本實(shí)用新型涉及微流控技術(shù)和免疫熒光技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種定量檢測(cè)卡。

背景技術(shù)：

近年來(lái)因自身免疫障礙而導(dǎo)致的不孕問題越發(fā)引起人們的重視，抗精子抗體(AsAb)是免疫性不孕最常見的一種因素?？咕涌贵w(AsAb)是一個(gè)復(fù)雜的病理產(chǎn)物，其作用主要表現(xiàn)為精子凝集、精子制動(dòng)，影響精子的運(yùn)送，抑制精子穿透宮頸黏液，限制精子與卵透明帶粘附，抑制精子頂體的活性，使精子不易穿透包繞卵細(xì)胞的放射冠和透明帶，阻礙精子與卵細(xì)胞膜的融合，阻止精子與卵子結(jié)合等。

微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸為數(shù)十到數(shù)百微米)處理或操縱微小流體(體積為納升到阿升)的一種技術(shù)。當(dāng)微通道的特征尺寸在微米甚至納米量級(jí)時(shí)，微通道表面積與其內(nèi)部空間的體積之比很大，通道的結(jié)構(gòu)、形狀和壁面性質(zhì)都將對(duì)其中的流體流動(dòng)狀態(tài)產(chǎn)生極大的影響。流體在微流控的微通道中具有獨(dú)特的流體性質(zhì)，如層流和液滴等。借助這些獨(dú)特的流體現(xiàn)象，微流控可以實(shí)現(xiàn)一系列常規(guī)方法所難以完成的微加工和微操作。

免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)是免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，使用熒光微球標(biāo)記已知的抗原或抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在檢測(cè)過程中，采用熒光微球最佳激發(fā)光源進(jìn)行激發(fā)，發(fā)射出的熒光經(jīng)過濾光片后，用CCD掃描技術(shù)或光纖技術(shù)，將發(fā)射光譜收集、聚集和倍增后，轉(zhuǎn)換成數(shù)值信號(hào)，實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光變化曲線。

目前市面上抗精子抗體檢測(cè)試劑盒多采用酶聯(lián)免疫吸附法和淺盤凝集法，這些方法尚存在以下方面的不足：

酶聯(lián)免疫吸附法是采用正常精子膜抗原包被反應(yīng)板，加待測(cè)標(biāo)本及酶標(biāo)記二抗底物顯色，陽(yáng)性為明顯黃色，陰性孔不顯色。此方法操作復(fù)雜，且影響因素較多，檢測(cè)結(jié)果易受外界因素的干擾。

淺盤凝集法是將微量正常精子與待測(cè)標(biāo)本在淺盤中混合，鏡下觀察有無(wú)凝集。有活動(dòng)的凝集精子為陽(yáng)性。此方法靈敏度低，且較易受到外界因素的干擾。

以上兩種傳統(tǒng)方法均是定性或半定量的檢測(cè)方法，無(wú)法檢測(cè)到血液中抗精子抗體的含量水平。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)問題，本實(shí)用新型的目的在于提供一種定量檢測(cè)卡，使用的熒光微球不受外界環(huán)境的影響，因而熒光穩(wěn)定，而且通過微流控技術(shù)控制待測(cè)血液在檢測(cè)卡上的流速，為定量檢測(cè)提供了良好的條件。采用微流控技術(shù)和免疫熒光技術(shù)制成包括覆有濾紙的加樣區(qū)、噴涂熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗的結(jié)合區(qū)、微通道、包被有抗精子二抗并具有特殊結(jié)構(gòu)的檢測(cè)區(qū)和廢液區(qū)的抗精子抗體定量檢測(cè)卡。具體技術(shù)方案如下：

一種定量檢測(cè)卡，包括底卡和面卡，其中，所述底卡上設(shè)有加樣區(qū)，結(jié)合區(qū)，微通道，檢測(cè)區(qū)以及廢液區(qū)，所述加樣區(qū)連接結(jié)合區(qū)且加樣區(qū)與結(jié)合區(qū)位于微通道的一端，所述檢測(cè)區(qū)連接廢液區(qū)且位于微通道的另一端；所述面卡上設(shè)有加樣孔和檢測(cè)孔，所述底卡和面卡的背面扣合連接。

所述面卡上的加樣孔所處位置對(duì)應(yīng)于底卡上加樣區(qū)的位置，所述面卡上的檢測(cè)孔所處位置對(duì)應(yīng)于底卡上檢測(cè)區(qū)的位置。

所述結(jié)合區(qū)和檢測(cè)區(qū)分別設(shè)置于微通道的兩端并直接連接至微通道。

所述加樣區(qū)覆有濾紙，所述結(jié)合區(qū)噴涂熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗，所述檢測(cè)區(qū)包被有抗精子二抗并具有特殊結(jié)構(gòu)微通道。

