專利名稱：：提高植物轉(zhuǎn)化效率的多個轉(zhuǎn)化增強子序列的應(yīng)用的制作方法提高植物轉(zhuǎn)化效率的多個轉(zhuǎn)化增強子序列的應(yīng)用
背景技術(shù)：
：本申請要求獲得于2006年7月19日提交的美國臨時專利申請60/831,814的優(yōu)先權(quán)，其公開通過引用全文結(jié)合到本文中。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及植物生物技術(shù)。更具體地說，本發(fā)明涉及提高細菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化效率的方法和組合物。2.相關(guān)技術(shù)描述在天然的農(nóng)桿菌G4gn^a"en'wm)介導(dǎo)的植物細胞的轉(zhuǎn)化中，來自根瘤農(nóng)桿菌(AfMwe/adms)的Ti質(zhì)?；蛘甙l(fā)根農(nóng)桿菌(ArA/zoge"es)的Ri質(zhì)粒的一段DNA被轉(zhuǎn)移到植物細胞中(例如Gdvin,2003)。該被轉(zhuǎn)移的DNA(T-DNA)片段側(cè)翼是不完全的24bp正向重復(fù)序列，該重復(fù)序列可被農(nóng)桿菌核酸內(nèi)切酶VirD2識別，通過在每一重復(fù)序列的一條鏈上的特定位點上形成切口而產(chǎn)生單鏈的T鏈。引發(fā)單鏈的T鏈形成的重復(fù)序列稱為"右邊界"(RB),而終止單鏈的T鏈形成的重復(fù)序列被稱為"左邊界"(LB)。形成切口后，VirD2蛋白連附著在所述鏈的5'端，并引導(dǎo)T鏈進入植物細胞，在其他農(nóng)桿菌和植物編碼蛋白的幫助下T鏈被整合到植物基因組中。包含載體骨架序列在內(nèi)的T-DNA區(qū)域的序列下游(從5，到3'方向)也可能被轉(zhuǎn)移(例如Kononov等，1997)。這有可能是由于在轉(zhuǎn)移到植物細胞之前農(nóng)桿菌中至少一個邊界不能形成缺口所致。通過比較多種農(nóng)桿菌菌抹的RB和LB序列，表明RB和LB享有共同的基序(Canaday等，1992),這表明可能有其他元件參與RB加工效率的調(diào)節(jié)。鄰近RB的順式作用序列存在于許多農(nóng)桿菌菌林中，包括根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。這些序列對野生型侵入性而言是必需的(Veluthambi等，1988;Shurvington和Ream1991;Toro等，1989;Toro等，1988;Hansen等，1992)。在根瘤農(nóng)桿菌中該序列被Peralta等(1986)稱為"超驅(qū)動(overdrive)"或者"T-DNA傳遞增強子"。在發(fā)根農(nóng)桿菌中該序列被Hansen等(1992)稱為"T-DNA轉(zhuǎn)移激活序列(TSS)"。超驅(qū)動("OD")序列起始被定義為直接存在于章魚堿TiTL-DNA的RB重復(fù)序列之前的特定24bp基序(Peralta等，1986)。類似的序列存在于章魚堿TiTR-DNA的RB重復(fù)序列之前，并且也存在于胭脂堿TiRB和農(nóng)桿堿RiTL右邊界之前(Peralta等，1986、Shaw等，1984、Barker等，1983、Slighton等，1985)。進一步比較不同根瘤農(nóng)桿菌顯示8bp的超驅(qū)動核心序列存在于所有右邊界序列之前，那些菌株包括胭脂堿菌抹pTiT37、章魚堿菌抹pTiA6和發(fā)根農(nóng)桿菌pRiA4(Peralta等，1986)。章魚堿超驅(qū)動序列的存在增強農(nóng)桿菌細胞中單鏈T-DNA的形成，促進T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞中，并且對野生型侵入性是必需的(Peralta等，1986，Shurvinton和Ream1991)。當(dāng)將pTiT37(產(chǎn)生胭脂堿的Ti質(zhì)粒)RB近端的順式作用序列放置在pTiT37的LB重復(fù)序列之前時，后者能夠產(chǎn)生高效的單鏈T-DNA,這表明類似超驅(qū)動的序列確實也存在于胭脂堿Ti質(zhì)粒上(Culianez-Macia和Hepburn1988,Peralta等，1986)，正如其在其他鑒定的(產(chǎn)生章魚堿的)Ti質(zhì)粒中一樣。使異源的章魚堿超驅(qū)動序列整合到胭脂堿pTiT37RB之前，導(dǎo)致比僅包含一個合成pTiT37RB重復(fù)序列的親本菌抹更大的侵入性(Peralta等，1986)。(Toro等，1988,1989),而v^C突變導(dǎo)致了在植物中侵入性減弱(Close等，1987)和加工的單鏈T-DNA序列產(chǎn)量減少。根瘤農(nóng)桿菌的章魚堿和胭脂堿Ti質(zhì)粒皆包含v&C并且可以與v/rC突變反式互補以使減弱的侵入性恢復(fù)到野生型水平(Close等，1987)。在發(fā)根農(nóng)桿菌菌抹8196、A4和2659中發(fā)現(xiàn)的TSS與根瘤農(nóng)桿菌中的超驅(qū)動序列起著相似的作用。每一種發(fā)根農(nóng)桿菌菌林具有不同但相關(guān)的序列(Hansen等，1992)。8bp的TSS核心序列在pRiA4重復(fù)5次、在pRi8196中重復(fù)6次而在pRi2659(Genbank登錄號AJ271050)中重復(fù)17次(而不是Hansen等，1992中的16次)。除這些重復(fù)外pRiA4還具有保守的8bp超驅(qū)動核心序列。在pRiA4和pRi8196中更短的核心序列重復(fù)對于野生型侵入性而言是不足夠的(Hansen等，1992)。Depicker等(美國專利公開2003/0140376和相應(yīng)的國際公開WO01/44482)描述了具有修改的T-DNA邊界以減少或者阻止載體骨架序列的轉(zhuǎn)移的重組構(gòu)建體。Conner等(WO05/121346)描述了T-DNA邊界類似區(qū)域的序列的產(chǎn)生和應(yīng)用，該區(qū)域包含來自植物的序列。Heim等(美國公開2003/0188345)描述了具有修飾的邊界區(qū)的載體用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化。Lassner等(美國公開2006/0041956)描述了對T-DNA邊界區(qū)域進行修飾以能夠鑒定不包含非T-DNA序列的轉(zhuǎn)基因事件。雖然前述的研究增加了對現(xiàn)有技術(shù)的理解，但是仍需要的是一種方法來提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化效率。盡管與缺少這些序列的質(zhì)粒相比，超驅(qū)動或者TSS序列的存在增加了野生型農(nóng)桿菌的侵入性并且促進T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞中，但是如何進一步提高轉(zhuǎn)化效率(包括通過使用超驅(qū)動或者TSS序列在內(nèi))仍是不清楚的。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了增加細菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化效率的方法，其包含如下步驟a)將至少一個附加的轉(zhuǎn)化增強子序列引入到包含至少一個T-DNA邊界區(qū)域的植物轉(zhuǎn)化載體中；b)通過細菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化用上述載體轉(zhuǎn)化植物細胞，其中所述細菌能夠?qū)χ参锛毎M行轉(zhuǎn)化。該方法任選可包括從植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植林。