解析和定量無細胞rna的方法【專利摘要】本發(fā)明大體上涉及通過表征生物樣品中的循環(huán)核酸來評估組織的健康狀況的方法。根據(jù)某些實施例，評估組織的健康狀況的方法包括以下步驟：檢測生物樣品中的RNA的樣品含量，比較RNA的樣品含量與對所述組織具有特異性的RNA的參考含量，確定在所述樣品含量與所述參考含量之間是否存在差值，且如果檢測到差值則將所述組織表征為異常。【專利說明】解析和定量無細胞RNA的方法[0001]相關(guān)申請案[0002]本申請案主張在2012年1月27日申請的美國臨時專利申請案序號61/591,642的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，所述美國臨時專利申請案的全部內(nèi)容以引用的方式并入在此。【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0003]本發(fā)明涉及含基因材料的生物樣品中的核酸分析的領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明的方法涉及定量生物樣品中的組織特異性核酸。【
背景技術(shù)：
】[0004]判斷個體體內(nèi)器官的健康狀況常常具有挑戰(zhàn)性。醫(yī)生常常被強制使用昂貴成像技術(shù)或進行針對癌癥篩查的侵入性活檢以識別診斷性生物標記物且監(jiān)測腫瘤起始和進展?；顧z的侵入性性質(zhì)使其不適于患者的普遍篩查。另外，許多診斷性生物標記物僅在癌細胞系中或從獲自患有晚期疾病和癌轉(zhuǎn)移的患者的活檢樣本識別。[0005]已研究針對存在于癌癥患者的血漿和血清中可檢測的循環(huán)核酸（DNA和RNA)以充當(dāng)用于診斷性目的的標記物的潛在用途，其具有作為非侵入性診斷性工具的明顯益處。已顯示血漿內(nèi)的標記物與在患者的致癌組織中所發(fā)現(xiàn)的標記物一致。由于RNA標記物與惡性腫瘤緊密關(guān)聯(lián)，故用于早期檢測癌癥篩查的循環(huán)RNA尤其受關(guān)注。[0006]除癌癥檢測以外，存在于母體血漿中的胎兒特異性無細胞RNA的發(fā)現(xiàn)已打開關(guān)于產(chǎn)前分子診斷的新視野（參看例如潘等人，臨床化學(xué)，46(11):1832-1834(2000)(Poonetal,ClinicalChemistry,46(11):1832-1834(2000)))。具體來說，血漿RNA的分析為胎兒的非侵入性基因表達解析帶來希望。然而，迄今僅少數(shù)妊娠特異性無細胞RNA轉(zhuǎn)錄物已表征。尚未進行這類RNA的綜合解析。[0007]分析非母體和母體血液中的無細胞RNA的一個問題為缺乏合適的數(shù)據(jù)來估計無細胞RNA存在的生物原因。例如，缺乏確定血液中所存在的無細胞RNA的組織來源的可靠方法?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0008]本發(fā)明提供解析無細胞RNA的來源以評估器官或組織的健康狀況的方法。正常無細胞轉(zhuǎn)錄組中的偏離是在隨著器官/組織開始衰竭或被免疫系統(tǒng)或病原體攻擊使那些器官/組織特異性轉(zhuǎn)錄物大量釋放到血液中時引起的。因此，發(fā)炎過程可作為身體對這些有害刺激的復(fù)雜生物反應(yīng)的一部分而發(fā)生。根據(jù)某些方面，本發(fā)明利用健康個體的組織特異性RNA轉(zhuǎn)錄物推斷在正常無細胞轉(zhuǎn)錄組中不同組織的相對最優(yōu)比重，且樣品的各個組織特異性RNA轉(zhuǎn)錄物指示所述組織的凋亡速率。正常無細胞轉(zhuǎn)錄組充當(dāng)評估其他個體的組織健康狀況的基線或參考含量。本發(fā)明包括樣品的無細胞轉(zhuǎn)錄組與正常無細胞轉(zhuǎn)錄組的比較測量，用以評估在血漿中循環(huán)的組織特異性轉(zhuǎn)錄物的樣品含量且用以評估對無細胞轉(zhuǎn)錄組起作用的組織的健康狀況。[0009]除正常參考含量以外，本發(fā)明的方法還利用對其他患者群體具有特異性的無細胞轉(zhuǎn)錄組的參考含量。使用本發(fā)明的方法，人們可確定組織特異性轉(zhuǎn)錄物對母體個體、胎兒個體和/或患有病狀或疾病的個體的無細胞轉(zhuǎn)錄組的相對比重。[0010]通過基于組織特異性轉(zhuǎn)錄物來分析組織的健康狀況，本發(fā)明的方法有利地允許人們無需依賴于疾病相關(guān)蛋白質(zhì)生物標記物而評估組織的健康狀況。在某些方面，本發(fā)明的方法通過以下步驟評估組織的健康狀況：比較生物樣品中的RNA的樣品含量與對組織具有特異性的RNA的參考含量，確定在樣品含量與參考含量之間是否存在差值，且如果檢測到差值則將組織表征為異常。例如，如果患者的特異性組織的RNA表達含量不同于正常無細胞轉(zhuǎn)錄組中的特異性組織的RNA表達含量,此指示患者的組織功能不正常。[0011]在某些方面，本發(fā)明的方法涉及通過如果血液中存在規(guī)定含量的RNA則將組織表征為異常來評估組織的健康狀況。所述方法可進一步包括檢測血液樣品中的RNA的含量，比較RNA的樣品含量與對組織具有特異性的RNA的參考含量，確定在樣品含量與參考含量之間是否存在差值，且如果樣品含量與參考含量相同則將組織表征為異常。[0012]本發(fā)明還提供綜合解析母體血漿中的胎兒特異性無細胞RNA和使用與不同胎兒組織類型的相關(guān)比例來解卷積胎兒來源的無細胞轉(zhuǎn)錄組的方法。本發(fā)明的方法涉及使用下一代測序技術(shù)和/或微陣列表征在妊娠的不同階段存在于母體血漿中的無細胞RNA轉(zhuǎn)錄物。這些轉(zhuǎn)錄物的定量允許人們推斷在整個不同的妊娠期中這些基因的變化，且從而提供轉(zhuǎn)錄物中的時間變化的定量方式。[0013]本發(fā)明的方法實現(xiàn)針對妊娠期間或之后的并發(fā)癥的可能性的診斷和識別。方法還實現(xiàn)依次闡明母體和胎兒發(fā)育程序的妊娠相關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)錄物的識別。本發(fā)明的方法適用于早產(chǎn)診斷以及大體上與胎兒發(fā)育軌跡關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄譜的闡明。由此，本發(fā)明的方法適用于表征胎兒發(fā)育且不限于僅疾病病況或與妊娠關(guān)聯(lián)的并發(fā)癥的表征。所述方法的示例性實施例描述于實施方式、權(quán)利要求和下文提供的圖中。【專利附圖】【附圖說明】[0014]圖1描繪前面檢測的女性妊娠相關(guān)聯(lián)的差異性表達轉(zhuǎn)錄物的列表。[0015]圖2顯示在實例1中獲得的無細胞RNA轉(zhuǎn)錄物含量的兩個主要主成分的曲線。[0016]圖3A描繪使用微陣列在早產(chǎn)和正常妊娠中展現(xiàn)不同時間含量的前100種無細胞轉(zhuǎn)錄物含量的熱圖。[0017]圖3B描繪使用RNA測序在早產(chǎn)和正常妊娠中展現(xiàn)不同時間含量的前100種無細胞轉(zhuǎn)錄物含量的熱圖。[0018]圖4描繪在早產(chǎn)與正常妊娠之間差異性表達的前20種轉(zhuǎn)錄物的排列。[0019]圖5描繪關(guān)于圖4的前20種常見RNA轉(zhuǎn)錄物的基因本體分析的結(jié)果，顯示連接(整合或松散地結(jié)合）到質(zhì)膜或連接在血小板的膜上的蛋白質(zhì)的那些富集轉(zhuǎn)錄物。