所述濾紙直徑1.5cm、孔徑為1-3μm，所述微通道通過軟光刻技術(shù)制成，寬度為5μm。

所述面卡上的加樣孔連通至底卡上加樣區(qū)，所述面卡上的檢測(cè)孔連通至底卡上檢測(cè)區(qū)。

上述抗精子抗體定量檢測(cè)卡的制作方法，包括如下步驟：

(1)制作底卡模板；

(2)制備熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗；

(3)噴涂熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗；

(4)包被抗精子二抗；

(5)粘覆濾紙粘覆；

(6)制備完成抗精子抗體定量檢測(cè)卡。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，采用聚二甲基硅氧烷材質(zhì)，利用光刻機(jī)設(shè)備，經(jīng)過CAD制圖、掩模、光刻、再鑄模、軟光刻工藝過程來(lái)完成底卡模板的制作，其中微通道為5μm；和/或，步驟(2)中，通過聚苯乙烯微球的合成、微球染色、熒光微球標(biāo)記，將熒光微球標(biāo)記在抗精子二抗上；和/或，步驟(3)中，用噴金機(jī)將熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗按照5μl的量均勻噴涂至底卡模板的結(jié)合區(qū)；和/或，步驟(4)中，用0.01M PBS調(diào)節(jié)抗精子二抗的濃度為0.6mg/ml，將所得的溶液按照2μl的量均勻噴涂在底卡模板的檢測(cè)區(qū)；和/或，步驟(5)中，將直徑為1.5cm、孔徑為1～3μm的圓形濾紙粘覆在底卡模板的加樣區(qū)；和/或，步驟(6)中，將面卡和制備好的底卡按合，壓緊。

上述抗精子抗體定量檢測(cè)卡的使用方法，包括如下步驟：

a.取1mg制備的熒光微球加入90μl 50mg/ml對(duì)乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC)，150μl 5mg/ml氮經(jīng)基唬拍酞亞胺(NHS)，振蕩混勻，室溫孵育30min；

b.離心；

c.沉淀用0.01M的硼酸鹽緩沖液溶解，并調(diào)節(jié)微球濃度為OD₄₅₀為0.6；

d.將0.1ml熒光微球中加入6μl抗精子二抗，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h；

e.用超純水洗滌離心3次；

f.沉淀用0.01M的PBS溶液復(fù)溶沉淀至起始體積后，即為熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗。

進(jìn)一步地，步驟b中1000×g離心15min，步驟c中硼酸鹽緩沖液pH為4.8，調(diào)節(jié)熒光微球的濃度為OD₄₅₀是0.6，步驟f中PBS溶液為磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20。

與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型檢測(cè)過程中，采用熒光檢測(cè)儀實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光微球在最佳激發(fā)光源的激發(fā)下所發(fā)出的熒光數(shù)值，測(cè)出熒光變化曲線，對(duì)照其標(biāo)準(zhǔn)曲線，取兩點(diǎn)熒光值所對(duì)應(yīng)的抗精子抗體的標(biāo)準(zhǔn)濃度值，通過公式即可換算出待測(cè)血清中抗精子抗體的含量。本實(shí)用新型靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定且定量準(zhǔn)確。

具體來(lái)說(shuō)：

1、本實(shí)用新型采用熒光微球標(biāo)記抗精子二抗。熒光微球是一種載有熒光分子的功能性微球，有比較穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)及發(fā)光行為，故而不易受到外界因素的干擾。

2、本實(shí)用新型采用微流控技術(shù)和免疫熒光技術(shù)，通過5μm的微通道控制待測(cè)血液在檢測(cè)卡上的流速，加上熒光微球穩(wěn)定高效的發(fā)光效率，定量檢測(cè)待測(cè)血液中抗精子抗體的含量。

3、本實(shí)用新型采用檢測(cè)卡形式，只需滴一滴待測(cè)血液即可完成檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高。

附圖說(shuō)明

圖1是抗精子抗體定量檢測(cè)卡的底卡結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是抗精子抗體定量檢測(cè)卡的面卡結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面根據(jù)附圖對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行詳細(xì)描述，其為本實(shí)用新型多種實(shí)施方式中的一種優(yōu)選實(shí)施例。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，一種定量檢測(cè)卡，包括底卡和面卡，其中，底卡上設(shè)有加樣區(qū)11，結(jié)合區(qū)12，微通道13，檢測(cè)區(qū)14以及廢液區(qū)15，加樣區(qū)11連接結(jié)合區(qū)12且加樣區(qū)11與結(jié)合區(qū)12位于微通道13的一端，檢測(cè)區(qū)14連接廢液區(qū)15且位于微通道13的另一端；面卡上設(shè)有加樣孔21和檢測(cè)孔22，底卡和面卡的背面扣合連接。