在一個實施方案中，所述附加的轉(zhuǎn)化增強子序列包含TGTWTGTK(SEQIDNO:20)的共有核心序列。在其他實施方案中，所述附加的轉(zhuǎn)化增強子序列選自SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:13，和與SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或者SEQIDNO:13中的任意一個互補的序列。在具體的實施方案中，本發(fā)明提供了包含SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或者SEQIDNO:16的重組DNA構(gòu)建體。本發(fā)明所用的轉(zhuǎn)化增強子序列可位于T-DNA邊界區(qū)或序列(例如右邊界(RB)序列)的近端，即在側(cè)翼序列例如載體序列和邊界序列之間。轉(zhuǎn)化增強子序列可來自根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒例如胭脂堿或章魚堿質(zhì)粒，或者可能來自發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒。在某些實施方案中，細菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化可利用選自農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、根瘤菌(W/^o&wm)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和中華根瘤菌(&"oW'zoZ^m)、中間根瘤菌(MasoW^o&ww)或者慢生根瘤菌(Srac/>r/'zoZ^—介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的技術(shù)來實現(xiàn)。在某些實施方案中，轉(zhuǎn)化增強子序列可包含SEQIDNO:IO、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:17或者SEQIDNO:18。在進一步的實施方案中，T-DAN邊界區(qū)可能包含1-約18個拷貝的轉(zhuǎn)化增強子序列，包括從約2或約4到約18個拷貝的轉(zhuǎn)化增強子序列。本發(fā)明的植物細胞可以是任何植物細胞。在某些實施方案中，所述植物細胞來自選自以下的植物大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、小麥、苜蓿、菜豆、花生、煙草、向日葵、大麥、甜菜、青花椰菜、甘藍、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、大白菜、黃瓜、茄子、韭蔥、萵苣、甜瓜、燕麥、洋蔥、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、西葫蘆、蘿卜、高粱、菠菜、南瓜、糖蘿卜、西紅柿和西瓜。在具體的實施方案中，所述植物細胞是玉米細胞或大豆細胞。在另一方面，本發(fā)明提供重組DNA構(gòu)建體，其包含可操作地連接到轉(zhuǎn)化增強子序列上的Ti或Ri質(zhì)粒T-DNA邊界序列，所述轉(zhuǎn)化增強子序列包含選自以下序列的兩個或更多個拷貝SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:13、與SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或SEQ8IDNO:13中的任意一個互補的序列及它們的組合。在具體的實施方案中，本發(fā)明提供了包含SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16的重組DNA構(gòu)建體。在這樣的構(gòu)建體中，增強子序列可包含該序列的至少約四個拷貝。邊界序列可為右邊界(RB)或者左邊界(LB)序列。在某些實施方案中，所述構(gòu)建體可包含SEQIDNO:10和/或SEQIDNO:ll。RB序列可來自胭脂堿Ti質(zhì)粒或者農(nóng)桿堿、甘露堿、琥珀堿、黃瓜堿或者章魚堿Ti或Ri質(zhì)粒并且可包含SEQIDNO:12。在另一個方面，本發(fā)明提供了用本文所提供構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細胞。該細胞可能是植物或者細菌細胞，包括農(nóng)桿菌細胞或者根瘤菌細胞。在一個實施方案中，所述植物細胞來自選自以下的植物大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、大麥、苜蓿、菜豆、花生、煙草和向日葵。本發(fā)明還提供了由本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植抹。在具體的實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植林可選自大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、大麥、苜蓿、菜豆、花生、煙草和向曰葵。附圖簡述后面的附圖是本說明的一部分，其被包括以進一步說明本發(fā)明的某些方面。通過參考這些圖并結(jié)合本文提出的具體實施方案的詳細描述可以更好地理解本發(fā)明。圖1:用以提高轉(zhuǎn)化效率的不同轉(zhuǎn)化增強子序列的略圖。圖2:pMON87464的簡圖。圖3:pMO脂465的簡圖。圖4:改造的RB序列；超驅(qū)動序列用黑體標出，而24bpRB核心序列用下劃線標出。(A)胭脂堿RB序列+lx超驅(qū)動序列(SEQIDNO:14);(B)胭脂堿RB序列+4x超驅(qū)動序列(SEQIDNO:15);(C)胭脂堿RB序列+18xTSS序列(SEQIDNO:16)。序列表描述SEQIDNO:1用以制備2XOD序列的正向引物Xd463。SEQIDNO:2SEQIDNO:3SEQIDNO:4SEQIDNO:5SEQIDNO:6SEQIDNO:7反向互補序列。SEQIDNO:8SEQIDNO:9SEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12SEQIDNO:13SEQIDNO:14SEQIDNO:15SEQIDNO:16SEQIDNO:17SEQIDNO:18列SEQIDNO:19SEQIDNO:20用以制備2XOD序列的反向51物Xd464。用以制備6XTSS序列的正向引物Xd465。用以制備6XTSS序列的反向？j物Xd466。pTiA6的24bp核心OD序列。8bplxTSS序列。pTiA6的30bplxOD序列；SEQIDNO:17的來自pTiAB3的1XOD序列。來自pTi15955的1XOD序列。4X疊加OD序列。18X疊加TSS。具有IXOD序列的邊界區(qū)。部分OD序列。具有IXOD的胭脂堿RB區(qū)。具有4XOD的胭脂堿RB區(qū)。具有18XTSS的胭脂堿RB區(qū)。1XOD;SEQIDNO:7的反向互補序列。4X疊加OD;SEQIDNO:10的反向互補序共有的OD序列(Toro等，1988)。共有的8bp核心OD序列。發(fā)明詳述以下是本發(fā)明的詳細描述，供以幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實踐本發(fā)明。在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可對本文中描述的實施方案做出修改和變更。本發(fā)明提供用于提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物細胞轉(zhuǎn)化效率的方法和組合物。對發(fā)根農(nóng)桿菌K599(—種大豆超侵入性菌株)的20kbT-DNA區(qū)的測序，從而認識到發(fā)根農(nóng)桿菌K599中的pRi質(zhì)粒等同于發(fā)根農(nóng)桿菌NCPBB2659菌抹。