專利名稱：口蹄疫病毒熒光定量rt-pcr檢測試劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以口蹄疫病毒基因片段為靶目標(biāo)，應(yīng)用primer Express軟件和primer prere5.0軟件設(shè)計合成的生物制劑，尤其是能夠?qū)谔阋卟《具M行檢測的試劑以及這種試劑的制備方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的野生、家畜偶蹄動物的一種高度傳染性的疾病?？焖俸涂煽康脑\斷對于FMD的控制至關(guān)重要，為采取有效措施，實驗室診斷必須在24小時以內(nèi)作出快速、準(zhǔn)確的結(jié)論。動物和肉類產(chǎn)品帶病毒引發(fā)口蹄疫是多次大流行的主要原因。對肉食品中低含量的FMD病毒、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進行準(zhǔn)確檢測的方法必須具備高敏感性、高特異性和高準(zhǔn)確性。常規(guī)的診斷方法如病毒分離、血清學(xué)試驗、動物試驗等，或費時費力，或特異性和敏感性不高，不能滿足快速、準(zhǔn)確診斷的要求。RT-PCR、競爭PCR和ELISA-PCR方法克服了這些方法的不足，可用于FMD的診斷，但也有費時、易污染、擴增后需電泳檢測和每次檢測的樣品數(shù)量少等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用FMDV 3D區(qū)域的基因序列設(shè)計合成的口蹄疫病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑。
本發(fā)明的另一目的是提供這種檢測試劑的制備方法。
本發(fā)明選擇FMDV基因的3D區(qū)為靶目標(biāo)，通過對GenBank中報道的FMDV DNA序列(AF536534、AF536535、AF536536、AF536540、AF536537、AF536538、AF536539)進行同源性分析比較，選定FMDV 3D區(qū)內(nèi)較保守的片段(189bp)，應(yīng)用primerExpress軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計引物和探針，引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成，探針合成同時進行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMAR。將設(shè)計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，確定擴增效率和特異性最好的二套引物和探針。通過FMDV病毒RNA和標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品的制備，采用矩陣法進行引物和探針最佳濃度的精確篩選，以獲得最低的CT值和較高的熒光強度增加值(ΔRn)。通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后用FMDV細(xì)胞培養(yǎng)物、乳鼠組織、VSV、BTV17、BVDV、正常BHK21細(xì)胞、豬牛的上皮組織等試驗樣品進行檢測，對FMDV熒光定量RT-PCR的特異性、敏感性和重復(fù)性試驗，以及各參加反應(yīng)組份最佳條件的篩選，最終建立FMDV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑和檢測程序。
由上述確定擴增效率和特異性最好的二套引物和探針分述如下本發(fā)明所述的口蹄疫病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標(biāo)片段長度為86bp，引物和探針序列為引物FVP2-F5’-TTA CAA ACC TGT GAT GGC CTC-3’FVP2-R5’-CGG AGA TCA ACT TCT CCT GTA TG-3’探針(FAM)5’-CCT CTC CTT TGC ACG CCG TGG-3’(TAMRA)。
本發(fā)明所述的口蹄疫病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標(biāo)片段長度為135bp，引物和探針序列為引物FVP3-F5’-CGT GGG ACC ATA CAG GAG AA-3’FVP3-R5’-CGC AGG TAA AGT GAT CTG TAG CTT-3’探針(FAM)5’-TGA TCT CCG TGG CAG GAC TCG C-3’(TAMRA)。
本發(fā)明所述的口蹄疫病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑的制備方法由以下步驟組成一、選擇FMDV基因的3D區(qū)為靶目標(biāo)，其基因片段的擴增目標(biāo)核苷酸序為列TTACAAACCTGTGATGGCCTCAAAGACCCTTGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCAGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAAGGTCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCG；