面卡上的加樣孔21所處位置對(duì)應(yīng)于底卡上加樣區(qū)11的位置，面卡上的檢測(cè)孔22所處位置對(duì)應(yīng)于底卡上檢測(cè)區(qū)14的位置。

結(jié)合區(qū)12和檢測(cè)區(qū)14分別設(shè)置于微通道13的兩端并直接連接至微通道13。

加樣區(qū)11覆有濾紙，結(jié)合區(qū)12噴涂熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗，檢測(cè)區(qū)14包被有抗精子二抗并具有特殊結(jié)構(gòu)微通道。

濾紙直徑1.5cm、孔徑為1-3μm，微通道13通過軟光刻技術(shù)制成，寬度為5μm。

面卡上的加樣孔21連通至底卡上加樣區(qū)11，面卡上的檢測(cè)孔22連通至底卡上檢測(cè)區(qū)14。

優(yōu)選地，一種抗精子抗體定量檢測(cè)卡是采用聚二甲基硅氧烷(也稱硅酮彈性體或硅橡膠，PDMS)材質(zhì)制成，由底卡和面卡組成，底卡構(gòu)造包括覆有濾紙的加樣區(qū)11、噴涂熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗的結(jié)合區(qū)12、微通道13、包被有抗精子二抗并具有特殊結(jié)構(gòu)微通道的檢測(cè)區(qū)14和廢液區(qū)15，面卡包含加樣孔和檢測(cè)孔，面卡構(gòu)造包括加樣孔21和檢測(cè)孔22。

底卡構(gòu)造中加樣區(qū)粘覆有濾紙，濾紙直徑1.5cm、孔徑為1～3μm，底卡構(gòu)造中包含通過軟光刻技術(shù)制成的微通道，微通道為5μm，底卡中結(jié)合區(qū)噴涂熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗，底卡中檢測(cè)區(qū)帶有彎型通道的特殊結(jié)構(gòu)。

一種抗精子抗體定量檢測(cè)卡是采用一種熒光微球標(biāo)記抗精子二抗的方法：取1mg制備的熒光微球加入90μl 50mg/ml對(duì)乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC)，150μl 5mg/ml氮經(jīng)基唬拍酞亞胺(NHS)，振蕩混勻，室溫孵育30min后，1000×g離心15min，沉淀用0.01M的硼酸鹽緩沖液(pH4.8)溶解，并調(diào)節(jié)微球濃度為OD₄₅₀為0.6。將0.1ml熒光微球中加入6μl抗精子二抗，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復(fù)溶沉淀至起始體積后，即為熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗。

調(diào)節(jié)熒光微球的濃度為OD₄₅₀是0.6，0.1ml熒光微球中加入6μl抗精子二抗。

在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，可以采用如下方案：一種抗精子抗體定量檢測(cè)卡，通過抗精子抗體定量檢測(cè)卡的底卡模板的制作、熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗的制備、包被抗精子二抗、濾紙粘覆、抗精子抗體定量檢測(cè)卡的制備等步驟完成抗精子抗體定量檢測(cè)卡的制作，具體包括以下步驟：

抗精子抗體定量檢測(cè)卡的底卡模板的制作：采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材質(zhì)，利用光刻機(jī)設(shè)備，經(jīng)過CAD制圖、掩模、光刻、再鑄模、軟光刻等工藝過程來(lái)完成底卡模板的制作，微通道為5μm。

熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗的制備：通過聚苯乙烯微球的合成、微球染色、熒光微球標(biāo)記，將熒光微球標(biāo)記在抗精子二抗上。

噴涂熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗：用噴金機(jī)將熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗按照5μl的量均勻噴涂至底卡模板的結(jié)合區(qū)。

包被抗精子二抗：用0.01M PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)調(diào)節(jié)抗精子二抗的濃度為0.6mg/ml，將所得的溶液按照2μl的量均勻噴涂在底卡模板的檢測(cè)區(qū)。

濾紙粘覆：將直徑為1.5cm、孔徑為1～3μm的圓形濾紙粘覆在底卡模板的加樣區(qū)。

抗精子抗體定量檢測(cè)卡的制備：將面卡和制備好的底卡按合，壓緊，再將組裝好的檢測(cè)卡裝入鋁箔袋中，加入干燥劑后封口保存，與室溫干燥環(huán)境下可保存一年。

通過微通道控制待測(cè)樣品的流速，再利用免疫熒光技術(shù)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光變化曲線，再根據(jù)一定時(shí)間內(nèi)熒光變化值換算待測(cè)樣品中抗精子抗體的濃度水平值。