因此K599菌抹的超級侵入性可能與存在于RB附近的TSS序列的數(shù)目相關(guān)。因此，在雙元載體中對多個超驅(qū)動和TSS重復(fù)的疊加(stacking)與胭脂堿RB(例如來自pTiT37)進行測試,以提高轉(zhuǎn)化效率。來自pTiA6以4拷貝存在的章魚堿Ti質(zhì)粒的30bp超驅(qū)動序列(Shurvinton和Ream1991)和以18拷貝存在的發(fā)根農(nóng)桿菌NCPBB2659的TSS8bp核心序列，被用以提高T-DNA傳遞效率。對包含不同數(shù)目超驅(qū)動或者TSS序列的構(gòu)建體效用進行比較的轉(zhuǎn)化研究表明，通過提高轉(zhuǎn)化頻率和提高所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因事件的質(zhì)量，這些序列附加的"疊加，，拷貝的存在提高了轉(zhuǎn)化效率。例如，具有單拷貝插入并且還缺少載體骨架序列(例如on'V)的轉(zhuǎn)基因事件的比例增加。通過減少為進一步商業(yè)開發(fā)而進行的選擇事件所需來源的數(shù)量，增加轉(zhuǎn)化頻率和優(yōu)質(zhì)事件(qualityevent),使轉(zhuǎn)化過程整體效率得以提高。因此本發(fā)明提供了改進方法，用于獲得可育的轉(zhuǎn)基因植抹，以及用于轉(zhuǎn)化植物細胞或組織和使經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞或組織再生成為可育的轉(zhuǎn)基因植林。為了起始本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化過程，首先要選擇需要插入到植物細胞或者組織中的遺傳組分。遺傳組分可以包括任何通過本發(fā)明方法引入到植物細胞或者組織中的核酸。遺傳組分可以包括非植物DNA、植物DNA或者合成DNA。在本發(fā)明的某些實施方案中，遺傳組分被并入到例如重組體、雙鏈質(zhì)?；蛘咻d體核酸的DNA組合物中，所述DNA組合物包括遺傳組分例如(a)在植物細胞中起產(chǎn)生RNA序列作用的啟動子，(b)產(chǎn)生編碼所需蛋白或多肽的RNA序列的結(jié)構(gòu)DNA序列和(c)在植物細胞中起到使RNA序列3，端聚腺苷酸化作用的3，端非翻譯DNA序列。所述載體也可包含促進轉(zhuǎn)化和調(diào)節(jié)所要基因的表達的遺傳組分。所述遺傳組分通常被定向以表達mRNA,該mRNA在一個實施方案中可以翻譯成蛋白。以雙鏈形式存在的植物結(jié)構(gòu)編碼序列(基因、iicDNA、合成DNA或者其他DNA)的表達包括通過RNA聚合酶將一條DNA鏈轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)以及接著在細胞核中加工mRNA初級轉(zhuǎn)錄物。這樣的加工包括mRNA3，端的聚腺芬酸化，涉及3，非翻i奪區(qū)。制備包含所需遺傳組分并可用于轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒或載體的一般方法、以及構(gòu)建這些載體的方法為現(xiàn)有技術(shù)所已知。載體通常由許多遺傳組分組成，包括但不限于，調(diào)節(jié)元件例如啟動子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和終止序列。調(diào)節(jié)元件也稱為反式或順式調(diào)節(jié)元件，視與該元件與其所控制序列或者基因的接近程度而定。所述啟動子區(qū)包含一段堿基序列，轉(zhuǎn)導(dǎo)信號使RNA聚合酶與DNA締合并且以DNA鏈中的一條作為模板起始mRNA轉(zhuǎn)錄，形成相應(yīng)的RNA互補鏈。構(gòu)建體還可包含在細菌細胞中提供復(fù)制功能和抗生素篩選的質(zhì)粒骨架DNA區(qū)段，例如大腸桿菌復(fù)制起點如on'322、廣譜宿主性復(fù)制起點例如on'V或者on'Ri和選擇標記的編碼區(qū)域例如Spec/Strp選擇標記基因(其編碼賦予壯觀霉素或鏈霉素耐受性的Tn7氨基糖香腺香酸轉(zhuǎn)移酶(aadA))或慶大霉素(Gm,Gent)選擇標記基因。對植物轉(zhuǎn)化而言，宿主細菌菌株常常是攜帶對于表達單元具有轉(zhuǎn)移功能的質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌ABI、C58、LBA4404、EHA101或者EHA105。植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中技術(shù)人員所知的其他細菌菌抹可以用于本發(fā)明，包括發(fā)根農(nóng)桿菌、中華根瘤菌、中間根瘤菌、慢生根瘤菌和根瘤菌菌抹。在文獻中已經(jīng)描述了許多在植物中具有活性的啟動子。這樣的啟動子包括但不限于，胭脂堿合成酶(NOS)啟動子和章魚堿合成酶(OCS)啟動子，它們攜帶在根瘤農(nóng)桿菌的根瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒中；花椰菜花葉病毒啟動子例如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S以及玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子，加強的CaMV35S啟動子(e35S);以及來自核酮糖二磷酸羧化酶的小亞基(ssRUBISCO，一種非常豐富的植物多肽)的光誘導(dǎo)啟動子。所有這些啟動子已經(jīng)被用于構(gòu)建已在植物中表達的不同類型的DNA構(gòu)建體。也可構(gòu)建雜合啟動子以增加轉(zhuǎn)錄活性或者聯(lián)合所需的轉(zhuǎn)錄活性、可誘導(dǎo)性和組織或發(fā)育特異性。因此，在植物中起作用的啟動子可為所描述的可誘導(dǎo)的、病毒性的、合成的、組成性的，時間調(diào)節(jié)的、空間調(diào)節(jié)的、和/或者時空調(diào)節(jié)的。組織增強的、組織特異的或者發(fā)育調(diào)節(jié)的其他啟動子也在現(xiàn)有技術(shù)中所知并且被考慮在本發(fā)明實踐中可用?？梢詮亩喾N來源例如植物和植物DNA病毒中獲得有用的啟動子。優(yōu)選所選的特定啟動子應(yīng)該能夠造成充分表達，以產(chǎn)生有效數(shù)量的目標基因產(chǎn)物。若有需要，在本發(fā)明DNA構(gòu)建體(即嵌合/重組的植物基因)中所用的啟動子可以經(jīng)過修改以影響其控制特性?？梢酝ㄟ^與操縱區(qū)連接、進行隨機或受控誘變等方法獲得啟動子。此外，啟動子可經(jīng)改造以包含多種"增強子序列，，以協(xié)助促進基因表達。由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的mRNA也可包含5，非翻譯前導(dǎo)序列。該序列可以來自選以表達基因的啟動子并且也可經(jīng)特定修飾以增加mRNA的翻譯。5'非翻譯區(qū)域也可以從病毒RNA、從合適的真核基因或者從合成的基因序列獲得。這樣的"增強子"序列可以合乎需要地增加或者改變產(chǎn)生的mRNA的翻譯效率并且常稱為翻譯增強子。其他用于增強表達或者影響基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的遺傳組分也被考慮作為遺傳組分。嵌合構(gòu)建體的3，非翻譯區(qū)域優(yōu)選包含轉(zhuǎn)錄終止子、或具有等價功能的元件以及聚腺苷酸信號位點，其在植物中起聚腺苷酸化RNA的3'端的作用。合適的3，區(qū)的實例為(1)3，轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)域，其包含農(nóng)桿菌根瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；蚶珉僦瑝A合成酶("o力基因的聚腺香酸信號，和(2)植物基因例如大豆貯藏蛋白基因和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亞基基因。