專利名稱：實(shí)時(shí)定量pcr檢測人p190的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新的P190bcr/abl轉(zhuǎn)錄本快速定量PCR檢測試劑盒，使P190bcr/abl轉(zhuǎn)錄本的測定更為快速、方便，并且能夠精確定量。
背景技術(shù)：
白血病包括急性和慢性白血病是威脅人類生命的主要疾病之一，目前呈逐年上升趨勢。染色體易位所致的相關(guān)融合基因形成是引起白血病發(fā)生的一個(gè)重要分子基礎(chǔ)，在白血病患者的診斷、預(yù)后判斷、療效判斷和微小殘留病(MRD)檢測中具有十分重要的意義。t(9；22)易位導(dǎo)致bcr/abl融合基因形成，可見于95％以上的慢性粒細(xì)胞白血病(CML)、1～5％的成人急性髓系白血病(AML)和20～40％的成人急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)中。bcr/abl融合基因主要有兩種形式P210bcr/abl和P190bcr/abl。
P190bcr/abl轉(zhuǎn)錄本檢測主要通過聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)，該技術(shù)的基本原理是在待擴(kuò)增的片段兩端分別設(shè)計(jì)一個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸引物，在耐熱DNA聚合酶的作用下，在體外以dNTPs為原料、以待測核酸為模板反復(fù)擴(kuò)增，可以使微量目的核酸擴(kuò)增上百萬倍，再將產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，以溴乙錠染色，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果，PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各種感染性疾病和惡性腫瘤的分子診斷。目前PCR方法主要有定性和定量檢測兩種定性檢測主要應(yīng)用巢式PCR，其優(yōu)點(diǎn)是非常靈敏，但其缺點(diǎn)是僅能顯示陽性、陰性結(jié)果，無具體數(shù)值，不能觀察其動(dòng)態(tài)變化和根據(jù)數(shù)值進(jìn)行預(yù)后判斷，且操作繁瑣；定量方法為競爭性PCR，是在定性PCR的基礎(chǔ)上，以不同稀釋度的內(nèi)參(修飾的對照核酸)與標(biāo)本共同擴(kuò)增，以內(nèi)參的稀釋度及結(jié)果作標(biāo)準(zhǔn)曲線，判斷標(biāo)本中目的核酸的量；雖然競爭性PCR能夠準(zhǔn)確定量，但是操作更為繁瑣，難以在臨床上常規(guī)開展。
隨著技術(shù)的發(fā)展，又產(chǎn)生了實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR，RQ-PCR)。TaqMan探針RQ-PCR技術(shù)及相應(yīng)檢測儀器如PE5700、PE7700的推出有效地克服定性PCR和競爭性定量PCR的不足，能快速、簡便、特異地對P190bcr/abl轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行精確定量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明試劑盒包含PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2、特異性TaqMan探針、特異性引物、Taq酶、標(biāo)準(zhǔn)品和對照品。
特異性引物分上游引物和下游引物上游引物序列為5’-GCAGATCTGGCCCAACGAT-3’，下游引物序列為5’-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3’，特異性探針序列為5’-FAM-CGGCCAGTA GCATCTGACTTTGAGCCT-TAMRA-3’標(biāo)準(zhǔn)品中所含P190bcr/abl序列為CGCTCTCCCT CGCAGAACTC GCAACAGTCC TTCGACAGCA GCAGTCCCCCCACGCCGCAG TGCCATAAGC GGCACCGGCA CTGCCCGGTT GTCGTGTCCGAGGCCACCAT CGTGGGCGTC CGCAAGACCG GGCAGATCTG GCCCAACGATGGCGAGGGCG CCTTCCATGG AGACGCAGAA GCCCTTCAGC GGCCAGTAGCATCTGACTTT GAGCCTCAGG GTCTGAGTGA AGCCGCTCGT TGGAACTCCAAGGAAAACCT TCTCGCTGGA CCCAGTGAAA ATGACCCCAA CCTTTTCGTTGCACTGTATG ATTTTGTGGC CAGTGGAGAT AACACTCTAA GCATAACTAAAGGTGAAAAG CTCCGGGTCT TAGGCTATAA TCACAATGGG GAATGGTGTGAAGCCCAAAC CAAAAA