[0020]圖6描繪在整個不同妊娠期中PVALB的基因表達譜顯示相比于正常妊娠發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)[以藍色突出]具有較高的無細胞RNA轉(zhuǎn)錄物含量。[0021]圖7概述確定占樣品的無細胞轉(zhuǎn)錄組的相對組織比重的示例性方法步驟。[0022]圖8描繪在實例2中產(chǎn)生的一組選定的胎兒組織特異性轉(zhuǎn)錄物。[0023]圖9A和圖9B描繪使用實際無細胞RNA以及相同無細胞RNA的cDNA庫的胎兒組織特異性轉(zhuǎn)錄物的平行定量的原始數(shù)據(jù)，所述原始數(shù)據(jù)顯示在整個母體時間點（早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后）的變化。[0024]圖10說明整個母體時間點（早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后）中胎盤基因的相對表達量。[0025]圖11說明整個母體時間點（早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后）中胎兒大腦基因的相對表達量。[0026]圖12說明整個母體時間點（早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后）中胎兒肝臟基因的相對表達量。[0027]圖13說明不同器官占血漿成人無細胞轉(zhuǎn)錄組的比重的相對組成。[0028]圖14說明使用RNA測序數(shù)據(jù)得到的器官占血漿成人無細胞轉(zhuǎn)錄組的比重的分解。[0029]圖15描繪使用定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR)驗證的實例3中的一組94種組織特異性基因。[0030]圖16顯示圖15的組織特異性轉(zhuǎn)錄物的熱圖，所述組織特異性轉(zhuǎn)錄物在無細胞RNA中可檢測。[0031]圖17描繪根據(jù)某些實施例的此方法的流程圖。[0032]圖18描繪使用來自人類U133A/GNF1H基因阿特拉斯（HumanU133A/GNF1HGeneAtlas)和RNA測序阿特拉斯（RNA-SeqAtlas)數(shù)據(jù)庫的原始數(shù)據(jù)獲得的實例3的組織特異性基因的列表?！揪唧w實施方式】[0033]在此所描述的方法和材料應(yīng)用下一代測序和微陣列技術(shù)的組合用于檢測、定量和表征存在于生物樣品中的RNA序列。在某些實施例中，生物樣品含有來自不同基因組來源(即妊娠女性和胎兒）的基因材料的混合物。[0034]不同于其他以較小反應(yīng)體積使樣品中的核酸分離成標稱單個目標分子的數(shù)字分析方法，本發(fā)明的方法在無需稀釋或分散樣品中的基因材料的情況下進行。本發(fā)明的方法允許多個轉(zhuǎn)錄組同時篩查，且提供各個轉(zhuǎn)錄物在單個核苷酸水平下的信息性序列信息，由此根據(jù)有限量的生物樣品提供針對個體中的廣泛范圍疾病或病狀的非侵入性、高處理量篩查的能力。[0035]在一個特定實施例中，本發(fā)明的方法涉及分析母體血液中的混合胎兒和母體RNA以識別在整個不同妊娠階段中差異性表達的轉(zhuǎn)錄物，所述差異性表達的轉(zhuǎn)錄物可指示早產(chǎn)或病理性妊娠。通過在整個妊娠的不同階段中分離和擴增來自母體血液的血漿RNA且借助微陣列和RNA測序來定量和表征所分離的轉(zhuǎn)錄物而部分實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物的差異性檢測。[0036]如在此所描述的特異性針對分析含有RNA(包括非母體、母體、母體-胎兒混合）的生物樣品的方法和材料僅為本發(fā)明的方法可如何應(yīng)用的一個實例且并不打算限制本發(fā)明。本發(fā)明的方法還適用于使用血液、糞便、痰液、尿液、經(jīng)陰道體液、乳房乳頭吸液、腦脊髓液等中的無細胞RNA篩查與癌癥診斷、進展和/或預(yù)后相關(guān)的靶基因的差異性表達。[0037]在某些實施例中，本發(fā)明的方法大體上包括以下步驟：獲得含有來自不同基因組來源的基因材料的生物樣品，從含有來自不同基因組來源的基因材料的混合物的生物樣品分離總RNA，從總RNA制備擴增的cDNA，對擴增的cDNA進行測序，且數(shù)字計數(shù)和分析并解析擴增的cDNA。[0038]本發(fā)明的方法還涉及評估占無細胞轉(zhuǎn)錄組比重的組織的健康狀況。在某些實施例中，本發(fā)明涉及評估生物樣品的無細胞轉(zhuǎn)錄組以確定個別組織對無細胞轉(zhuǎn)錄組的組織特異性比重。根據(jù)某些方面，本發(fā)明通過檢測生物樣品中的RNA的樣品含量，比較RNA的樣品含量與對組織具有特異性的RNA的參考含量且如果檢測到差值則將組織表征為異常來評估組織的健康狀況。此方法適用于表征非母體個體、妊娠個體和存活胎兒中的組織的健康狀況。圖17描繪根據(jù)某些實施例的此方法的流程圖。[0039]在某些方面，本發(fā)明的方法采用參考無細胞RNA轉(zhuǎn)錄組的解卷積來確定組織的參考含量。優(yōu)選地，參考無細胞RNA轉(zhuǎn)錄組為正常、健康的轉(zhuǎn)錄組,且組織的參考含量為健康、正常的個體的血液中存在的對組織具有特異性的RNA的相對含量。本發(fā)明的方法假設(shè)來自不同組織類型的凋亡細胞釋放其RNA到個體的血漿中。這些組織中的每一個表達特定數(shù)目的對所述組織類型來說獨特的基因，且個體的無細胞RNA轉(zhuǎn)錄組為不同組織類型的總和。每一組織可表達一或多個數(shù)目的基因。在某些實施例中，參考含量為與通過某一組織表達的基因中的一者關(guān)聯(lián)的含量。在其他實施例中，參考含量為與通過某一組織表達的多種基因關(guān)聯(lián)的含量。應(yīng)注意存在于循環(huán)RNA中的組織特異性轉(zhuǎn)錄物的參考含量或臨限量可為零或正數(shù)。[0040]對于健康、正常的個體，來自不同組織類型的循環(huán)RNA的相對比重是相對穩(wěn)定的，且正常個體的無細胞RNA轉(zhuǎn)錄組的各個組織特異性RNA轉(zhuǎn)錄物可充當(dāng)所述組織的參考含量。應(yīng)用本發(fā)明的方法，如果樣品包括不同于對組織具有特異性的RNA參考含量的RNA含量則將所述組織表征為不健康或異常的。如果RNA的實際含量在統(tǒng)計上不同于參考含量則可將樣品的組織表征為不健康的。統(tǒng)計顯著性可通過此項技術(shù)中已知的任何方法來確定。這些測量可用以篩查器官健康狀況，作為診斷性工具和作為測量對藥物的反應(yīng)或在臨床試驗中監(jiān)測健康狀況的工具。[0041]如果檢測到RNA的樣品含量與RNA的參考含量之間的差值，則這類差值表明相關(guān)聯(lián)組織功能不正常。循環(huán)RNA中的變化可為器官衰竭的前兆或指示組織正受免疫系統(tǒng)或病原體的攻擊。如果組織被識別為異常，則根據(jù)某些實施例下一步驟可包括更多深入的組織測試（例如組織的侵入性活檢），開對所述組織具有特異性的療程處方和/或組織的例行監(jiān)測。[0042]本發(fā)明的方法可用以非侵入性推斷器官健康狀況。此非侵入性測試可用以篩查闌尾炎、初期糖尿病和通過糖尿病誘發(fā)的病理性病狀（例如腎病、神經(jīng)病、視網(wǎng)膜病等）。另夕卜，本發(fā)明可用以確定器官移植中的移植物抗宿主疾病的存在，尤其在新免疫系統(tǒng)攻擊皮膚、胃腸道或肝臟的骨髓移植接受者中。