優(yōu)選的3，區(qū)的實例來自于豌豆的ssRUBISCOE9基因。典型地，位于聚腺苷酸位點下游幾百個堿基對的DNA序列用作終止轉(zhuǎn)錄。這些DNA序列在本文中被稱為轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。這些區(qū)域為轉(zhuǎn)錄信使RNA(mRNA)的有效聚腺普酸化所需并且稱為3，非轉(zhuǎn)錄區(qū)。RNA聚合酶通過聚腺苷酸化發(fā)生的位點轉(zhuǎn)錄編碼DNA序列。在許多轉(zhuǎn)化體系中，優(yōu)選包含可選擇的、可篩選的或可選的(scoreable)標記基因的轉(zhuǎn)化載體。這些遺傳組分在本文中也稱為功能性遺傳組分，因為其產(chǎn)生可用于鑒定轉(zhuǎn)化植抹的產(chǎn)物或有所需效用的產(chǎn)物。用作篩選工具的DNA可在再生植物組織中起作用，以產(chǎn)生可賦予植物組織對另外的毒性化合物耐受的化合物?？勺鳛榭蛇x擇的、可篩選的或可選的標記使用的目標基因可以包括但不限于葡萄糖醛酸酶(gw力、綠色熒光蛋白(她)、熒光素酶(/wx)、抗生素例如卡那霉素(Dekeyser等，1989)，給予對除草劑耐受的基因如對草甘膦(Della-Cioppa等，1987),例如CP4EPSPS(美國專利5,627,061;美國專利5,633,435;美國專利6，040,497;美國專利5,094,945;WO04/074443;WO04/009761);如對草胺膦的(美國專利5,646,024,美國專利5,561,236，美國專利5,276,268;美國專利5,637，489;美國專利5,273,894);如對2,4-D(WO05/107437)和麥草畏，例如DMO(美國專利7,022，896)耐受。也可實行其他篩選方法，包括但不限于對草丁膦、雙丙氨磷耐受和陽性篩選機制(Joersbo等，1998)并且也將落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。在Miki和McHugh(2004)中公開了各種可選擇的/可篩選的/可選的標記的實例和編碼它們的基因。本發(fā)明可與任何合適的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)?；蜉d體一起使用，這些質(zhì)?；蜉d體包含上述可選擇或可篩選標記和相關(guān)的調(diào)節(jié)元件、連同一種或多種以足以賦予個別所需特征的方式表達的核酸(目標結(jié)構(gòu)基因)。本發(fā)明所考慮的合適目標結(jié)構(gòu)基因的實例包括但不限于昆蟲或者害蟲耐受性基因，除草劑耐受性基因，品質(zhì)改良基因例如產(chǎn)量提高、營養(yǎng)加強、環(huán)境或者脅迫耐受性，或者在植物生理、生長、發(fā)育、形態(tài)或者植物產(chǎn)物上有任何想要的改變的基因。14備選地，響這些表型，這些非翻譯RNA分子例如通過包括反義介導(dǎo)和共抑制介導(dǎo)的機制在內(nèi)的雙鏈RNA介導(dǎo)機制(參見例如Bird等，1991)，造成內(nèi)源基因表達受到耙向性抑制。所述RNA還可以是一種被加工以切割所需內(nèi)源mRNA產(chǎn)物的催化性RNA分子(即核酶)(參見例如Gibson和Shillitoe，1997)。更具體地說，關(guān)于反義調(diào)節(jié)植物細胞中基因表達的詳述參見美國專利第5,107,065號，而關(guān)于通過轉(zhuǎn)錄dsRNA現(xiàn)實植物中基因阻抑的詳述參見美國專利第6,506,559號、美國專利申請公開第2002/0168707號Al和美國專利申請系列第09/423,143(參見W099/61631)，以上所有通過引用全文結(jié)合到本文中。還考慮造成其他內(nèi)源基因沉默(例如包括miRNA的RNAi技術(shù))以獲得一種表型的序列的使用。例如RNAi可用于沉默一種或多種引起可選表型的基因。一個實施方案是組裝轉(zhuǎn)錄反向重復(fù)序列的DNA盒，以產(chǎn)生雙鏈RNA(dsRNA),該雙鏈RNA通常至少長約19-21bp并且與一個或者多個待靶向沉默基因的一部分對應(yīng)。因此任何產(chǎn)生表達感興趣的表型或者形態(tài)變化的蛋白或mRNA的基因?qū)Ρ景l(fā)明的實踐都是有用的。DNA序列(即來自另一個種的序列或者基因)，或者甚至是起源于或者存在于相同種中但通過遺傳工程方法而非傳統(tǒng)的繁殖或者育種技術(shù)并入到受體細胞中的基因或者序列。然而術(shù)語外源的也意指通常在待轉(zhuǎn)化細胞中不存在的基因；或指不以如在轉(zhuǎn)化DNA區(qū)段中發(fā)現(xiàn)的形式或者結(jié)構(gòu)等存在的基因；或指正常存在但希望有不同的表達的基因。因此，術(shù)語"外源的"基因或者DNA意指引入到受體細胞中的任何基因或者DNA區(qū)段，而無論是否可能已有類似的基因存在于這植物細胞中的DNA、另一種植物中的DNA、不同的生物體的DNA或外部產(chǎn)生的DNA，例如包含基因反義信息的DNA序列、或基因或者序列的合成或修飾型的DNA編碼序列。根據(jù)本公開，很多其他可能的可選擇的或可篩選的標記基因、此，前述討論旨在是示范的而并非無遺漏的。構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體或構(gòu)建體之后，通常使在體外制成DNA組合物的核酸分子引入合適的宿主例如大腸桿菌中并配入另一個合適的宿主例如農(nóng)桿菌或者根瘤菌；或直接轉(zhuǎn)化到感受態(tài)農(nóng)桿菌或者根瘤菌中。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并且已經(jīng)對許多植物體系作出描述，包括大豆、棉花和小麥(參見例如美國專利第5,569,834和5，159,135號以及W097/48814)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法的效用。菌林可包括但不限于根瘤農(nóng)桿菌菌抹C58的卸曱衍生物、用以介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移入植物細胞的胭脂堿菌林；章魚堿菌抹例如LBA4404;或農(nóng)桿堿菌林例如EHAIOI、EHA105或具有Ti或Ri質(zhì)粒的豌豆根瘤菌(兄/egwmz'"osarwm)USDA2370。已經(jīng)報道了這些菌抹在植物轉(zhuǎn)化上的用途而且本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些方法。通常用包含重組構(gòu)建體的根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌接種待轉(zhuǎn)化的植物組織，使兩者共培養(yǎng)，并在適合的條件下進行篩選，所述重組構(gòu)建體包含至少一個外源超驅(qū)動或者TSS序列、待轉(zhuǎn)移的目標序列和至少一個用以限定待轉(zhuǎn)移DNA的RB序列。在某些實施方案中，還有至少一個LB序列存在于重組構(gòu)建體中。在某些其他實施方案中，邊界序列可以是"植物來源類似邊界序列"。在Rommens等，2005、Rommens2004a、Rommens等，2004b中描述了鑒定和使用這樣的序列的方法。本發(fā)明可以與任何可轉(zhuǎn)化的細胞或者組織一起使用。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員認識到可轉(zhuǎn)化的植物組織通常指那些具有外源DNA插入到織可以包括但是不限于細胞懸浮物、愈傷組織、下胚軸組織、子葉16組織、胚、分生組織、根和葉。