專利名稱：一種紅細(xì)胞吸附法聯(lián)合rt-pcr檢測具有血凝性病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紅細(xì)胞吸附法聯(lián)合RT-PCR檢測具有血凝性病毒的方法，具體涉及一種以新城疫為研究對(duì)象，采用紅細(xì)胞吸附法聯(lián)合RT-PCT檢測具有血凝性病毒的方法。
背景技術(shù)：
有些病毒能吸附于雞、火雞和鴨等動(dòng)物的紅細(xì)胞表面，并引起紅細(xì)胞凝集，這種特性與病毒囊膜上的纖突所含血凝素和神經(jīng)氨酸酶有關(guān)。具有這種特性的病毒主要有新城疫和禽流感等。0(Newcastle Disease, ND)(Newcastle disease virus, NDV)引起的一種極易傳染的毀滅性疾病，典型癥狀是呼吸道、消化道黏膜出血，最常侵襲家雞，也能感染許多其它家禽和野鳥，人也有易感性。該病1擬6年首次發(fā)現(xiàn)于印尼，同年發(fā)現(xiàn)于英國新城，因此得名新城疫。該病分布于世界各地，1928年我國已有該病的記載，1935年在我國有些地區(qū)流行。新城疫感染的死亡率高達(dá)100%，同高致病性禽流感同屬A類病，給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的威脅。目前用于檢測NDV的方法有血凝和血凝抑制試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、病毒分離法等，這些方法雖然可以對(duì)病原作出診斷，但卻存在費(fèi)時(shí)、代價(jià)高、敏感性和穩(wěn)定性不夠好的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種紅細(xì)胞吸附法聯(lián)合RT-PCR檢測具有血凝性病毒的方法。以新城疫病毒(NDV)作為研究對(duì)象，選取NDV的核衣殼蛋白的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，利用其能吸附于雞、火雞和鴨等動(dòng)物的紅細(xì)胞表面這一重要生物學(xué)特性， 建立一種適合于NDV快速檢測的紅細(xì)胞吸附聯(lián)合RT-PCR法。本發(fā)明方法敏感性和穩(wěn)定性都很好，具有較大的臨床運(yùn)用價(jià)值，也同樣適合于禽流感等具有血凝性病毒的檢測。本發(fā)明的紅細(xì)胞吸附法聯(lián)合RT-PCR檢測具有血凝性病毒的方法，具體包括以下步驟1)制備紅細(xì)胞用滅菌注射器吸取檸檬酸抗凝劑ImL (其用量為所需血量的1/4體積)，從雞翅靜脈抽血4mL，置滅菌離心管內(nèi)，加滅菌PBSlOmL，以2000r/min離心5min，棄上清液，再加滅菌 PBS IOmL懸浮血球，再以2000r/min離心5min，如此將紅細(xì)胞洗滌三次即可。2)紅細(xì)胞吸附NDV取出從雞場采集的污染糞便0. Ig,加2mLPBS振蕩混勻，使病毒溶解于PBS中，以 10000r/min離心5min，取離心后上清液加約50uL的紅細(xì)胞，室溫作用1小時(shí)，2000r/min離心5min，棄上清，沉淀即為含有NDV的紅細(xì)胞。如果污染的病料中含極少NDV，可通過紅血球多次吸附以集中NDV。3)病毒RNA提取
RNA提取按1Trizol-A+提取總RNA說明書進(jìn)行。4) RT-PCR 擴(kuò)增i)引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上已公布的NDV-NP基因序列，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性引物，能擴(kuò)增 578bp的基因片段。引物序列如下NP-Fl 5' TATTCTGTCTTCGGATTGCT 3‘NP-Rl 5' GCTCCCACCTGCTGTATT 3'以上引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。ii)反轉(zhuǎn)錄冰上操作，在PCR管中依次加入焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水6 μ L，5 X反轉(zhuǎn)錄酶 Buffer 4 μ L，dNTP Mixture (IOmM) 1 μ L, NP 上游引物 Fll μ L(10 μ Μ)，RNA 酶抑制劑 1 μ L, NDV病毒RNA 5 μ L，AMV反轉(zhuǎn)錄酶2 μ L (5U/ μ L)，總體積20 μ L。在冰上混合后，室溫放置 IOmin, 420C Ih后冰上冷卻2 ^iin ；所得的反應(yīng)液可立刻用于PCR反應(yīng)或_20°C保存?zhèn)溆?。