一種c反應蛋白定量檢測的磁微粒化學發(fā)光微流控芯片的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及臨床醫(yī)學體外診斷領域，具體涉及一種C反應蛋白定量檢測的磁微粒化學發(fā)光微流控芯片，能夠在短時間內實現(xiàn)對生物樣品中C反應蛋白的定量檢測，具有操作簡單，靈敏度高，成本低等特點。
技術背景
[0002]C反應蛋白(c-react1n protein,CRP)常在急性炎癥病人血清中出現(xiàn)，由于細胞合成，是全身性炎癥反應的非特異性指標。CRP在感染時含量明顯升高，在急性炎癥反應過程中，CRP是機體最敏感的蛋白質之一，并且是機體炎癥反應精確的客觀指標。CRP是冠心病的獨立危險因子之一，在冠心病的預后中具有重要價值；在急性心肌缺血和心肌梗死中，CRP含量快速升高。正常健康人的CRP值很低，90%的正常人CRP < 1.0mg/L，在炎癥或急性組織損傷后，CRP的合成在4-6小時內迅速增加，36-50小時達到高峰，峰值為正常值的100-1000倍，經過積極合理治療，3-7天可迅速降低至正常值。
[0003]傳統(tǒng)CRP的檢測是基于免疫透射比濁法和免疫散射比濁法，檢測范圍為3_5mg/L，這些方法靈敏度不高，難以用于新生兒感染疾病和心血管疾病等方面的預測和診斷。近年來，出現(xiàn)了多種檢測CRP的新方法，如免疫熒光法和時間分辨免疫熒光法，最低檢測限0.0005-0.lmg/L，極大提高了檢測的靈敏度，這些方法所測定的CRP我們稱之為超敏CRP (hs-CRP) ο中國專利(CN101769932)通過采用不同粒徑的苯乙烯膠乳提供了全量程CRP檢測試劑盒，既可以檢測低濃度的CRP又可以檢測高濃度的CRP，該方法不會因HOOK效應影響檢測的準確性，但是操作復雜，檢測時間長。因此，建立一種檢測時間短，并且檢測除了能在實驗室進行外，還要求能夠床旁進行，同時適用于低值CRP的檢測方法，具有重要的意義。
[0004]近年來，生物分析技術領域得到了快速的發(fā)展，出現(xiàn)了很多重要的研究方向。微流控芯片分析技術是其中最活躍的一支，在科研和實際應用領域都獲得了廣泛的重視。微流控芯片作為一種新型的分析檢測平臺，具有高通量、集成化、便攜式、易操作、低成本等優(yōu)點，已經在眾多領域中得到了廣泛的應用，尤其是在免疫分析領域已嶄露頭角。
[0005]表面功能化的磁性微球作為固相載體，可以用來有效地捕獲核酸、蛋白分子、病毒顆粒甚至細胞，已經被廣泛地應用于各種生化指標的臨床診斷領域。而微流控芯片系統(tǒng)具有快速、高效、集成化等特點，兩者相結合，將成為一種新型的高性能檢測方法，以解決當前檢測方法中存在的靈敏度低，檢測過程復雜，難以實現(xiàn)微量樣本檢測的問題，有望進一步推動臨床檢測儀器向便攜化和微型化發(fā)展。
[0006]免疫磁珠的生物微流控芯片是將磁顆粒技術，免疫分析集成到微流控芯片上的一種分析檢測方法，目前這種綜合性的檢測方法的主要難點表現(xiàn)為:1)液體在芯片內部微流動的智能控制，目前常采用的方法是在芯片內部設置多個微栗和微閥，使得微流控體系變得更加復雜化；2)反應體系的混合不充分，導致反應不充分；3)集成化程度不高，導致非特異性背景高。

【發(fā)明內容】

[0007]針對上述問題，本發(fā)明提出一種C反應蛋白定量檢測的磁微粒化學發(fā)光微流控芯片，采用簡單的方法即可實現(xiàn)微流控芯片內部微流體的智能控制，同時能夠使反應液體得以充分混合，保證反應體系高效進行，可快速實現(xiàn)樣品中CRP濃度的定量檢測。檢測靈敏度高，結果準確可靠，重復性好。
[0008]本發(fā)明的技術問題所采用的技術方案如下:
[0009]—種C反應蛋白定量檢測的磁微?；瘜W發(fā)光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片結構主要包括蓋片(I)和底片(11);其中蓋片(I)上的加樣口(2)，樣本液流通道
(6)，第一生物標記物存儲池(4)，微混合器(7)，過渡區(qū)(10)依次連接；底片(11)上的過濾器(12)，反應池(13)，清洗池(14)，檢測池(15)，溶液釋放通道(18)依次連接，底片(11)上檢測池(15)通過溶液釋放通道(18)與清洗液存儲池(16)和發(fā)光液存儲池(17)連接；
[0010]所述反應池(13)中包被磁顆粒標記的抗C反應蛋白抗體；所述第一生物標記物存儲池(4)、清洗液存儲池(16)和發(fā)光液存儲池(17)中存儲預封裝試劑；所述蓋片(I)和底片(11)用膠帶(20和22)密封組裝。