本發(fā)明還可用于監(jiān)測實體器官（例如心臟、肺臟和腎臟）移植接受者的健康狀況。本發(fā)明的方法可評估妊娠和胎兒發(fā)育中的早產(chǎn)、子癇前期和異常的可能性。另外，本發(fā)明的方法可用于識別和監(jiān)測涉及細胞特異性死亡（例如神經(jīng)元或因脫髓鞘所致的）或涉及血小板或蛋白質(zhì)凝集物的產(chǎn)生的神經(jīng)性病癥（例如多發(fā)性硬化癥和阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer'sdisease))。[0043]用于確定組織特異性轉(zhuǎn)錄物的參考含量的目的的無細胞轉(zhuǎn)錄組可為一或多個正常個體、母體個體、患有某一病狀和疾病的個體或胎兒個體的無細胞轉(zhuǎn)錄組。就某些病狀來說，組織的參考含量為存在于一或多個患有某一疾病或病狀的個體的血液中的對所述組織具有特異性的RNA的含量。在這類方面中，方法包括檢測血液中的RNA的含量，比較RNA的樣品含量與對組織具有特異性的RNA的參考含量，確定在樣品含量與參考含量之間是否存在差值，且如果樣品含量與參考含量相同則將表征為異常。[0044]無細胞轉(zhuǎn)錄組的解卷積用于確定各個組織類型占無細胞RNA轉(zhuǎn)錄組的相對比重。采用以下步驟以確定樣品中的某些組織的相對RNA比重。第一，識別一組組織特異性轉(zhuǎn)錄物。第二，使用此項技術(shù)中已知的方法確定來自樣品的血漿中的總RNA。第三，根據(jù)這一組組織特異性轉(zhuǎn)錄物評估總RNA，且將總RNA視為這些不同組織特異性轉(zhuǎn)錄物的總和。二次規(guī)劃可以用作推斷不同器官/組織占樣品的無細胞轉(zhuǎn)錄組的相對最優(yōu)比重的限定最優(yōu)化方法。[0045]可將一或多個基因信息數(shù)據(jù)庫用以識別一組組織特異性轉(zhuǎn)錄物。因此，本發(fā)明的方面提供關(guān)于數(shù)據(jù)庫的使用和研發(fā)的系統(tǒng)和方法。確切地說，本發(fā)明的方法利用含有遍及組織類型產(chǎn)生的現(xiàn)存數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫來識別組織特異性基因。組織特異性基因的識別所利用的數(shù)據(jù)庫包括人類133A/GNF1H基因阿特拉斯和RNA測序阿特拉斯，但可以使用任何其他數(shù)據(jù)庫或文獻。為了從一或多個數(shù)據(jù)庫識別組織特異性轉(zhuǎn)錄物，某些實施例采用數(shù)據(jù)庫的模板匹配算法。用于過濾數(shù)據(jù)的模板匹配算法為此項技術(shù)中已知，參看例如帕夫利迪斯P，諾貝爾WS(2001)小鼠大腦中基因表達的應(yīng)變和地區(qū)性變化的分析·基因組生物學(xué)2:研究0042.1-0042.15(PavlidisP,NobleWS(2001)Analysisofstrainandregionalvariationingeneexpressioninmousebrain.GenomeBiol2:research0042.1-0042.15)〇[0046]在某些實施例中，將二次規(guī)劃用作推斷不同器官/組織占樣品中的無細胞轉(zhuǎn)錄組的相對最優(yōu)比重的限定最優(yōu)化方法。二次規(guī)劃為此項技術(shù)中已知且詳細描述于戈德法布和A.伊德納尼（1982).解決嚴格凸二次規(guī)劃的對偶和原始對偶方法.因J.P.亨納特(編），數(shù)值分析，施普林格出版社，柏林，第226-239頁（GoldfarbandA.Idnani(1982).DualandPrimal-DualMethodsforSolvingStrictlyConvexQuadraticPrograms.InJ.P.Hennart(ed.),NumericalAnalysis,Springer-Verlag,Berlin,pages226-239)和D.戈德法布和A.伊德納尼（1983).解決嚴格凸二次規(guī)劃的數(shù)值穩(wěn)定對偶方法.數(shù)學(xué)規(guī)劃，27,1-33(D.GoldfarbandA.Idnani(1983).Anumericallystabledualmethodforsolvingstrictlyconvexquadraticprograms.MathematicalProgramming,27,1-33)中。[0047]圖7概述確定占樣品的無細胞轉(zhuǎn)錄組的相對組織比重的示例性方法步驟。使用由一或多個組織特異性數(shù)據(jù)庫提供的信息，用模板匹配函數(shù)產(chǎn)生一組組織特異性基因。可應(yīng)用質(zhì)量控制函數(shù)來過濾結(jié)果。隨后分析血液樣品以確定各組織特異性轉(zhuǎn)錄物占樣品的總RNA的相對比重。從樣品提取無細胞RNA，且使用一或多種定量技術(shù)（例如標準微陣列和RNA測序方案）來處理無細胞RNA提取物。隨后歸一化所獲得的樣品的基因表達值。此涉及對管家基因的全部基因表達值的重新按比例縮放。然后，使用二次規(guī)劃針對一組組織特異性基因評估樣品的總RNA以便確定占樣品的無細胞轉(zhuǎn)錄組的組織特異性相對比重。在二次規(guī)劃分析期間采用以下限制來獲得估計的相對比重：a)不同組織的RNA比重大于或等于零，和b)占無細胞轉(zhuǎn)錄組的全部比重的總和等于一。[0048]用于確定各個組織的相對比重的本發(fā)明的方法可用以確定組織的參考含量。也就是說，可對某一個體群體（例如母體的、正常的和癌性的）進行在圖7中概述的解卷積方法以獲得所述患者群體的組織特異性基因表達的參考含量。在單獨考慮相對組織比重時，這些組織特異性轉(zhuǎn)錄物中的每一個的定量可以用作特定群體的特定組織的參考凋亡速率的量度。例如，可分析來自一或多個健康、正常個體的血液以確定組織占健康、正常個體的無細胞RNA轉(zhuǎn)錄組的相對RNA比重。構(gòu)成正常RNA轉(zhuǎn)錄組的各個組織的相對RNA比重為組織的參考含量。[0049]根據(jù)某些實施例，可對未知血液樣品進行圖7中所概述的方法來確定占樣品的無細胞RNA轉(zhuǎn)錄組的相對組織比重。隨后比較樣品的相對組織比重與對參考無細胞RNA轉(zhuǎn)錄組的相對比重的一或多個參考含量。如果特異性組織占樣品中的無細胞RNA轉(zhuǎn)錄組的比重顯示為大于或小于參考無細胞RNA轉(zhuǎn)錄組中的特異性組織的比重，則可相應(yīng)表征展現(xiàn)差異性比重的所述組織。如果參考無細胞轉(zhuǎn)錄組代表健康群體，可將在樣品無細胞轉(zhuǎn)錄組中展現(xiàn)差異性RNA比重的組織歸類為不健康的。[0050]生物樣品可為血液、唾液、痰液、尿液、精液、經(jīng)陰道體液、腦脊髓液、汗液、母乳、乳房體液（例如乳房乳頭吸液）、糞便、細胞或組織活檢。在某些實施例中，在多個不同時間點獲得相同生物樣品的樣品以便分析隨時間推移生物樣品中的差異性轉(zhuǎn)錄物含量。例如，可在每個妊娠期中分析母體血漿。在一些實施例中，生物樣品為抽取的血液和循環(huán)核酸，例如無細胞RNA。在血液或血漿中而不是在細胞中發(fā)現(xiàn)可能來自不同基因組來源的無細胞RNA。[0051]在一個特定實施例中，抽取的血液為母體血液。為了獲得充分量的用于測試的核酸，優(yōu)選抽取大致10-50mL的血液。然而，可抽取較少血液用于需要較少統(tǒng)計顯著性或RNA樣品富集胎兒RNA的基因篩查。