iii)PCR 反應(yīng)在PCR 管中依次加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μ L，IOXBuffer (Mg2+free) 2. 5 μ L, MgS042 μ L， dNTP (IOmM) 1 μ L, NP-FU NP-Rl (10 μ Μ)各 1 μ L, Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0. 25 μ L, ddH20 15. 25 μ L ；總體積25 μ L在冰上混合。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，49°C退火25s，72°C延伸60s，循環(huán) 32次，最后72°C延伸IOmin05)敏感性試驗(yàn)取出凍存的新城疫病毒尿囊液20uL到2mL的PBS內(nèi)，震蕩混勻后從中取200uL到 2mL的PBS內(nèi)，依次類推，共稀釋九個(gè)梯度。一組未做處理，另一組用紅血球吸附NDV，分別抽提病毒RNA，用RT-PCR法檢測其敏感性。6)穩(wěn)定性試驗(yàn)取出感染有F48E9，ND79和La Sorta毒株的雞糞便和腎臟，用紅細(xì)胞吸附法和 RT-PCR法共同檢測NDV。本發(fā)明的紅細(xì)胞吸附法聯(lián)合RT-PCR檢測方法具有較好的敏感性和穩(wěn)定性，且臨床運(yùn)用價(jià)值較大，還可適用于禽流感等具有血凝性病毒的檢測。


圖1為敏感性試驗(yàn)結(jié)果，其中M為Marker DL2000，1 5為紅血球吸附聯(lián)合 RT-PCR法檢測第5 第9稀釋梯度的NDV結(jié)果，6 10為只用RT-PCR法檢測第5 第9 稀釋梯度的NDV結(jié)果。圖2為穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中M為Marker DL2000，1、3、5分別為感染F48E9、ND79 和LaSorta雞糞便的檢測結(jié)果，2、4、6分別為感染F48E9、ND79和LaSorta雞腎臟的檢測結(jié)^ ο
具體實(shí)施例方式
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以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。其中，F(xiàn)48E9，ND79和La Sorta毒株均由上海農(nóng)科院畜牧所病毒課題組提供。AMV反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制劑、dNTP及DNA MarkerDL-2000等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。Trizol-A+總RNA提取試劑購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。實(shí)施例11)制備紅細(xì)胞用滅菌注射器吸取檸檬酸抗凝劑lmL，從雞翅靜脈抽血4mL，置滅菌離心管內(nèi)，加滅菌PBSlOmL，以2000r/min離心5min，棄上清液，再加滅菌PBSlOmL懸浮血球，再以2000r/ min離心5min，如此將紅細(xì)胞洗滌三次即可。2)紅細(xì)胞吸附NDV取出從雞場采集的污染糞便0. Ig,加2mLPBS振蕩混勻，使病毒溶解于PBS中，以 10000r/min離心5min，取離心后上清液加約50uL的紅細(xì)胞，室溫作用1小時(shí)，2000r/min離心5min，棄上清，沉淀即為含有NDV的紅細(xì)胞。如果污染的病料中含極少NDV，可通過紅血球多次吸附以集中NDV。3)病毒RNA提取RNA提取按1Trizol-A+提取總RNA說明書進(jìn)行。實(shí)施例2RT-PCR 擴(kuò)增i)引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上已公布的NDV-NP基因序列，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性引物，能擴(kuò)增 578bp的基因片段。引物序列如下NP-Fl 5' TATTCTGTCTTCGGATTGCT 3‘NP-Rl 5' GCTCCCACCTGCTGTATT 3'以上引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。ii)反轉(zhuǎn)錄冰上操作，在PCR管中依次加入焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水6 μ L，5X反轉(zhuǎn)錄酶 Buffer 4 μ L，dNTP Mixture (IOmM) 1 μ L, NP 上游引物 Fll μ L(10 μ Μ)，RNA 酶抑制劑 1 μ L, 病毒RNA 5 μ L，AMV反轉(zhuǎn)錄酶2 μ L (5U/ μ L)，總體積20 μ L。