對照品分為陽性對照和陰性對照，陽性對照為有P190bcr/abl的ALL患者的cDNA樣品，陰性對照為正常人cDNA樣品。
本試劑盒保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。
本發(fā)明建立了利用TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測P190bcr/abl表達(dá)的方法，并經(jīng)檢測患者和正常對照標(biāo)本，表明該方法切實(shí)可行。由于本方法采用的是先進(jìn)的TaqMan熒光探針雜交定量PCR技術(shù)，可以對檢測標(biāo)本進(jìn)行精確定量；并且由于使用的是互補(bǔ)探針，使得PCR擴(kuò)增的特異性大為提高，降低了定性PCR擴(kuò)增的假陽性率；此外，由于本方法采用的是閉管操作，不需電泳及凝膠成像等PCR后處理，使定性和競爭性定量PCR的后處理操作所引起的污染大為減少，并且使檢測時(shí)間縮短工作更為簡便。
本發(fā)明試劑盒使用方法每次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。標(biāo)準(zhǔn)品用無菌去離子水稀釋為108～102拷貝/μl。
擴(kuò)增檢測在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，總體積25μl，其中μl無菌雙蒸水、2.5μl PCR緩沖液、4μl MgCl2、特異性引物各1μl、1μl TaqMan探針、1U Taq DNA聚合酶和1μl檢測樣品(標(biāo)準(zhǔn)品、待測cDNA、陽性對照或陰性對照)。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，然后94℃15s、60℃1min共45個(gè)循環(huán)，根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待測標(biāo)本中P190bcr/abl轉(zhuǎn)錄本的量(拷貝數(shù)/μl)。


圖1為實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測3次的熒光擴(kuò)增曲線(108～102拷貝/μl)。
圖2為實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1熒光定量PCR法檢測P190bcr/abl的表達(dá)一、材料Trizol試劑購自美國Gibco公司，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNAsin購自美國Invitrogen公司，dNTPs、Taq DNA聚合酶購自美國MBI公司，PE5700熒光定量PCR儀為美國Perkin Elmer公司產(chǎn)品。
二、引物及探針設(shè)計(jì)與合成以P190bcr/abl全長cDNA序列(Genbank登錄號X06418)為模板，使用Primer Express2.0軟件(美國PE公司)設(shè)計(jì)RQ-PCR的引物和TaqMan探針序列，并應(yīng)用Primer Premier5.0軟件(美國PremierBiosoft公司)對所設(shè)計(jì)的序列進(jìn)行評價(jià)，從中選擇最佳組合。RQ-PCR上游引物序列為5’-GCAGATCTGGCCCAACGAT-3’，下游引物序列為5’-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3’，TaqMan探針序列為5’-FAM-CGGCCAGTA GCATCTGACTTTGAGCCT-TAMRA-3’，引物和探針均由上海博亞公司合成。
標(biāo)準(zhǔn)品PCR上游引物序列為5’-CGCTCTCCCTCGCAGAACT-3’，下游引物序列為5’-TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3’，均由上海生工公司合成。
三、檢測標(biāo)準(zhǔn)品制備取1例P190bcr/abl陽性ALL患者骨髓標(biāo)本經(jīng)Ficoll液分離單個(gè)核細(xì)胞，RPMI1640無菌洗滌2次，離心收集細(xì)胞加入Trizol試劑提取總RNA，取2μg總RNA，在40μl反應(yīng)體系中用六隨機(jī)引物和MMLV對其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，用標(biāo)準(zhǔn)品PCR上下游引物在PE5700型PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為95℃預(yù)變性5min，然后94℃30秒、58℃30秒、72℃60秒共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸5分鐘后置4℃保存。
PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離純化，用T-A克隆法克隆入pMD18-T載體，并將陽性克隆經(jīng)測序鑒定。標(biāo)準(zhǔn)品即為攜帶陽性克隆的pMD18-T載體，全長3108bp，測定其含量并稀釋至109拷貝/μl，置-20℃保存。