例如，可轉(zhuǎn)化的組織可包括來自花藥愈傷或者胚狀體、小孢子、花序和葉組織。其他組織也被考慮在本發(fā)明的實踐中有效，并且對于特定植物品種需要特定的外植體這已為現(xiàn)有技術(shù)所知或者可以通過常規(guī)的婦選和測試實^r確定，由才直物中更成功的。已經(jīng)公開了對許多作物包括棉花、大豆、蕓苔(^ywWc力和花生利用根瘤農(nóng)桿菌或者發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雙子葉植物并獲得轉(zhuǎn)基因植林的方法。也已經(jīng)報道了通過基于根瘤農(nóng)桿菌或者發(fā)根農(nóng)桿菌的方法實現(xiàn)對單子葉植物的成功轉(zhuǎn)化。至少在，夢、大麥、玉米、燕麥、水稻、甘蔗、萆狀羊茅和小麥中已經(jīng)實現(xiàn)并報道了轉(zhuǎn)化和植物的再生。在美國專利第5,846.797、5,159,135、5，004，863和6，624,344號中公開了可以特別用于棉花轉(zhuǎn)化背景的技術(shù)。在例如美國專利5,750,871中公開了具體用于轉(zhuǎn)化蕓苔屬植物的技術(shù)。在例如Zhang等(1999)和美國專利6，384,301中公開了轉(zhuǎn)化大豆的技術(shù)；而在例如美國專利5,981,840、美國專利7，060，876、美國專利5,591,616、WO95/06722和美國專利公開2004/244075中公開了轉(zhuǎn)化玉米的技術(shù)。在一個實施方案中，在包含抑制農(nóng)桿菌和根瘤菌生長的抗生素且沒有篩選劑的培養(yǎng)基(延遲培養(yǎng)基)上進行培養(yǎng)之后，使外植體在選擇生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述生長培養(yǎng)基包括但不限于包含植物細胞篩選劑的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。已經(jīng)描述了典型的篩選劑，其包括但不限于抗生素例如G418、巴龍霉素、卡那霉素或者其他化學(xué)物質(zhì)例如草甘膦、麥草畏和草胺膦。接著將在篩選培養(yǎng)基上存活的植物組織培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到適于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植林的再生培養(yǎng)基上。再生可以通過幾個步驟執(zhí)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可以使用的不同類型的培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移所需條件，并可根據(jù)每一種植物體系為植林轉(zhuǎn)化和再生來對它們進行優(yōu)化。接著分析產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化抹以確定是否存在包含在轉(zhuǎn)化載體上的特定的目標核酸。分子分析可以包括但不限于DNA印跡或者PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))分析?？蓤?zhí)行這些或者其他熟知的方法，以確認通過公開方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植株的穩(wěn)定性、插入的拷貝數(shù)以及T-DNA側(cè)翼的載體骨架序列的存在情況。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并且已被報導(dǎo)過(參見例如Sambrook等，1989)。前述討論僅僅是對標準的轉(zhuǎn)化和再生實驗方案的粗略描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道具體作物和具體方案可以與粗略描述稍微有所不同。每一種體系也可使用多種培養(yǎng)基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉當(dāng)適合地進行補充時支持植物組織生長和發(fā)育的組織培養(yǎng)培養(yǎng)基種類。的技術(shù)人員定制和修改。這樣的培養(yǎng)基的實例包括但不限于由Murashige和Skoog(1962)、Chu等(1975)、Linsmaier和Skoog(1965)、Uchimiya和Murashige(1962)、Gamborg等(1968)、Duncan等(1985)、McCown和Lloyd(1981)、Nitsch和Nitsch(1969)以及Schenk和Hildebrandt(1972)描述的培養(yǎng)基或者根據(jù)需要進行補充的這些培養(yǎng)基的衍生。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道用于轉(zhuǎn)化和再生的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基補充物(例如營養(yǎng)和生長調(diào)節(jié)劑)通常根據(jù)特定的目標作物或者感興趣的品種進行優(yōu)化。試劑是市售的并且可從許多供應(yīng)商處購得(參見例如SigmaChemicalCo.,St.Louis,Mo.)在許多Ti質(zhì)粒中鑒定有"超驅(qū)動"序列，其中包括pTiA6、pTiAB3和pTil5955。例如使用Wis.53711，麥迪遜，威斯康辛大學(xué)生物技術(shù)中心，遺傳計算機組，序列分析軟件包的"BestFit"、"Gap"或"FASTA"程序，或者使用"BLAST"程序(Altschul等，1990)，或者另一個可獲得的DNA序列分析包，可以鑒定出與超驅(qū)動或者TSS具有高度同源性的其他序列。當(dāng)這樣的序列以多拷貝于RB序列附近存在時，可以根據(jù)轉(zhuǎn)化提高活性對其進行測定，這與下文對增強子活性進行描述的序列相似。本文中所用的"轉(zhuǎn)化的頻率"或者"轉(zhuǎn)化頻率"指所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因事件/外植體的百分比或所產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植林/外植體的百分比。"邊界序列"，例如右邊界(RB)或者左邊界(LB),指限定轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)區(qū)域末端的直接重復(fù)核酸序列，通常約24bp長。邊界序列可來自農(nóng)桿菌的Ti或者Ri質(zhì)粒，或者可為功能相似的植物來源的序列。"T-DNA邊界序列"指RB或者LB序列和相關(guān)的側(cè)翼序列，通常約100bp長，并且如在自然中發(fā)現(xiàn)的，可以包括轉(zhuǎn)錄增強子序列。本文中所用"轉(zhuǎn)化效率"，指任何改進，例如通過減少為進一步商業(yè)開發(fā)而進行的選擇事件所需來源的數(shù)量，實現(xiàn)影響轉(zhuǎn)化過程整體效率的轉(zhuǎn)化頻率和優(yōu)質(zhì)事件的增加。本文所使用的"轉(zhuǎn)化增強子"指超驅(qū)動和TSS序列。當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄信c第二核酸序列經(jīng)過排列(arrange)致使前者影響后者功能時，則第一核酸序列與第二核酸序列"可操作連接"。優(yōu)選兩個核酸序列是單個鄰接的核酸分子的一部分。超驅(qū)動或者TSS增強子序列可直接位于鄰近邊界序列例如RB序列。可供選擇地，在某些實施方案中，超驅(qū)動或者TSS序列位于邊界序列末端約1、10、25、50、100、250、500、1000或者更多核酸處，包括所有中間范圍。超驅(qū)動序列可位于相應(yīng)于邊界的每一個方向。