[0052]本發(fā)明的方法涉及從生物樣品分離總RNA?？墒褂么隧椉夹g(shù)中已知的任何方法從生物樣品中分離總RNA。在某些實施例中，從血漿中提取總RNA。血漿RNA提取描述于恩德斯等人，"在子癇前期母體血漿中的循環(huán)促皮質(zhì)素釋放的激素mRNA的濃度增加"，臨床化學(xué)49:727-731，2003(Endersetal·，"TheConcentrationofCirculatingCorticotropin-releasingHormonemRNAinMaternalPlasmaIsIncreasedinPreeclampsia，"ClinicalChemistry49:727-731,2003)中。如此處所描述，使在離心步驟之后采集的血楽與TRIzolLS試劑（英維羅根（Invitrogen))和氯仿混合。離心混合物，且水層轉(zhuǎn)移到新管中。向水層添加乙醇。隨后將混合物應(yīng)用于RNeasy微型柱（凱杰（Qiagen))且根據(jù)制造商的建議處理。[0053]在生物樣品為母體血液的實施例中，可任選地處理母體血液以富集總RNA中的胎兒RNA濃度。例如，在提取之后，可通過凝膠電泳分離RNA且小心地切除含有具有對應(yīng)于胎兒RNA的尺寸（例如<300bp)的循環(huán)RNA的凝膠組分。從此凝膠切片提取RNA且使用此項技術(shù)中已知的方法洗提。[0054]或者，可通過已知方法來濃縮胎兒特異性RNA，所述方法包括離心和各種酶抑制齊U。使RNA結(jié)合到選擇性膜（例如二氧化硅）以使其與污染物分離。RNA優(yōu)選富集在血漿中循環(huán)的小于300bp的片段。在RNA尺寸分離介質(zhì)（例如電泳凝膠或色譜材料）上進行此尺寸選擇。[0055]流式細胞技術(shù)亦可用于富集母體血液中的胎兒細胞（赫岑伯格等人，美國國家科學(xué)院院刊76:1453-1455(1979)(Herzenbergetal，PNAS76:1453-1455(1979));畢昂奇等人，美國國家科學(xué)院院刊87:3279-3283(1990)(Bianchietal,PNAS87:3279-3283(1990));布魯赫等人，產(chǎn)前診斷11:787-798(1991)(Bruchetal,PrenatalDiagnosisll:787-798(1991)))。美國專利第5,432,054號也描述使用由聚乙烯制成的具有寬頂部和狹窄、毛細管底部的管子的分離胎兒成核紅血球的技術(shù)。使用變速程序的離心在毛細管中產(chǎn)生基于分子的密度的紅血球的堆疊?；厥蘸械兔芏燃t血球（包括胎兒紅血球）的密度部分且隨后有差異地溶血以優(yōu)選地破壞母體紅血球。高滲介質(zhì)中的密度梯度用于從淋巴細胞和破裂母體細胞中分離現(xiàn)富集胎兒紅血球的紅血球。高滲溶液的使用使紅血球收縮，增加所述紅血球的密度且有助于從更密集的淋巴細胞中純化。在已分離胎兒細胞之后，可使用此項技術(shù)中的標準技術(shù)來純化胎兒RNA。[0056]此外，可向母體血液添加穩(wěn)定細胞膜的試劑以減少母體細胞溶解，所述試劑包括（但不限于）醛、尿素甲醛、酚甲醛、DME(二甲基氨基乙醇）、膽固醇、膽固醇衍生物、高濃度的鎂、維生素E和維生素E衍生物、鈣、葡糖酸鈣、牛磺酸、煙酸、羥胺衍生物、氯吡哌醇（bimoclomol)、鹿糖、奸青素、葡萄糖、阿米替林（amitriptyline)、異構(gòu)體A藿燒四苯乙酸酯、異構(gòu)體B藿烷四苯乙酸酯、胞磷膽堿、肌醇、維生素B、維生素B復(fù)合物、膽固醇半丁二酸酯、山梨糖醇、鈣、輔酶Q、泛醌、維生素K、維生素K復(fù)合物、甲基萘醌、唑尼沙胺(zonegran)、鋅、銀杏葉提取物、二苯乙內(nèi)酰脲、泊夫特蘭（perftoran)、聚乙烯批咯燒酮、磷脂酰絲氨酸、得理多（tegretol)、PABA、色甘酸二鈉、奈多羅米鈉（nedocromilsodium)、苯妥英（phenyloin)、朽1檬酸鋅、脈舒律（mexitil)、狄蘭?。╠ilantin)、玻尿酸鈉或泊咯沙姆(polaxamer)188。[0057]使用此試劑的方案的實例如下：在4°C下儲存血液直到處理。在將制動功率設(shè)定在零的情況下在離心機中以1000轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)管子十分鐘。以1000轉(zhuǎn)/分再次旋轉(zhuǎn)管子十分鐘。將各個樣品的上清液（血漿）轉(zhuǎn)移到新管子中且在將制動器設(shè)定在零的情況下以3000轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)十分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新管子中且在-80°c下儲存。將大致兩毫升含有母體細胞的"白細胞層"置放到單獨的管子中且在_80°C下儲存。[0058]本發(fā)明的方法還涉及從總RNA制備擴增的cDNA。制備cDNA且在不稀釋分離的RNA樣品或?qū)⒎蛛x的RNA中的基因材料的混合物分散到離散反應(yīng)樣品中的情況下無差別地擴增cDNA。優(yōu)選地，在3'端處開始擴增以及隨機貫穿樣品中的整個轉(zhuǎn)錄組中以得到mRNA和非聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄物兩者的擴增。由此最優(yōu)化雙鏈cDNA擴增產(chǎn)物以產(chǎn)生用于下一代測序平臺的測序庫。根據(jù)本發(fā)明的方法適用于擴增cDNA的試劑盒包括例如奧偉森?(Ovation?)RNA測序系統(tǒng)。[0059]本發(fā)明的方法還涉及對擴增的cDNA進行測序。盡管任何已知測序方法可用以對擴增的cDNA混合物進行測序，但是單個分子測序方法為優(yōu)選的。優(yōu)選地，通過全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序（在此也被稱為"RNA測序"）對擴增的cDNA進行測序?？墒褂枚喾N下一代測序平臺（例如伊路米那（Illumina)基因組分析儀平臺、ABISOLiD測序平臺或生命科學(xué)454(LifeScience's454)測序平臺）來實現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序（RNA測序）。[0060]本發(fā)明的方法進一步涉及對CDNA進行數(shù)字計數(shù)和分析?？山柚蛄凶x數(shù)（每一擴增鏈一個讀數(shù)）定量擴增樣品中的各個轉(zhuǎn)錄物的擴增序列的數(shù)目。不同于前述數(shù)字分析方法，測序允許在單核苷酸水平下檢測和定量存在于含有來自不同基因組來源的基因材料從而有多個轉(zhuǎn)錄組的生物樣品中的各個轉(zhuǎn)錄物。[0061]在數(shù)字計數(shù)之后，可比較各種擴增轉(zhuǎn)錄物的比率以確定生物樣品中的差異性轉(zhuǎn)錄物的相對量。當(dāng)在不同時間點獲得多個生物樣品時，隨著時間的推移可表征差異性轉(zhuǎn)錄物含量。[0062]還可以使用借助微陣列技術(shù)來分析生物樣品內(nèi)的差異性轉(zhuǎn)錄物含量。擴增的CDNA可用以探測含有與一種或病狀或疾?。ɡ缛魏萎a(chǎn)前病狀或任何類型的癌癥、發(fā)炎或自體免疫疾病）關(guān)聯(lián)的基因轉(zhuǎn)錄物的微陣列。[0063]應(yīng)理解可通過計算機程序指令實施本文所披露的方法和任何流程圖?？