實(shí)施例2熒光定量PCR法檢測P190bcr/abl轉(zhuǎn)錄本的應(yīng)用一、標(biāo)本檢測經(jīng)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)確診的19例CML和2例ALL患者骨髓標(biāo)本，應(yīng)用Ficoll液分離單個(gè)核細(xì)胞(BMNC)，經(jīng)PBS洗滌后離心收集細(xì)胞用加入Trizol提取總RNA，取2μg總RNA，在40μl反應(yīng)體系中用六隨機(jī)引物和MMLV對其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，用RQ-PCR上下游引物在PE5700型PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為95℃預(yù)變性5min，然后94℃15秒、60℃1分鐘共擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。同時(shí)加標(biāo)準(zhǔn)品檢測作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出檢測標(biāo)本的P190bcr/abl表達(dá)量。
二、結(jié)果(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果參見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖2。
(二)樣品檢測19例患者骨髓MNC標(biāo)本檢測結(jié)果如下

本發(fā)明是結(jié)合最佳實(shí)施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種實(shí)時(shí)定量PCR檢測人P190bcr/abl融合基因轉(zhuǎn)錄本的快速定量檢測試劑盒，其特征在于PCR緩沖液、dNTPs、MgCl2、特異性TaqMan探針、特異性引物、Taq酶、標(biāo)準(zhǔn)品和對照品。
2.根據(jù)權(quán)利1，反應(yīng)體系為1×PCR緩沖液、0.3μM特異性引物、0.2mM dNTPs、4.0mMMgCl2、0.2μM TaqMan探針、1U Taq酶。
3.根據(jù)權(quán)利1所述的試劑盒，其特征是上下游特異性引物序列為5’-GCAGATCTGGCCCAACGAT-3’和5’-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利1所述的試劑盒，其特征是特異性探針為熒光標(biāo)記探針，其序列為5’-FAM-CGGCCAGTA GCATCTGACTTTGAGCCT-TAMRA-3’。
5.根據(jù)權(quán)利1所述的試劑盒，其特征是標(biāo)準(zhǔn)品濃度為109拷貝/μl，所含P190bcr/abl序列為CGCTCTCCCT CGCAGAACTC GCAACAGTCC TTCGACAGCA GCAGTCCCCCCACGCCGCAG TGCCATAAGC GGCACCGGCA CTGCCCGGTT GTCGTGTCCGAGGCCACCAT CGTGGGCGTC CGCAAGACCG GGCAGATCTG GCCCAACGATGGCGAGGGCG CCTTCCATGG AGACGCAGAA GCCCTTCAGC GGCCAGTAGCATCTGACTTT GAGCCTCAGG GTCTGAGTGA AGCCGCTCGT TGGAACTCCAAGGAAAACCT TCTCGCTGGA CCCAGTGAAA ATGACCCCAA CCTTTTCGTTGCACTGTATG ATTTTGTGGC CAGTGGAGAT AACACTCTAA GCATAACTAAAGGTGAAAAG CTCCGGGTCT TAGGCTATAA TCACAATGGG GAATGGTGTGAAGCCCAAAC CAAAAA
6.根據(jù)權(quán)利1所述的試劑盒，其特征是對照品分陰性對照和陽性對照，其中陰性對照為無P190bcr/ab1的正常cDNA樣品，陽性對照為有P190bcr/ab1的ALL患者的cDNA樣品。
7.根據(jù)權(quán)利1所述的試劑盒，其特征是利用該試劑盒所設(shè)計(jì)的引物及探針進(jìn)行的PCR進(jìn)行P190bcr/abl的定性和定量檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人P190
文檔編號C12Q1/25GK1814791SQ20051003773
公開日2006年8月9日 申請日期2005年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月2日
發(fā)明者錢軍, 林江, 朱夫, 張希云 申請人:鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院, 錢軍, 林江