實施例本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明提供的方法和組合物的許多優(yōu)點。下述實施例被包括在內(nèi)以證明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域發(fā)明實踐中作用良好的技術(shù)，因此可以考慮為構(gòu)成本發(fā)明實踐的優(yōu)選模式。然而，根據(jù)本公開本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下，在公開的具體實施方案中可以作出很多改變并仍獲得類似或者相似的結(jié)果。本文所引用的全部參考文獻到作為19補充、解釋、提供背景或教導(dǎo)本文所用方法、技術(shù)或者組合物的程度下，通過參考合并到本文中。實施例l轉(zhuǎn)化增強子序列的合成1)4x超驅(qū)動序列的合成將2x30bp超驅(qū)動引物對5"c犯3C3犯c3t3C3cagcg3cttattc3C3C3犯c3犯c3t3C3C3gcgacU倉3C335(Xd463;SEQIDNO:l)和5，tgtgaataagtcgctgtgtatgtttgtttgtgtgaataagtcgctgtgtatgtttgtttg3，(Xd464;SEQIDNO:2)合成、混合并且在Stratagene(LaJolla，CA)高保真PfliTurbo⑧聚合酶存在下PCR擴增20個循環(huán)，以合成4x30bp超驅(qū)動(OD)序列(5，caaacaaacatacacagcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcaca3，；SEQIDNO:18)。在1。/。瓊脂糖凝膠上PCR產(chǎn)物分成幾部分，將對應(yīng)的大小范圍在100-300bp之間的凝膠部分切下、經(jīng)純化并連接到Invitrogen(Carlsbad，CA)的TOPOZero平端PCR載體上。通過測序確定重復(fù)疊加。盡管在隨后的多拷貝超驅(qū)動構(gòu)建體的克隆中只用了4x30bp超驅(qū)動插入，但是PCR后觀察到至多6x的超驅(qū)動序列，。2)18xTSS序列的合成將6x8bpTSS重復(fù)引物對5，ctgacgaactgacgaactgacgaactgacgaactgacgaactgacgaa3，(Xd465;SEQIDNO:3)和5，ttcgtcagttcgtcagttcgtcagttcgtcagttcgtcagttcgtcag3，(Xd466;SEQIDNO:4)合成、相份混合并且在Stratagene(LaJolla,CA)的PfUTurbo⑧聚合酶存在下擴增5個循環(huán)。切下100-300bp大小的凝膠薄片、經(jīng)純化并連接到Invitrogen的TOPOZero平端PCR載體中。通過測序確認至多35xTSS重復(fù)，但只保留18xTSS重復(fù)作進一步克隆用。超驅(qū)動和TSS的大小取決于PCR循環(huán)和切下的凝膠位置。實施例2具有RB連同超驅(qū)動、附加的超驅(qū)動或18xTSS的的載體的構(gòu)建為了將超驅(qū)動或者TSS序列置于24bpRB之前，將5coRI位點引入到胭脂石咸RB中，其位于RB(pMON83900的)上游llbp處。從被五coRI消化的相應(yīng)的TOPO克隆載體上切下4x超驅(qū)動序列或者18xTSS序列，將其插入到被&oM切開的pMON83900中，分別得到pMON83903和pMON83909。用歷"din/5^I消化pMON83903或pMON83909的包含4x超驅(qū)動序列或者18xTSS序列的經(jīng)修飾的RB，用此包含4x超驅(qū)動或者18xTSS增強子序列的/Z/"din/5^I區(qū)段置換pMON83902的lx超驅(qū)動RB序列，分別得到pMON87462和pMON83864用于大豆轉(zhuǎn)化?？晒┻x擇的是，通過插入pMON83903或pMON83909的6^IASa/I片段，來對pMON80105的RB進行修飾從而使4x超驅(qū)動或者18xTSS序列被包含，以分別獲得pMON87465和pMON87466用于玉米轉(zhuǎn)化。在圖1和4以及SEQIDNO:14-16中展示了具有1x、4x和18x轉(zhuǎn)化增強子序列的經(jīng)修飾的RB。通過首先根據(jù)標準實驗方案組裝包含30bp超驅(qū)動序列的寡核苷酸，然后將其克隆到pBlueScript⑧H(StratageneInc.,LaJolla，CA)來合成包含lx超驅(qū)動序列(SEQIDNO:17)的構(gòu)建體，得到pMON80088。接著將來自pMON80088的5^el和A^I(用聚合酶補平)片段插入到用5^I和Smal消化的pMON80105中，得到pMON80121用于棉花轉(zhuǎn)化。對于大豆轉(zhuǎn)化，通過利用尸mel/A^el限制性內(nèi)切酶位點用來自pMON80121的lx超驅(qū)動RB片段替代pMON83898中的RB，得到lx超驅(qū)動RB構(gòu)建體pMON83902。實施例3超驅(qū)動或者TSS增強型RB序列對玉米的轉(zhuǎn)化如在美國專利申請公開2004/244075所描述的，用包含on'F的載體pMON80105、pMON80121、pMON87465或pMON87466轉(zhuǎn)化玉米(Zeawa;;力細胞，以評價附加的超驅(qū)動和TSS增強子序列的疊加提高轉(zhuǎn)化頻率的能力，以及評價包含低拷貝數(shù)目T-DNA插入和缺少載體骨架序列的事件的比例(例如來自大腸桿菌的on'V)。對照處理包括用缺少超驅(qū)動或者TSS序列的pMON80105的轉(zhuǎn)化。如表l所示，包含疊加的增強子序列的構(gòu)建的使用導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化頻率在統(tǒng)計學(xué)上顯著增加。用這些構(gòu)建體也獲得了高百分比的優(yōu)質(zhì)TF(轉(zhuǎn)化頻率)。優(yōu)質(zhì)TF結(jié)合了TF和具有一個或兩個拷貝的事件。同樣，具有一個或者兩個拷貝的事件百分比也增加了。表1:轉(zhuǎn)化增強子序列對玉米中轉(zhuǎn)化頻率和事件質(zhì)量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表示統(tǒng)計學(xué)顯著性實施例4超驅(qū)動或者TSS增強的RB序列對大豆的轉(zhuǎn)化如在美國專利6,384,301所描述的，用包含的載體pMON83898、pMON83902、pMON87462或pMON87464轉(zhuǎn)化大豆(G/_yc/"emax)細胞，以評價附加的超驅(qū)動和TSS增強子序列的疊加提高轉(zhuǎn)化頻率的能力，以及評價和包含低拷貝數(shù)目的T-DNA插入和缺少載體骨架序列的事件的比例(例如來自大腸桿菌的on'V)。疊加的4x超驅(qū)動序列和18xTSS增強子序列分別在SEQIDNO:10和SEQIDNO:ll中找到。對照處理包括用缺少超驅(qū)動或者TSS序列的pMON83898的轉(zhuǎn)化。如表2-3所示，包含疊加的增強子序列的構(gòu)建體的使用導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化頻率的增加。單拷貝和無骨架序列的轉(zhuǎn)基因抹系的比例也得以增加(表3;列5)。同樣，具有一個或兩個拷貝的事件百分比也得到增加。