霉素B的擬合的EC50為2.4 ng/mL,在1.9到3ng/mL的95yo置信區(qū)間內(nèi)，R2為0.9957并且是〉5次測定的代表值。在自動化共焦顯微鏡(confocal)上獲得所有圖像。圖6顯示了通過高通量免疫焚光測定對NF-KB核質(zhì)轉(zhuǎn)運的定量。將 細(xì)胞用crml特異性或雜亂siRNAs轉(zhuǎn)染并在24小時后測量細(xì)霉素敏感 性NFkB轉(zhuǎn)運。LMB曲線用graphpad prism擬合并具有〉0,95的R2。在 自動化共焦顯微鏡上獲得所有圖像。(UvlB-細(xì)霉素B)。實施例4圖9顯示了當(dāng)在與實施例3中上述相同的條件下沉默機理上不相關(guān) 的備選siRNA時，siRNA對細(xì)霉素B對NficB的細(xì)胞核輸入的ICso的作 用。如實施例3中一樣，使用高通量免疫焚光檢測內(nèi)源表達的NFKB復(fù) 合體來測量轉(zhuǎn)錄因子核因子kB的轉(zhuǎn)運 簡言之，將Hela細(xì)胞用PBS洗 滌兩次，然后用溶于PBS中的4%(w/v)低聚甲醛固定IO分鐘，然后用 PBS洗滌。用0.1%TX-100 PBS進行透化10分鐘，然后將細(xì)胞用PBS 洗滌，然后與10。/()山羊血清-BPS中的兔抗NF-kB的1:200稀釋物在4。C 過夜溫育。在定軌旋轉(zhuǎn)器上用PBS洗滌板3次，進行IO分鐘。將1:1000 的Aiexa-488山羊抗兔第二抗體與細(xì)胞在室溫溫育60分鐘，在定軌搖床 上用PBS洗滌細(xì)胞3次，進行10分鐘，然后在37。C加入溶于PBS中的 5pM DRAQ5 (DRAQ5 -核染料)保持10分鐘 細(xì)霉素B用于阻斷核轉(zhuǎn)運，并測量ICs()。在沉默實驗中，使用雜亂 siRNA或者靶向綠色熒光蛋白或蛋白激酶C同工型的siRNA。顯示了使 用對照雜亂siRNA、緣色焚光蛋白或蛋白激酶C同工型的沉默表達。圖9的數(shù)椐證明進行該實驗實現(xiàn)了特異性。沉默一系列其他cDNAs 沒有給出表型并且對lCs(j沒有作用。在與實施例3所迷相同的沉默條件 下進行圖9的實驗。參考文獻
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Sambrook and Russell' Molecular Cloning 3rd, edition chapter 16, CSH press 2001
本說明書、權(quán)利要求書和/或附圖中公開的本發(fā)明的特征可以單獨或 以其任意組合對于以多種形式實現(xiàn)本發(fā)明是重要的。
權(quán)利要求
1. 檢測和/或定量細(xì)胞中靶蛋白候選物表達的方法，包括步驟-向載體中導(dǎo)入編碼標(biāo)記蛋白的第一個核酸，-向所述載體中導(dǎo)入編碼要檢測和/或定量其表達的所述靶蛋白候選物的第二個核酸，從而使得所述第一個和第二個核酸可操作地連接，從而使得所述標(biāo)記蛋白的表達指示所述靶蛋白候選物的表達，-向細(xì)胞中導(dǎo)入所述載體，-檢測和/或定量所述標(biāo)記蛋白的表達，-將所述標(biāo)記蛋白的表達與所述靶蛋白候選物的表達聯(lián)系起來，且由此檢測和/或定量所述靶蛋白候選物的表達。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一個和第二個核酸通過下面 的排列之一在所述栽體內(nèi)可操作地連接a) 所迷第一個核酸處于第一個啟動子的控制下，且所迷第二個核酸 處于第二個啟動子的控制下，所述第二個啟動子與所迷第一個啟動子的位置分開，并且所迷第一個和第二個啟動子序列相同或者具有相同的活 性，b) 所述第一個核酸處于第一個啟動子的控制下，且所述第二個核酸 處于第二個啟動子的控制下，所述第二個啟動子與所述第一個啟動子的位置分開，并且所述第一個和第二個啟動子序列不同，且每個所迷啟動 子的活性是可預(yù)測的，c) 所述第一個和所述第二個核酸處于單個啟動子的控制下，并且所 述第一個和所述第二個核酸通過含有內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)的一段 核普酸相互分開。
3. 根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所述標(biāo)記蛋白是焚光蛋 白、抗體的片段、表位、酶、抗生物素蛋白、肽生物素模擬物、通過直分子化;結(jié)合或反應(yīng)而使得/生光學(xué)上可檢測信5號而被檢測的肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2-3任一項的方法，其中所述IRES選自來自病 毒的IRES、來自纟田胞mRNAs的IRES，尤其來自如下病毒的限ES:小 RNA病毒，如脊髄灰質(zhì)炎病毒、EMCV和FMDV，黃病毒屬，如丙型 肝炎病毒(HCV),瘟病毒屬，如經(jīng)典豬瘟病毒(CSFV),反轉(zhuǎn)錄病毒，如 鼠白血病病毒(MLV)，慢病毒，如猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，和昆蟲RNA病毒，如蟋蟀麻痹病毒(CRPV)，和來自細(xì)胞mRNA的IRES，所迷 mRNA如翻譯起始因子，如elF4G,和DAP5，轉(zhuǎn)錄因子，如c-Myc，和 NF-kB-抑制因子(NRF)，生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),成纖 維細(xì)胞生長因子2(FGF-2),血小板衍生生長因子B(PDGF-B)，同源異形 基因，如觸角足，存活蛋白，如細(xì)胞凋亡的X連鎖的抑制劑(XIAP)，和 Apaf-l,和其他細(xì)胞mRNA,如BiP。