蓪⑦@些程序指令提供給計算機處理器，從而在處理器上執(zhí)行的指令形成實施流程圖區(qū)塊中所規(guī)定或本文所披露的評估組織的方法中所描述的行動的方式?？赏ㄟ^處理器執(zhí)行計算機程序指令以使得一系列操作步驟通過處理器進行，從而產(chǎn)生計算機實施的處理。計算機程序指令還可使得至少一些操作步驟同時進行。此外，還可在多于一個處理器上進行一些步驟，例如可在多處理器計算機系統(tǒng)中出現(xiàn)。另外，在不背離本發(fā)明的范圍或精神的情況下，一或多個處理還可與其他處理同時或甚至以與所說明不同的順序進行。[0064]計算機程序指令可儲存在任何合適的計算機可讀媒體上，所述計算機可讀媒體包括（但不限于）RAM、ROM、EEPR0M、快閃存儲器或其他存儲器技術(shù)、CD-ROM、數(shù)字通用光盤(DVD)或其他光學(xué)存儲器、盒式磁帶、磁帶、磁盤存儲器或其他磁性存儲裝置或任何其他可用以存儲所需信息且可通過計算裝置訪問的媒體。[0065]實例[0066]實例1:通討RNA測序解析母體血槳無細朐RNA-綜合方法[0067]綜沭:[0068]在早期妊娠、中期妊娠、分娩后期間使用微陣列和RNA測序采集5個孕婦的血漿RNA譜以及2個未妊娠女性供體和2個男性供體的血漿RNA譜。[0069]在這些孕婦中，有兩個孕婦患有例如早產(chǎn)的臨床并發(fā)癥且一個孕婦具有雙葉胎盤。這些孕婦與正常情況的比較揭示在妊娠的不同時間階段中展現(xiàn)顯著不同的基因表達模式的基因。對與妊娠并發(fā)癥關(guān)聯(lián)的樣品應(yīng)用這類技術(shù)可有助于識別可以用作預(yù)測這些病變的分子標記物的轉(zhuǎn)錄物。[0070]研究設(shè)計和方法：[0071]個體[0072]在早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后期間從5個孕婦采集樣品。還從2個非妊娠女性供體和2個男性供體采集血漿樣品作為對照。[0073]血液采集和處理[0074]將血液樣品采集在EDTA管子中且在4°C下以1600g離心10分鐘。將上清液以ImL等分試樣置于I.5mL微量離心管中，隨后使其在4°C下以16000g離心10分鐘以移除剩余細胞。隨后在_80°C下將上清液儲存在I.5mL微量離心管中直到使用。[0075]RNA提取和擴增[0076]通過TrizolLS試劑提取無細胞母體血漿RNA。使用RNA測序奧偉森試劑盒（努根（NuGen))將提取并純化的總RNA轉(zhuǎn)化成cDNA并擴增。（對于微陣列和RNA測序樣品制備，上述步驟相同）。[0077]使用脫氧核糖核酸酶I將cDNA分成片斷且使用生物素標識，接著雜交到昂飛(Affymetrix)基因芯片STLO微陣列。將伊路米那測序平臺和標準伊路米那庫制備方案用于測序。[0078]數(shù)據(jù)分析:[0079]微陣列與RNA測序之間的相關(guān)性[0080]將RMA算法應(yīng)用于處理原始微陣列數(shù)據(jù)以便背景校正和歸一化。使用RNA測序的CASAVA1.7管線獲得已測序轉(zhuǎn)錄物的RPKM值。將RNA測序中的RPKM和微陣列中的探測強度轉(zhuǎn)化成l〇g2標度。對于RNA測序數(shù)據(jù)，為避免采用0的對數(shù)，在采用對數(shù)之前將RPKM為〇的基因表達設(shè)定成〇.01。隨后計算這兩個平臺范圍之間的相關(guān)系數(shù)。[0081]使用RNA測序的RNA轉(zhuǎn)錄物含量的差異性表達[0082]使用edgeR，即一組特定編寫以分析數(shù)字基因表達數(shù)據(jù)的庫函數(shù)進行差異性基因表達分析。隨后使用DAVID進行基因本體（GeneOntology)以識別顯著富集的GO項。[0083]主成分分析和顯著隨時間變化的基因的識別[0084]使用R中的自定義腳本進行主成分分析。為了識別隨時間變化的基因，將R中的函數(shù)的時程庫用于實施經(jīng)驗貝葉斯（Bayes)方法以便評估涉及時程的實驗中的差異性表達，在我們的情形下時程為各個別患者的不同的妊娠期和分娩后。[0085]結(jié)果與討論[0086]RNA測序揭示妊娠相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄物被檢測到在妊娠與非妊娠個體之間含量顯著不同。[0087]在妊娠與非妊娠個體之間使用RNA測序和基因本體（GeneOntology)分析得出的轉(zhuǎn)錄物含量的比較揭示展現(xiàn)差異性轉(zhuǎn)錄物含量的轉(zhuǎn)錄物顯著與女性妊娠關(guān)聯(lián)，表明RNA測序能夠?qū)崿F(xiàn)因妊娠所致的這兩個種類的轉(zhuǎn)錄組之間的真實差異的觀測。最高分級顯著表達基因為PLAC4,也作為用于研發(fā)基于RNA的第21對染色體三體癥測試的先前研究中的目標而被知曉。最先檢測到的女性妊娠相關(guān)聯(lián)的差異性表達的轉(zhuǎn)錄物的列表顯示在圖1中。[0088]對母體血漿中的血漿細胞無RNA轉(zhuǎn)錄物含量的主成分分析（PCA)區(qū)分早產(chǎn)與正常妊娠[0089]使用血漿無細胞轉(zhuǎn)錄物含量譜作為主成分分析的輸入，將各個患者在不同時間點的譜聚類到不同病理性群集中，表明母體血漿中的無細胞血漿RNA轉(zhuǎn)錄物譜可用以區(qū)分早產(chǎn)和非早產(chǎn)妊娠。[0090]使用微陣列和RNA測序兩者來定量血漿細胞無RNA含量。來自各個患者根據(jù)微陣列和RNA測序的轉(zhuǎn)錄物表達含量譜為相關(guān)的，具有大致0.7的皮爾遜（Pearson)相關(guān)系數(shù)。無細胞RNA轉(zhuǎn)錄物含量的兩個主要主成分的曲線顯示在圖2中。[0091]母體血漿中的無細胞RNA轉(zhuǎn)錄物的識別展現(xiàn)在全部三個妊娠期和分娩后在早產(chǎn)與正常妊娠之間顯著不同的隨時間變化的趨勢[0092]使用微陣列在早產(chǎn)及正常妊娠中展現(xiàn)不同時間含量的前100種無細胞轉(zhuǎn)錄物含量的熱圖顯示在圖3A中。使用RNA測序在早產(chǎn)及正常妊娠中展現(xiàn)不同時間含量的前100種無細胞轉(zhuǎn)錄物含量的熱圖顯示在圖3B中。[0093]在全部三個妊娠期和分娩后在早產(chǎn)與正常妊娠之間展現(xiàn)顯著不同的隨時間變化的趨勢的通過微陣列和RNA測序識別的常見無細胞RNA轉(zhuǎn)錄物[0094]在早產(chǎn)與正常妊娠之間差異性表達的前20種轉(zhuǎn)錄物的排列顯示在圖4中。使用基因本體來分析這些前20種常見RNA轉(zhuǎn)錄物且其顯示為富集連接（整合或松散地結(jié)合）到質(zhì)膜或在血小板膜上的蛋白質(zhì)（參看圖5)。[0095]PVALB的基因表達譜[0096]由PVALB基因編碼的蛋白質(zhì)為在結(jié)構(gòu)上和功能上類似于調(diào)鈣蛋白和肌鈣蛋白C的高親和力鈣離子結(jié)合蛋白。所編碼的蛋白質(zhì)被認為與肌肉松弛有關(guān)。如圖6中所示，在不同妊娠期中PVALB的基因表達譜顯示相比于正常妊娠發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)[以藍色突出]具有較高的無細胞RNA轉(zhuǎn)錄物含量。[0097]結(jié)論:[0098]來自使用RNA測序定量和表征母體血漿無細胞RNA的結(jié)果強烈表明可檢測到妊娠相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄物。