[0011]具體地，所述微流控芯片的第一生物標記物存儲池(4)、清洗液存儲池(16)和發(fā)光液存儲池(17)的體積為10?500 μ L，為液囊或腔體。
[0012]具體地，所述微流控芯片的微混合器(7)是寬度為20?300 μπι，深度為10?100 μ m的蛇形，折線形或方波形結構。優(yōu)選蛇形或方波形結構，進一步優(yōu)選方波形結構。
[0013]優(yōu)選地，微混合器為寬150 μπι，深度為50 μm的方波形結構，在外部壓力循環(huán)作用下，可使樣本和試劑充分混合，提高反應效率。
[0014]具體地，所述微流控芯片的過濾器(12)由一個具有固定形狀的腔體和濾血膜組成；所述過濾器濾血膜材料為玻璃纖維膜，聚酯纖維膜或CytoSep膜等。優(yōu)選玻璃纖維膜作為濾血膜。所述腔體體積為樣本體積的3?10倍，優(yōu)選腔體體積為樣本體積的4?6倍。
[0015]本發(fā)明所述微流控芯片的過濾器除了具有濾除樣本雜質的功能外，還可以將反應液體引導進入下一級微結構和微通道。
[0016]具體地，所述微流控芯片的反應池(13)為管狀通道或矩形的毛細管微通道。
[0017]具體地，所述微流控芯片的反應池(13)為管狀通道，直徑為0.5?10mm。
[0018]優(yōu)選地，管狀微通道的直徑為5mm，進一步優(yōu)選2mm或1mm。
[0019]具體地，所述微流控芯片的反應池(13)為矩形通道，寬為0.1?5mm，深度為0.01?2臟，長為5?40mm η
[0020]優(yōu)選地，矩形通道寬為0.3?2_，深度為0.2?1_，長為5?20_。
[0021]具體地，本發(fā)明所述磁顆粒為核殼型的超順磁性顆粒，磁核為Fe3O4或γ -Fe 203化合物，外殼為聚苯乙稀，磁顆粒粒徑為0.1?10 μπι。
[0022]優(yōu)選地，所述磁顆粒粒徑為I?3 μ m，更優(yōu)選粒徑為2.0 μ m的磁顆粒。
[0023]具體地，所述磁顆粒為核殼結構類型，磁性微球表面修飾有多種活性功能基團，如-C00H、-C0H、_順2等，或其他生物分子，如生物素，鏈霉親和素等，優(yōu)選表面功能化基團為-COOH或生物素或鏈霉親和素。
[0024]所述微流控芯片的制備方法如下:
[0025]步驟I)抗體標記:酶或發(fā)光劑標記抗C反應蛋白抗體，磁顆粒標記抗C反應蛋白抗體，這兩種抗體可同一種抗體或不同種類抗體；
[0026]步驟2)微流控芯片的組裝:將酶或發(fā)光劑標記抗體溶液分裝至蓋片的存儲池內，密封，將磁顆粒標記抗體溶液包被至底片的反應池，干燥，將清洗液和發(fā)光基底液分別注入清洗液存儲池和發(fā)光基底液存儲池中，密封，用膠帶(20和22)密封蓋片和底片，并將其他部件同時組裝形成一張完整的微流控芯片。
[0027]本發(fā)明所述微流控芯片蓋片和底片內的微通道和微結構的加工工藝包括模塑法、熱壓法、激光刻蝕法和軟光刻法等，本發(fā)明的實施例中優(yōu)選模塑法來制作微流控芯片，可有效降低制作成本。
[0028]本發(fā)明所述微流控芯片的反應池內部需進行一定的表面改性處理，所述表面改性處理方法包括化學反應，表面涂層，等離子處理等，從而獲得良好的親水性，促使液體樣本在毛細管作用力下流動，快速填充微通道，復溶固化的磁標抗體。
[0029]本發(fā)明所述微流控芯片測試流程如下:
[0030]步驟I)從加樣口(2)加入樣本，將微流控芯片放入配套儀器中，從第一生物標記物存儲池(4)釋放標記配體后，樣本和標記配體進入微混器(7)中混合均勻反應，形成一種免疫復合物通過過渡區(qū)(10)，然后流入底片過濾器(12)中；
[0031]步驟2)樣本經過濾器后，復溶包被在反應池(13)的磁顆粒標記的抗C反應蛋白抗體，且與之發(fā)生反應，外部磁鐵收集磁顆粒，磁顆粒收集完成后，在外部磁鐵作用下轉移至清洗池(14)，清洗液存儲池(16)釋放液體通過溶液釋放通道(18)進入清洗池(14)，磁顆粒經充分洗滌后，在外部磁鐵作用下轉移至檢測池(15)，發(fā)光液存儲池(17)釋放液體通過溶液釋放通道(18)進入檢測池(15);測定相對發(fā)光強度(RLU)，報告C反應蛋白的定量測試結果。
[0032]本發(fā)明所述微流控芯片的蓋片(I)上還有空氣栗(3)和氣流微通道(5)，按壓空氣栗(3)使氣流通過氣流微通道(5)驅動樣本通過樣本液流通道(6)。
[0033]本發(fā)明所述微流控芯片蓋片和底片內除上述主要微通道和微結構外還有許多透氣孔，用于排除液體流動過程中產生的氣