5. 根椐權(quán)利要求2-4任一項的方法，其中-如果所述第一個和第二個啟動子序列相同，那么它們選自包含 CMV、 EF1、 SV40、人H1和U6啟動子的組，-如果所述第一個和第二個啟動子具有相同活性，那么它們每個獨 立地選自包含CMV、 EF1、 SV40、人H1和U6啟動子的組，-如果所述第一個和第二個啟動子序列不同并且所述啟動子的活性 是可預(yù)測的，那么每個所述啟動子獨立地選自包含CMV、 EF1、 SV40、 人H1和U6啟動子的組，-所迷單個啟動子選自包含CMV、 EF1、 SV40、人H1和U6啟動 子的組，并且所述IRES選自具有選自包含SEQ ID NO: 1-15的組的序列 的核酸。
6. 根椐前面權(quán)利要求任一項的方法，其中通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔、 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)、沖擊遞送將所述栽體導(dǎo)入所迷細(xì)胞中。
7. 根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中通過能夠定量測量的任一 種光學(xué)檢測方法，尤其具有空間分辨率的光學(xué)檢測、顯微術(shù)、熒光激活 細(xì)胞分選、UV- Vis光傳測定法、熒光或磷光測量、生物發(fā)光測量進行 所述檢測和/或定量。
8. 根椐權(quán)利要求7的方法，其中所述顯微術(shù)選自包含下述的組光 學(xué)顯微術(shù)、亮視野顯微術(shù)、偏振光顯微術(shù)、熒光顯微術(shù)，尤其共焦熒光 顯微術(shù)、漸消波激發(fā)顯微術(shù)、熒光相關(guān)光語學(xué)、熒光壽命顯微術(shù)、熒光 交叉相關(guān)顯微術(shù)、熒光漂白恢復(fù)顯微術(shù)、行掃描成像、點掃描成像、結(jié) 構(gòu)化照明、去褶合顯微術(shù)、光子計數(shù)成像。
9. 根據(jù)前面權(quán)利要求任一項的方法，其中所迷靶蛋白候選物和所迷 標(biāo)記蛋白在所迷細(xì)胞中作為單獨的蛋白表達。
10. 鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白的方法，所述方法包括步驟-提供如下類型的第一個細(xì)胞，當(dāng)所迷第一個細(xì)胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑時能夠產(chǎn)生信號，其中所迷信號是可以優(yōu)選通過顯微術(shù)在空間上分 辨并任選定量的信號，-將所迷第一個細(xì)胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑，并在空間上分辨和任選 定量所述第一個細(xì)胞作為應(yīng)答所述小分子調(diào)節(jié)劑而產(chǎn)生的第一種信號，-提供與所迷第一個細(xì)胞相同類型的第二個細(xì)胞并-對所述第二個細(xì)胞進行根據(jù)權(quán)利要求1 - 9任一項的方法， -在對所述第二個細(xì)胞進行根據(jù)權(quán)利要求1 -9任一項的方法期間， 將所述栽體導(dǎo)入所述第二個細(xì)胞后，將所述第二個細(xì)胞暴露于所述小分 子調(diào)節(jié)劑，并在空間上分辨且任選定量所述第二個細(xì)胞作為應(yīng)答所述小 分子調(diào)節(jié)劑而產(chǎn)生的第二種信號，-比較所迷第一種信號與所迷第二種信號，并且如果所迷第一種信 號與所述第二種信號之間存在差異，那么將所述差異歸因于所述靶蛋白 候選物在所述第二個細(xì)胞中的表達，從而將所述靶蛋白候選物鑒定為所 迷小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白。