[0099]此外，RNA測序和微陣列方法均可檢測可觀的基因轉(zhuǎn)錄物，所述基因轉(zhuǎn)錄物的含量顯示具有與早產(chǎn)關(guān)聯(lián)的高機率的差異性時間趨勢。[0100]可修改在此所描述的方法以研究不同病理性情形的孕婦且還可以修改所述方法以研究在更頻繁的時間點的時間變化。[0101]實例2:在妊娠期間展現(xiàn)時間奪化的纟目織特異件無細朐RNA的定量[0102]綜沭:[0103]已廣泛采用在母體血漿中發(fā)現(xiàn)的無細胞胎兒DNA用于非侵入性診斷。相比之下，已顯示在母體循環(huán)中以類似方式檢測的無細胞胎兒RNA已作為診斷形式而被廣泛應(yīng)用。胎兒無細胞RNA和DNA均面臨類似的區(qū)分胎兒組份與母體組份的挑戰(zhàn)，因為在兩種情況下母體組份均占優(yōu)勢。為了檢測胎兒來源的無細胞RNA，可專注于僅在胎兒發(fā)育期間高度表達的基因，所述基因隨后推斷為胎兒來源且易于與背景母體RNA區(qū)分。此類觀點通過已確定在妊娠期間來源于在胎盤中高度表達的基因的無細胞胎兒RNA可在母體血漿中檢測的研究來協(xié)作。[0104]使RNA與DNA分離的顯著特征可歸因于在胎兒發(fā)育期間充分反映的RNA轉(zhuǎn)錄物動態(tài)性質(zhì)。生命以由授精而形成單細胞受精卵開始且由具有相異組織類型的多細胞生物體結(jié)束的一系列精心設(shè)計的事件開始。在妊娠期間，大部分胎兒組織經(jīng)歷大范圍的重構(gòu)且含有功能上相異的細胞類型。此潛在相異性可作為來自相同細胞核譜系的差異性基因表達的結(jié)果產(chǎn)生；盡管不同細胞類型的基因組相同，RNA轉(zhuǎn)錄物的量決定不同細胞類型制造不同量的蛋白質(zhì)。人類基因組包括大致30,000個基因。在特定分化的細胞類型內(nèi)僅較小組的基因轉(zhuǎn)錄為RNA。已經(jīng)通過許多涉及經(jīng)典動物模型的發(fā)育胎兒的研究和數(shù)據(jù)庫來識別這些組織特異性RNA轉(zhuǎn)錄物。將可獲得的已知文獻與借助測序而由樣品產(chǎn)生的高處理量數(shù)據(jù)組合，可表征母體血漿內(nèi)所含有的RNA轉(zhuǎn)錄物的整個集合。[0105]在妊娠期間胎兒器官形成取決于基因表達的連續(xù)程序。RNA量的時間調(diào)節(jié)對于產(chǎn)生伴隨胎兒器官起源的細胞分化現(xiàn)象的此進展為必需的。為了闡明無細胞RNA的類似時間動態(tài)，將母體血漿無細胞RNA的表達圖譜（尤其所選的一組胎兒組織特異性基因）作為在妊娠和分娩后期間的全部三個妊娠期中的函數(shù)來分析。利用高處理量定量聚合酶鏈反應(yīng)和測序技術(shù)能力用于無細胞胎兒組織特異性RNA轉(zhuǎn)錄物的同時定量，獲得母體血漿中胎兒來源的RNA轉(zhuǎn)錄物的光譜的系統(tǒng)含量視圖。另外，分析母體血漿從而以不同胎兒組織類型的相對比例解卷積胎兒來源的異質(zhì)無細胞轉(zhuǎn)錄組?？紤]母體血漿中的胎兒比重此方法并有生理限制，具體來說要求各個胎兒組織的比重的百分率為非負的且在妊娠的全部三個妊娠期期間總和為一。這些數(shù)據(jù)集上的限制使結(jié)果能夠解釋為來自不同胎兒器官的相對比例。也就是說，先前選定的展現(xiàn)時間變化的胎兒組織特異性RNA轉(zhuǎn)錄物的圖表可以用作應(yīng)用二次規(guī)劃以便確定一或多個樣品中的相關(guān)組織特異性RNA比重的基礎(chǔ)。[0106]在分別考慮時，母體血漿內(nèi)的這些胎兒組織特異性轉(zhuǎn)錄物中的每一個的定量可以用作在妊娠期間所述特定胎兒組織的凋亡速率的測量。通過細胞分裂和凋亡細胞死亡來嚴格調(diào)控正常胎兒器官發(fā)育。發(fā)育組織競爭存活和激增，且器官尺寸為細胞增殖與死亡之間的平衡的產(chǎn)物。由于異常細胞死亡與發(fā)育疾病之間的緊密關(guān)聯(lián)，凋亡的治療性調(diào)變已變?yōu)槊芗芯康念I(lǐng)域，但隨著這個帶來對于監(jiān)測特定的凋亡速率的需求。胎兒無細胞RNA轉(zhuǎn)錄物的定量提供這類預(yù)測值，尤其在早產(chǎn)中，其中這些早產(chǎn)嬰兒的各個器官的凋亡發(fā)生率已顯示造成早產(chǎn)嬰兒的神經(jīng)發(fā)育性缺陷和大腦性麻痹。[0107]樣品采集和研究設(shè)計[0108]胎兒組織特異性轉(zhuǎn)錄物圖表的選擇[0109]為了檢測這些胎兒組織特異性轉(zhuǎn)錄物的存在，根據(jù)已知文獻和數(shù)據(jù)庫制備已知胎兒組織特異性基因的列表。通過在兩個主要數(shù)據(jù)庫之間交叉引用來證實胎兒組織的特異性=TISGeD(肖，S.-J.，張，C.和季，Z.-L.TiSGeD:組織特異性基因的數(shù)據(jù)庫·生物信息學(xué)（牛津，英格蘭）26,1273-1275(2010))(Xiao,S.-J.，Zhang,C.&Ji，Z.-L.TiSGeDiaDatabaseforTissue-SpecificGenes.Bioinformatics(Oxford,England)26,1273-1275(2010)))和BioGPS(吳，C.等.BioGPS:查詢和組織基因注釋來源的可擴展和可定制門戶·基因組生物學(xué)10，R130(2009)(Wu,C.etal.BioGPS:anextensibleandcustomizableportalforqueryingandorganizinggeneannotationresources.Genomebi〇l〇gyl0，R130(2009));蘇，A.I.等.小鼠和人類蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄組的基因.美國國家科學(xué)院院刊101，6062-7(2004))(Su,A.I.etal.Ageneatlasofthemouseandhumanprotein-encodingtranscriptomes.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmericalOl,6062-7(2004)))。這些選定的轉(zhuǎn)錄物的大部分與已知胎兒發(fā)育過程關(guān)聯(lián)?；虻拇肆斜砼cRNA測序和微陣列數(shù)據(jù)重疊以產(chǎn)生顯示在圖8中的選定胎兒組織特異性轉(zhuǎn)錄物的圖表。[0110]個體[0111]在早期妊娠、中期妊娠、晚期妊娠和分娩后期間從正常孕婦采集母體血液的樣品。對于陽性對照，從安捷倫（Agilent)購買來自各個胎兒組織類型的胎兒組織特異性RNA。通過用水以及用未經(jīng)歷反轉(zhuǎn)錄處理的樣品整體處理進行所述實驗的陰性對照。[0112]血液采集和處理[0113]在各個時間點，從各個個體抽取7mL到15mL的外周血液。以1600g離心血液10分鐘且轉(zhuǎn)移到微量離心機管子中以便以ieooog進一步離心?ο分鐘從而移除剩余細胞。在血液抽取的24小時內(nèi)進行上述步驟。在-80攝氏度下儲存所得血漿用于后續(xù)RNA提取。[0114]RNA提取[0115]使用Trizol接著凱杰的RNeasy微型試劑盒來承載無細胞RNA提取物。為了確保沒有污染DNA，在使用來自凱杰的無核糖核酸酶的脫氧核糖核酸酶洗提RNA之后進行脫氧核糖核酸酶分解。隨后使用標準微陣列和伊路米那RNA測序方案處理所得的來自妊娠個體的無細胞RNA。這些步驟產(chǎn)生我們用于產(chǎn)生RNA測序數(shù)據(jù)以及微陣列表達數(shù)據(jù)的測序庫。