制作方法優(yōu)選實(shí)施例：

一、抗精子抗體定量檢測(cè)卡的底卡模板的制作

本實(shí)用新型檢測(cè)卡的底卡是采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材質(zhì)，利用光刻機(jī)設(shè)備，經(jīng)過CAD制圖、掩模、光刻、再鑄模、軟光刻等工藝過程來(lái)完成底卡模板的制作，微通道為5μm。

二、熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗的制備

1、聚苯乙烯微球的合成

將乙醇50ml和分散劑聚乙烯吡咯烷酮1.80g置于100ml圓底燒瓶中，攪拌成均相體系。引發(fā)劑偶氮二異丁腈0.24g和單體苯乙烯12.00g混合并超聲振蕩溶解，通氮?dú)鈼l件下加入到圓底燒瓶中，保持70℃條件聚合反應(yīng)12h。得到的乳液樣品用乙醇洗滌3次，除去未反應(yīng)完全的單體和引發(fā)劑，置于真空干燥箱(60℃、80kPa)干燥24h。

2、微球染色

取三氯甲烷0.5ml和異丙醇4.5ml的混合溶劑、吐溫-2050mg、聚苯乙烯微球0.1g、R101(羅丹明101)8mg置于25ml燒杯中，超聲分散10min；將上述混合液在真空干燥箱(30℃、80kPa)放置12h，當(dāng)所有溶劑都揮發(fā)后，用乙醇洗滌微球、離心，重復(fù)3次除去未反應(yīng)的熒光素。

3、熒光微球標(biāo)記

取1mg上述制備的熒光微球加入90μl 50mg/ml對(duì)乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC)，150μl 5mg/ml氮經(jīng)基唬拍酞亞胺(NHS)，振蕩混勻，室溫孵育30min后，1000×g離心15min，沉淀用0.01M的硼酸鹽緩沖液(pH4.8)溶解，并調(diào)節(jié)微球濃度為OD₄₅₀為0.6。將0.1ml熒光微球中加入6μl抗精子二抗，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復(fù)溶沉淀至起始體積后，即為熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗。

三、噴涂熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗

用噴金機(jī)將熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗按照5μl的量均勻噴涂至底卡模板的結(jié)合區(qū)，30℃真空干燥1～2h，放于室溫干燥環(huán)境中備用。

四、包被抗精子二抗

用0.01M PBS(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)調(diào)節(jié)抗精子二抗的濃度為0.6mg/ml，將所得的溶液按照2μl的量均勻噴涂在底卡模板的檢測(cè)區(qū)，30℃真空干燥12h，于室溫干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

五、濾紙粘覆

將直徑為1.5cm的圓形濾紙粘覆在底卡模板的加樣區(qū)。

六、抗精子抗體定量檢測(cè)卡的制備

將面卡和制備好的底卡按合，壓緊，再將組裝好的檢測(cè)卡裝入鋁箔袋中，加入干燥劑后封口保存，與室溫干燥環(huán)境下可保存一年。

如圖1所示，該抗精子抗體定量檢測(cè)卡的底卡構(gòu)造包括覆有濾紙的加樣區(qū)11、噴涂熒光微球標(biāo)記的抗精子二抗的結(jié)合區(qū)12、微通道13、包被有抗精子二抗并具有特殊結(jié)構(gòu)微通道的檢測(cè)區(qū)14和廢液區(qū)15。

如圖2所示，該抗精子抗體定量檢測(cè)卡的面卡構(gòu)造包括加樣孔21和檢測(cè)孔22。檢測(cè)步驟如下：

1、樣品檢測(cè)：平放檢測(cè)卡，將待測(cè)血清平衡至室溫，用已滅菌的一次性滴管吸取待測(cè)血清滴一滴至加樣孔，立即將檢測(cè)卡放至熒光檢測(cè)儀中。熒光檢測(cè)儀實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光微球在最佳激發(fā)光源的激發(fā)下所發(fā)出的熒光數(shù)值。

2、結(jié)果分析：通過熒光分析軟件分析所測(cè)熒光的變化曲線，對(duì)照其標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出A₁、A₂熒光值所對(duì)應(yīng)的抗精子抗體的標(biāo)準(zhǔn)濃度值A(chǔ)sAb₂、AsAb₁。

AsAb₀表示待測(cè)血清中抗精子抗體的含量，AsAb₁、AsAb₂表示A₁、A₂熒光值所對(duì)應(yīng)的抗精子抗體的標(biāo)準(zhǔn)濃度值，V表示在微通道中血清流體的流速，t₁、t₂表示A₁、A₂熒光值所對(duì)應(yīng)的時(shí)間，根據(jù)以下公式換算出待測(cè)血清中抗精子抗體的含量：

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