11. 根據(jù)權(quán)利要求IO的方法，其中所迷第一種信號與所述第二種信 號是光學(xué)信號，其可以通過顯微術(shù)檢測、在空間上分辨和任選定量。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所迷第一種信號與所迷第二種信 號是熒光信號。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10-12任一項的方法，其中所述標(biāo)記蛋白的表達 產(chǎn)生第三種信號，其可以在空間上分辨并且與所述第一種和第二種信號 不同。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述第三種信號可以通過顯微術(shù) 檢測、在空間上分辨和任選定量。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述第三種信號是熒光信號，并 且所述第一種和第二種信號是熒光信號，并且所述第三種信號與所述第 一種和第二種信號在光語上不同。
16. 根椐權(quán)利要求11 - 15任一項的方法，其中所述第一種信號與所 迷第二種信號僅可以通過它們各自的量相互區(qū)分。
17. 根據(jù)權(quán)利要求10-16任一項的方法，其對于給定的小分子調(diào)節(jié) 刑，用一種以上、優(yōu)選多種靶蛋白候選物進行。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其對于給定的小分子調(diào)節(jié)劑，用生物 基因組的所有可能的靶蛋白候選物進行。
19. 根椐權(quán)利要求10-18任一項的方法，其用一種以上、優(yōu)選多種小分子調(diào)節(jié)劑進行。
20. 鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白的方法，所述方法包括步驟-提供如下類型的第一個細(xì)胞，當(dāng)所述細(xì)胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑時 能夠產(chǎn)生信號，其中所述信號是可以優(yōu)選通過顯微術(shù)在空間上分辨并任 選定量的信號，-將所迷第一個細(xì)胞暴露于小分子調(diào)節(jié)劑，并在空間上分辨和任選 定量所迷第一個細(xì)胞作為應(yīng)答所迷小分子調(diào)節(jié)劑而產(chǎn)生的第一種信號， 在所述小分子調(diào)節(jié)劑的許多不同濃度下進行該步驟以確定所述小分子 調(diào)節(jié)劑的第 一 個半最大活性濃度(AC5o),其是不存在所迷靶蛋白候選物 的表達抑制時的半最大活性濃度，-測定所述第一個半最大活性濃度，-提供與所述第一個細(xì)胞相同類型的第二個細(xì)胞并-向所迷第二個細(xì)胞導(dǎo)入小抑制性RNA(siRNA),其經(jīng)選擇以便抑 制所述第二個細(xì)胞中把蛋白候選物的表達，優(yōu)選用小抑制性RNA (siRNA)轉(zhuǎn)染所述第二個細(xì)胞，所述小抑制性RNA經(jīng)選擇以便抑制所述 第二個細(xì)胞中靶蛋白候選物的表達，-將所迷第二個細(xì)胞暴露于所述小分子調(diào)節(jié)劑，并在空間上分辨和 任選定量所迷第二個細(xì)胞作為應(yīng)答所述小分子調(diào)節(jié)劑而產(chǎn)生的第二種 信號，在所述小分子調(diào)節(jié)劑的許多不同濃度下進行該步驟以確定所迷小 分子調(diào)節(jié)劑的第二個半最大活性濃度(AC5Q),其是存在所述靶蛋白候選 物的表達抑制時的半最大活性濃度，-測定所述第二個半最大活性濃度，釋比較所述第一個半最大活性濃度與所迷第二個半最大活性濃度， 并且如果所述第一個半最大活性濃度與所迷第二個半最大活性濃度之 間存在差異，那么將所述差異歸因于所述靶蛋白候選物表達的抑制，從 而將所述靶蛋白候選物鑒定為所述小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所迷第一個和第二個半最大活性 濃度是半最大抑制濃度(IC5()),并且所述小分子調(diào)節(jié)劑是抑制刑。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述第一個和第二個半最大活性 濃度是半最大增強濃度(EC5G),并且所述小分子調(diào)節(jié)劑是增強劑。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20 - 22任一項的方法，其中所迷第 一種信號與所述第二種信號是光學(xué)信號，其可以通過顯微術(shù)檢測、在空間上分辨和任 選定量。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述第一種信號與所述第二種信 號是熒光信號。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測和/或定量細(xì)胞中靶蛋白候選物的表達的方法，和鑒定小分子調(diào)節(jié)劑的靶蛋白的方法。
文檔編號C12N15/10GK101522897SQ200780034720
公開日2009年9月2日 申請日期2007年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月20日
發(fā)明者N·埃曼斯, U·內(nèi)爾巴斯 申請人:韓國巴斯德研究所