隨后將其余無細胞RNA用于平行定量聚合酶鏈反應(yīng)。[0116]選定轉(zhuǎn)錄物的平行定量聚合酶鏈反應(yīng)[0117]使用富魯達生物標記（FluidigmBioMark)系統(tǒng)進行這些胎兒組織特異性轉(zhuǎn)錄物的準確定量（參看例如司布真，S.L.，瓊斯，R.C.和拉馬克里希南，R.使用微流體動態(tài)陣列中的實時聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)的高處理量基因表達測量.公共科學(xué)圖書館?綜合3,el662(2008)(Spurgeon,S.L.，Jones,R.C.&Ramakrishnan,R.HighthroughputgeneexpressionmeasurementwithrealtimePCRinamicrofluidicdynamicarray.PloS〇ne3，el662(2008)))。此系統(tǒng)允許胎兒組織特異性轉(zhuǎn)錄物的圖表的同時查詢。使用材料的不同起始來源進行詢問的兩個平行形式。一個使用來自伊路米那測序方案的cDNA庫而另一個直接使用洗提RNA。使用靶向所關(guān)注的基因的EvaGreen引物擴增材料的兩種來源。兩種來源RNA和cDNA均經(jīng)預(yù)擴增。使用EvaGreen聚合酶鏈反應(yīng)超混合液和引物預(yù)擴增cDNA。使用來自英維羅根的CellsDirect-步定量實時-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR)試劑盒預(yù)擴增RNA來源。對默認一步定量實時-聚合酶鏈反應(yīng)方案進行修改以供應(yīng)較長的反轉(zhuǎn)錄培育時間。為兩種來源進行19次預(yù)擴增循環(huán)且使用核酸外切酶I處理清除采集的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物。為了增加定量隨后的定量聚合酶鏈反應(yīng)步驟的效率的動態(tài)范圍和能力，由5倍、10倍和10倍稀釋對聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物進行連續(xù)稀釋。在所述時間點從個別孕婦采集的母體血漿中的每一個經(jīng)歷相同程序且裝載到來自富魯達（Fluidigm)的48X48動態(tài)陣列芯片上以進行定量聚合酶鏈反應(yīng)。對于陽性對照，從安捷倫購買來自各個胎兒組織類型的胎兒組織特異性RNA。這些來自胎兒組織的RNA中的每一個經(jīng)歷相同預(yù)擴增和清除步驟。同樣產(chǎn)生具有相同的不同胎兒組織比例的合并樣品用于隨后的分析從而解卷積合并樣品中的各個組織類型的相對比重。使用富魯達實時聚合酶鏈反應(yīng)分析軟件預(yù)處理來自富魯達生物標記(FluidigmBioMark)系統(tǒng)的全部采集數(shù)據(jù)以獲得全部樣品中的轉(zhuǎn)錄物中的每一個的對應(yīng)Ct值。通過用水以及用未經(jīng)歷反轉(zhuǎn)錄處理的樣品整體處理進行所述實驗的陰性對照。[0118]數(shù)據(jù)分析:[0119]在出生之后的較短時間段內(nèi)從母體周邊血流清除胎兒組織特異性RNA轉(zhuǎn)錄物。也就是說，母體血液的分娩后無細胞RNA轉(zhuǎn)錄組不具有胎兒組織特異性RNA轉(zhuǎn)錄物。因此，預(yù)期這些胎兒組織特異性轉(zhuǎn)錄物的量在出生之前高于出生之后。所關(guān)注的數(shù)據(jù)為在妊娠的全部三個妊娠期中與嬰兒出生之后的此基線含量相比較組織特異性轉(zhuǎn)錄物的相對定量變化。如方法所描述，同時均使用有效無細胞RNA以及相同無細胞RNA的cDNA庫來定量胎兒組織特異性轉(zhuǎn)錄物。所獲得的原始數(shù)據(jù)的實例顯示在圖9A和圖9B中。使用無細胞RNA作為初始來源的定量聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)得到較好品質(zhì)的讀數(shù)。以來自直接無細胞RNA來源的定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果為重點，通過使用分娩后的含量作為比較基線比較在全部三個妊娠期中這些胎兒組織特異性轉(zhuǎn)錄物中的每一個的倍數(shù)變化含量來進行分析。采用Λ-ACt方法(施米特根，T.D.和利瓦克，K.J.通過比較CT方法分析實時聚合酶鏈反應(yīng)數(shù)據(jù).自然實驗手冊3,1101-1108(2008)(Schmittgen，T.D.&Livak，K.J.Analyzingreal-timePCRdatabythecomparativeCTmethod.NatureProtocols3,1101-1108(2008)))。轉(zhuǎn)錄物表達含量中的每一個與管家基因相比較以得到ACt值。隨后，為了比較各個妊娠期出生之后，使用分娩后數(shù)據(jù)作為基線來應(yīng)用Λ-ACt方法。[0120]結(jié)果和論沭:[0121]如圖10、11和12中所示，與出生之后相比較在所述妊娠期期間大體上發(fā)現(xiàn)組織特異性轉(zhuǎn)錄物處于較高含量。確切地說，胎盤、胎兒大腦和胎兒肝臟特異性轉(zhuǎn)錄物的組織特異性圖表顯示相同偏差，其中通常發(fā)現(xiàn)在妊娠期間這些轉(zhuǎn)錄物以相較于出生之后更高的含量存在。在不同妊娠期之間，大體趨勢顯示這些轉(zhuǎn)錄物的量隨著妊娠的進展增加。[0122]定量胎兒組織特異性RNA的生物顯著性：圖表中的大部分轉(zhuǎn)錄物與胎兒器官發(fā)育有關(guān)且也在羊水內(nèi)發(fā)現(xiàn)許多。一次這類實例為ZNF238。此轉(zhuǎn)錄物對胎兒大腦組織具有特異性且已知在形成神經(jīng)元層時在胚胎發(fā)生期間所述轉(zhuǎn)錄物對于大腦皮質(zhì)擴張至關(guān)重要。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中ZNF238的缺失引起神經(jīng)形成的嚴重破壞，產(chǎn)生顯著的產(chǎn)后較小大腦表型。使用本發(fā)明的方法，可根據(jù)發(fā)育階段確定ZNF238是否以健康、正常的含量存在。[0123]已知的因ZNF238的缺失所致的缺陷包括顯著的產(chǎn)后較小大腦表型：小頭畸形、胼胝體的發(fā)育不全和小腦發(fā)育不全。[0124]有時在出生之前通過產(chǎn)前超聲波可診斷小頭畸形。然而，在許多情況下通過超聲波并不明顯直到晚期妊娠。通常，在出生或隨后的嬰兒期之前未進行診斷知道發(fā)現(xiàn)寶寶的頭圍比正常的小得多。小頭畸形為終身病狀且目前不可治療。伴隨小頭畸形出生的兒童將需要醫(yī)生頻繁的檢查和診斷性測試以在他或她生長時監(jiān)測頭部的發(fā)育。使用本發(fā)明的方法的ZNf238差異性表達的早期檢測提供產(chǎn)前診斷且在治療過程期間可控制藥物治療和投藥的預(yù)測值。[0125]除ZNF238以外，許多經(jīng)表征轉(zhuǎn)錄物可控制涉及凋亡的發(fā)育疾病（即由在神經(jīng)發(fā)育期間不必要神經(jīng)元的移除引起的疾?。┲械脑\斷性值。鑒于在發(fā)育期間神經(jīng)元的凋亡為基本的，可推知在神經(jīng)退行性疾?。ɡ绨柎暮Ｄ喜?、亨廷頓氏病和肌肉萎縮性側(cè)索硬化）中可激活類似凋亡。