表2:轉(zhuǎn)化增強子序列對大豆轉(zhuǎn)化頻率的影響增強子序列pMON質(zhì)粒轉(zhuǎn)化頻率(％)對照838982.79IX超驅(qū)動839023.064X超驅(qū)動874624.22'18XTSS874644.10'、克計學(xué)顯著增加表3:轉(zhuǎn)化增強子序列對事件質(zhì)量的影響pMON質(zhì)粒事件總數(shù)on'F陽性/總數(shù)GOI陽性on'F陰性/總數(shù)GOI陽性1個拷貝/陰性不考慮是否存在onT的l或2拷貝83898(對照)316/24(25%)18/24(75%)1(4%)19(79%)83902(IXOD)6116/45(35.5%)29/45(64.5%)6(13.30/<030(66.7%)87462(4XOD)4312/33(36.4%)21/33(63.6%)4(12.1%)23(69.7%)87464(18XTSS)7110/50(20%)40/50(80%)17(34%)37(74%)實施例5另外的轉(zhuǎn)化增強子序列除了上面所用的pTiA6的超驅(qū)動序列外(SEQIDNO:17),其他超驅(qū)動序列(包括反義互補序列)已為現(xiàn)有技術(shù)所知(例如Stmrvinton和Ream,1991)，并且同樣可被使用。這些序列可包括但不限于那些來自于pTiAB3(GenBankM63056)(TGTGAATAAATCGCTGTGTATGTTTGTTTG;SEQIDNO:8)和pTi15955(GenBankAF242881)23(TTGTCTAAATTTCTGTATTTGTTTGTTTG;SEQIDN0:9)，以及共有序歹'JAAACAAACATACACAGCGACTTATTCACA(SEQIDNO:13)和TAARTYNCTGTRTNTGTTTG丁TTG;(SEQIDNO:19,Toro等，1988)等等的序列?？上鄳?yīng)地合成引物并如在實施例l中所描述的進行PCR以創(chuàng)造包含這些序列的DNA區(qū)段，用于構(gòu)建與pMON83902、pMON80121、pMON87462和pMON87465等等類似的重組質(zhì)粒?？捎冒粋€或更多的這些轉(zhuǎn)化增強子序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化作物植抹，并且可以根據(jù)其提高轉(zhuǎn)化頻率和包含低拷貝數(shù)目的T-DNA插入和缺少載體骨架序列的事件比例的能力，對這些增強子序列進行評價。氺氺氺根據(jù)本公開，在本文中公開或要求保護的所有組合物和方法可以在沒有不當(dāng)?shù)膶嶒炏轮苽浜蛯嵭?。雖然已根據(jù)前面的闡述性實施方案對本發(fā)明的組合物和方法作出了描述，但對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的是，在不背離本發(fā)明真實構(gòu)思、精神和范圍下，變更、變化、修改和變動可應(yīng)用于本文描迷的組合物、方法和步驟或方法步驟的順序。更具體地說，可用化學(xué)和生理上皆相關(guān)的某些試劑替代本文所述的試劑同時可以獲得相同或者相似的結(jié)果，這一點是顯而易見的。所有這樣的對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的類似的替代和修改被認為落入根據(jù)所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明精神、范圍和構(gòu)思之內(nèi)。參考文獻下面的參考文獻，在某些程度上其對本文的陳述提供例示性的程序上或其他細節(jié)補充，通過引用被特別結(jié)合到本文中。美國專利5，004,863，美國專利5,094，945;美國專利5,107,065;美國專利5,159,135;美國專利5,273,894;美國專利5,276,268;美國專利5,561,236;美國專利5,569,834;美國專利5,591,616;美國專利美國專利5,633,435美國專利5,750,871美國專利6,040,497美國專利6,384,301美國專利5,637,489;美國專利美國專利5,846.797,美國專利美國專利6,506,559;美國專利美國專利7,022,896;美國專利5,627,061;5,646,024;5,981,840;6,624,344;7,060,876。美國專利系列09/084,942;美國專利系列09/127,735;美國專利系列09/423,143美國專利公開2002/0168707Al;美國專利公開2003/0188345;美國專利公開2004/0140376;美國專利公開2004/244075;美國專利公開2006/0041956。Altschul等，《/.Mo/.5Zo/.,215:403-410,1990。Barker等，尸/a",Mo/.編.,2:335-350，1983。Bird等，歷otecAGe".Wev.,9:207-227,1991。Canaday等，Mo/.Ge"".，235:292-303,1992。Chu等，Sc/e她&mc",18:659,1975。Close等，/,5a"e"'o/.，169(11):5113-5118，1987。Culianez-Macia禾口Hepburn，尸/.5/o/.,11:389-399,1988。Dekeyser等，尸/.尸A;w.0/.，90:217-223，1989。Della-Cioppa等，歷o/rec/mo/ogy,5579-584,1987。Depicker等，Mo/.^;/.:561-573,1982。Duncan等，尸/a"to，165:322-332,1985。Gamborg等，Ce〃版，50:151,1968。Gelvin，M;.c油o/.Mo/ec.腸/.Wev.，67:16-37,2003。Gibson和Shillitoe,Afo/.,7:125-137，1997。Hansen等，Mo/.歷o/.,20(1):113-122，1992。Jen和Chilton,尸rac.A^/.Jcac/,Sd.L4,83(11):3895-3899,1986。Joersbo等，Mo/,^ee丄，4:111-117,1998。Kononov等，945-957，1997。LinsmaierandSkoog,尸/twt，18100,1965。McCownandLloyd,T/oW6W露e，16:453,1981。MikiandMcHugh,乂祝o&c/mo/.，107:193，2004。M扁shigeandSkoog，尸/耐，15:473-497,1962。NitschandNitsch,5We"ce，163:85-87，1969。PCT申請WO01/44482;PCT申請WO02/00900;PCT申請WO04/074443;PCT申請WO04/009761;PCT申請WO05/121346;PCT申請WO05/107437;PCT申請WO95/06722;PCT申請WO97/48814;PCT申請WO98/53083;PCT申請WO99/53050;PCT申請WO99/61631。Peralta等,EMBOJ.5(6):1137-1142,1986.)。Rommens等，尸/a"尸—。/.,139:1338-49,2005。Rommens，7Ve油尸/"w""'.,9:457-64,2004a。Rommens等，尸/a"/尸/z;w'o/.,135:421-31,2004b。Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(MolecularCloning:ALaboratoryManual),第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989.SchenkandHildebrandt,Ca".J5w.，50:199-204，1972.Shaw等，iVMc/ez.c爿d&i^&,12(15):6031-6041,1984。Shurvinton和Ream,/5a"en'o/.,173(17):5558-5563，腦。Slighton等，嵐SOJ:，4(12):3069-3077，1985。Toro等，5acfen'o/.,171(12):6845-6859，1989。Toro等，尸rac.A^/.^c"t/.t/&4，85:8558-8562，1988。26<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>權(quán)利要求1.