在冰上混合后，室溫放置lOmin， 42°C Ih后冰上冷卻2 ;3min ；所得的反應(yīng)液可立刻用于PCR反應(yīng)或_20°C保存?zhèn)溆?。iii)PCR 反應(yīng)在PCR 管中依次加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μ L，IOXBuffer (Mg2+free) 2. 5 μ L, MgS042 μ L， dNTP (IOmM) 1 μ L, NP-FU NP-Rl (10 μ Μ)各 1 μ L, Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0. 25 μ L, ddH20 15. 25 μ L ；總體積25 μ L在冰上混合。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，49°C退火25s，72°C延伸60s，循環(huán) 32次，最后72°C延伸IOmin0實(shí)施例3敏感性試驗(yàn)取出凍存的新城疫病毒尿囊液20uL到2mL的PBS內(nèi)，震蕩混勻后從中取200uL到2mL的PBS內(nèi)，依次類推，共稀釋九個(gè)梯度。一組未做處理，另一組用紅血球吸附NDV，分別抽提病毒RNA，用RT-PCR法檢測其敏感性，結(jié)果參見圖1。從圖1可以看出通過紅血球吸附聯(lián)合RT-PCR法共同檢測的NDV，在第8個(gè)稀釋梯度之前的都能檢測到一條為578bp的條帶。而僅通過RT-PCR法檢測的NDV，在最初的第 5稀釋梯度時(shí)就已檢測不到條帶，說明紅血球吸附聯(lián)合RT-PCR法檢測NDV的敏感性要高于僅用RT-PCR法至少104以上。實(shí)施例4穩(wěn)定性試驗(yàn)取出感染有F48E9，ND79和LaSorta毒株的雞糞便和腎臟，分別用紅細(xì)胞吸附法聯(lián)合RT-PCR共同檢測NDV，結(jié)果參見圖2。從圖2可以看出感染有F48E9，ND79和LaSorta毒株的雞糞便和腎臟都能檢測到一條578bp的條帶。由此得知紅細(xì)胞吸附法聯(lián)合RT-PCR不僅適用于NDV不同的毒株，而且還可以適用于不同的樣品間。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
權(quán)利要求
1.一種紅細(xì)胞吸附法聯(lián)合RT-PCR檢測具有血凝性病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟1)制備紅細(xì)胞；2)紅細(xì)胞吸附新城疫病毒；3)病毒RNA提取；4)RT-PCR 擴(kuò)增；5)敏感性試驗(yàn)；6)穩(wěn)定性試驗(yàn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述制備紅細(xì)胞過程中檸檬酸抗凝劑的用量為所需血量的1/4體積。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR擴(kuò)增的引物序列如下 NP-Fl 5' TATTCTGTCTTCGGATTGCT 3‘NP-Rl 5' GCTCCCACCTGCTGTATT 3'。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有血凝性病毒為新城疫病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅細(xì)胞吸附法聯(lián)合RT-PCR檢測具有血凝性病毒的方法，以新城疫病毒NDV作為研究對(duì)象，選取NDV的核衣殼蛋白的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，利用其能吸附于雞、火雞和鴨等動(dòng)物的紅細(xì)胞表面這一重要生物學(xué)特性，建立適合于NDV快速檢測的紅細(xì)胞吸附聯(lián)合RT-PCR法。具體包括以下步驟1)制備紅細(xì)胞；2)紅細(xì)胞吸附新城疫病毒；3)病毒RNA提??；4)RT-PCR擴(kuò)增；5)敏感性試驗(yàn)；6)穩(wěn)定性試驗(yàn)。本發(fā)明具有較好的敏感性和穩(wěn)定性，臨床運(yùn)用價(jià)值大，可適用于禽流感等具有血凝性病毒的檢測。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102234692SQ20101015478
公開日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者劉成倩, 易建中 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院