在此類情境中，在此所描述的方法將提供對于疾病進展的緊密監(jiān)測和可能根據(jù)進展提供理想劑量。[0126]推斷不同胎兒組織類型的相對比重：特異性組織的凋亡的差異性速率可與某些發(fā)育疾病直接相關(guān)。也就是說，某些發(fā)育疾病可增加在母體轉(zhuǎn)錄組中觀察到的具體特異性RNA轉(zhuǎn)錄物的含量。來自各個組織類型的相對比重的知識將實現(xiàn)這些疾病的進展期間的變化的這些類型的觀測。妊娠期間的胎兒組織特異性轉(zhuǎn)錄物的定量圖表可被視為來自各個胎兒組織的比重的總和。[0127]表達，【權(quán)利要求】1.一種評估組織的健康狀況的方法，所述方法包含檢測生物樣品中的RNA的樣品含量；比較RNA的所述樣品含量與對所述組織具有特異性的RNA的參考含量；確定在所述樣品含量與所述參考含量之間是否存在差值；以及如果檢測到差值則將所述組織表征為異常。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包含監(jiān)測所述組織以得到疾病進展的步驟。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述參考含量對應(yīng)于所述組織在一個時間點的狀態(tài)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述參考含量為對于健康狀態(tài)下的所述組織具有特異性的RNA的含量。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物樣品為血液、血液組分、唾液、痰液、尿液、精液、經(jīng)陰道體液、腦脊髓液、糞便、細胞或組織活檢。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述生物樣品為血液。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述RNA為無細胞RNA。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測步驟是借助測序技術(shù)、微陣列技術(shù)或兩者來進行。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述測序技術(shù)為全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述參考含量是通過計算機生成的數(shù)據(jù)庫來確定。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組織是選自由以下組成的組：全血、骨髓、下丘腦、平滑肌、肺臟、胸腺、淋巴結(jié)和甲狀腺。12.-種評估組織的健康狀況的方法，所述方法包含如果血液中存在規(guī)定含量的RNA則將所述組織表征為異常。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述組織是選自由以下組成的組：全血、骨髓、下丘腦、平滑肌、肺臟、胸腺、淋巴結(jié)和甲狀腺。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其進一步包含檢測血液樣品中的RNA的含量；比較RNA的樣品含量與對組織具有特異性的RNA的參考含量；確定在所述樣品含量與所述參考含量之間是否存在差值，以及如果所述樣品含量和所述參考含量相同則將所述組織表征為異常。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述參考含量指示疾病或病狀。16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述RNA為無細胞RNA。17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述檢測步驟是借助測序技術(shù)、微陣列技術(shù)或兩者來進行。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述測序技術(shù)為全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序。19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述參考含量是通過計算機生成的數(shù)據(jù)庫來確定。20.-種從包含來自不同基因組來源的基因材料混合物的生物樣品檢測差異性轉(zhuǎn)錄物含量的方法，所述方法包含以下步驟：a)在不同時間點獲得多個生物樣品，每個樣品含有來自不同基因組來源的基因材料的混合物；b)擴增來自所述多個生物樣品的多個RNA轉(zhuǎn)錄物以獲得多個擴增樣品，每個擴增樣品含有來自不同基因組來源的擴增RNA轉(zhuǎn)錄物的混合物；c)檢測來自所述擴增樣品中的每一個的所述RNA轉(zhuǎn)錄物中的一或多個的含量；以及d)進行比較所述擴增樣品中的每一個之間的所述RNA轉(zhuǎn)錄物中的一或多個的含量的分析以確定在不同時間點所檢測的RNA轉(zhuǎn)錄物中的一或多個的差異性圖譜。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述生物樣品為血液、血液組分、唾液、痰液、尿液、精液、經(jīng)陰道體液、腦脊髓液、糞便、細胞或組織活檢。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述生物樣品為血液。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述血液為來源于孕婦的外周血液或其組分。24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述不同基因組來源來源于妊娠女性和胎兒。25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述檢測步驟是借助測序技術(shù)、微陣列技術(shù)或兩者來進行。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述測序技術(shù)為全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中一或多個RNA轉(zhuǎn)錄物的所述差異性圖譜指示疾病或病狀。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述疾病或病狀為早產(chǎn)妊娠。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述疾病或病狀為病理性妊娠。30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述差異性圖譜包括由以下組成的族群中選出的一或多個基因：PVALB、CLCN3、ITGA2B、LTV1、HIST1H4B、TREML1、NPTN、LSM2、SCGB1C1、勵卩10、]\0^01、嫩1^1'1、0)11、11151'1111(：、11151'111411、0)226、幾]\128、]\^1^6、六勵6和打683。【文檔編號】C40B30/04GK104334742SQ201380017554【公開日】2015年2月4日申請日期:2013年1月28日優(yōu)先權(quán)日:2012年1月27日【發(fā)明者】L·C·W·蔻,S·R·魁克申請人:利蘭斯坦福青年大學(xué)董事會