提高細菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化效率的方法，其包括如下步驟a)將至少一個附加的轉(zhuǎn)化增強子序列引入到包含至少一個T-DNA邊界區(qū)的植物轉(zhuǎn)化載體中，所述T-DNA邊界區(qū)包含轉(zhuǎn)化增強序列；和b)通過細菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化用所述載體轉(zhuǎn)化植物細胞，其中所述細菌能夠轉(zhuǎn)化植物細胞。2.權(quán)利要求1的方法，其中附加的轉(zhuǎn)化增強子序列包含SEQIDNO:20的共有核心序列。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述附加的轉(zhuǎn)化增強子序列包含選自以下的序列SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:13、和與SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9或SEQIDNO:13中的任一個互補的序列。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)化增強子序列位于T-DNA右邊界(RB)序列的近端。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述轉(zhuǎn)化增強子序列來自根瘤農(nóng)桿菌(A/wme/adew力的胭脂堿或章魚堿Ti質(zhì)粒。6.權(quán)利要求4的方法，其中所述轉(zhuǎn)化增強子序列來自發(fā)根農(nóng)桿菌(yl.M&oge"&s)的Ri質(zhì)粒。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述細菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述細菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是根瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述根瘤菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是農(nóng)桿菌(Jgro6a"en'ww)、根瘤菌(i/zz'zoh'wm)、中華才艮瘤菌(57wo/"/iz'zoZz'wm)、中間根瘤菌(Mesor/^o&iwO或慢生根瘤菌(5ra辦r/n'zo&'wm)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。10.權(quán)利要求1的方法，其中所述植物細胞來自選自以下的植物大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、小麥、苜蓿、菜豆、花生、煙草、向日葵、大麥、甜菜、青花椰菜、甘藍、胡蘿卜、花椰菜、芽菜、大白菜、黃瓜、茄子、韭蔥、萵苣、甜瓜、燕麥、洋蔥、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、西葫蘆、蘿卜、高粱、菠菜、南瓜、糖蘿卜、西紅柿和西瓜。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)化增強子序列包含SEQIDNO:IO、SEQIDNO:ll、或與SEQIDNO:10或SEQIDNO:ll互補的序列。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述植物細胞是玉米或者大豆細胞。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述T-DNA邊界區(qū)域包含l-約18個拷貝的所述轉(zhuǎn)化增強子序列。14.權(quán)利要求l的方法，進一步包含以下步驟c)從所述植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植林。15.包含T-DNA邊界序列的重組DNA構(gòu)建體，所述邊界序列可操作地連接到轉(zhuǎn)化增強子序列，后者包含選自以下序列的兩個或更多個拷貝SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:13、與SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:13中的任一個互補的序列、及它們的組合。16.權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述增強子序列包含所述序列的至少約四個拷貝。17.權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述邊界序列是右邊界(RB)序列。18.權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述邊界序列是左邊界(LB)序列。19.權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體包含SEQIDNO:IO。20.權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體包含SEQIDNO:ll。21.權(quán)利要求17的構(gòu)建體，其中所述RB序列來自胭脂堿Ti質(zhì)粒。22.權(quán)利要求17的構(gòu)建體，其中所述RB序列來自章魚堿Ti質(zhì)粒。23.用權(quán)利要求15的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因細胞。24.權(quán)利要求23的細胞，限定為植物或者細菌細胞。25.權(quán)利要求24的細胞，其中所述細胞是農(nóng)桿菌細胞。26.權(quán)利要求24的細胞，其中所述細胞是根瘤菌細胞。27.權(quán)利要求24的細胞，其中植物細胞來自選自以下的植物大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、小麥、苜蓿、菜豆、花生、煙草、向曰葵、大麥、甜菜、青花椰菜、甘藍、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、大白菜、黃瓜、茄子、韭蔥、萵苣、甜瓜、燕麥、洋蔥、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、西葫蘆、蘿卜、高粱、菠菜、南瓜、糖蘿卜、西紅柿和西瓜。28.用權(quán)利要求15的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植林。29.權(quán)利要求28的轉(zhuǎn)基因植抹，限定為選自大豆、玉米、棉花、油菜、水稻、小麥、苜蓿、菜豆、花生、煙草、向日葵、大麥、甜菜、青花椰菜、甘藍、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、大白菜、黃瓜、茄子、韭蔥、萵苣、甜瓜、燕麥、洋蔥、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、西葫蘆、蘿卜、高粱、菠菜、南瓜、糖蘿卜、西紅柿和西瓜。全文摘要本發(fā)明涉及提高農(nóng)桿菌(Agrobacterium)和根瘤菌(Rhizobium)介導(dǎo)的植物細胞轉(zhuǎn)化效率的方法和組合物，通過使用可操作地連接到包含T-DNA的重組構(gòu)建體上的T-DNA邊界序列上的附加轉(zhuǎn)化增強子序列例如超驅(qū)動序列或者TSS序列可實現(xiàn)上述轉(zhuǎn)化效率提高。文檔編號C12N15/82GK101517083SQ200780034442公開日2009年8月26日申請日期2007年7月18日優(yōu)先權(quán)日2006年7月19日發(fā)明者L·吉爾伯森,X·葉申請人:孟山都技術(shù)有限公司