二、應(yīng)用primer Express軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計引物和探針；三、引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成；四、探針合成同時進行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMAR；五、將設(shè)計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，確定并得到擴增效率和特異性好的引物和探針。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果為1、本申請人首次用FMDV 3D區(qū)域的基因序列的最保守片段，設(shè)計合成了引物和探針，建立了熒光定量RT-PCR并制備成檢測試劑盒，可對細(xì)胞培養(yǎng)物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品中的FMDV進行快速檢測，首次創(chuàng)立FMDV熒光定量RT-PCR。
2、本試劑與常規(guī)的RT-PCR相比較，該方法具有快速、特異、敏感、可定量，可同時檢測大量樣品等優(yōu)點。FMDV熒光定量RT-PCR可對肉食品中低含量的FMD病毒、隱性感染或持續(xù)帶毒宿主進行準(zhǔn)確檢測，是一種FMDV檢測的良好方法。
3、本試劑可對細(xì)胞培養(yǎng)物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品等多種樣品中的FMDV進行快速檢測，樣品適用范圍廣，沒有生物安全隱患，使用安全的優(yōu)點。
4、本熒光定量RT-PCR試劑除了具有特異性高、敏感性強外，可同時進行大量樣品檢測，具有高通量性，可減少RNA、cDNA或PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險。比常規(guī)PCR快速，無需擴增后的電泳分析?？朔顺Ｒ?guī)RT-PCR和免疫捕獲RT-PCR產(chǎn)生的產(chǎn)物須電泳檢測、費時、不敏感和不能定量的缺點。
5、與常規(guī)PCR相比，熒光PCR作出一個定量的、客觀的估計，判定出陽性、陰性和可疑。CT值為40.00可確定為陽性和陰性的臨界值(cut-off)。更重要的是，熒光PCR具有很高的外、內(nèi)試驗重復(fù)性。熒光RT-PCR特別適用于保存時間長而無法進行分離病毒的大批量樣品的檢測。
6、本試劑可在收到樣品后4小時之內(nèi)作出定性、定量檢測結(jié)果。與FMDVELISA檢測結(jié)果的陽性檢出率低、細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒需要4天時間相比。該熒光RT-PCR試劑是一種檢測臨床樣品中FMDV的敏感和可靠的方法。
具體實施例方式
1、設(shè)計引物和探針本發(fā)明選擇FMDV基因的3D區(qū)為靶目標(biāo)，通過對GenBank中報道的FMDV DNA序列(AF536534、AF536535、AF536536、AF536540、AF536537、AF536538、AF536539)進行同源性分析比較，選定FMDV 3D區(qū)內(nèi)較保守的片段(189bp)，應(yīng)用primerExpress軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計引物和探針，引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成探針合成同時進行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMAR。將設(shè)計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，確定擴增效率和特異性最好的二套引物和探針。第一套引物和探針(FMDVP2-F/FMDVP2-R)擴增目標(biāo)片段長度為86bp，第二套引物和探針(FMDVP3-F/FMDVP3-R)擴增目標(biāo)片段長度為135bp。
2、RNA提取FMDV病毒RNA和標(biāo)準(zhǔn)品同時制備。參照黃禎祥主編《醫(yī)學(xué)病毒學(xué)基礎(chǔ)及實驗技術(shù)》，科學(xué)出版社(1990年)第143-146頁，先測定毒價，以Reed和Muench氏法計算TCID50。取100μL病毒原液，參照盧圣棟主編《分子生物學(xué)實驗室常用技術(shù)》，科學(xué)出版社(1999年)第61-62頁，酚/氯仿核酸抽提法提取RNA。用無RNA酶的超純水溶解總RNA，稀釋成相當(dāng)于10000、1000、100、10、1、0.1TCID50的每個反應(yīng)管。水泡皮、水泡液、血液(抗凝血)、血清和細(xì)胞組織等材料直接提取RNA。熒光RT-PCR和常規(guī)RT-PCR試驗用同批次提取的RNA。
3、FMDV熒光定量RT-PCRFMDV熒光定量RT-PCR采用25μL體積反應(yīng)液，在7000型熒光定量PCR儀中，按下列反應(yīng)參數(shù)進行42℃30min反轉(zhuǎn)錄；92℃變性3min；92℃變性10min，45℃30sec，72℃1min，預(yù)擴增5個循環(huán)；然后以92℃10sec，60℃30sec擴增40個循環(huán)。
引物和探針的濃度進行精確篩選，以獲得最低的CT值和較高的熒光強度增加值(ΔRn)。每次檢測時，設(shè)立用水代替病毒RNA樣品的4個陰性對照(或正常組織、細(xì)胞陰性對照)；設(shè)立相當(dāng)于1000、100、10、1TCID50/每反應(yīng)管的FMDV標(biāo)準(zhǔn)各4個對照；每個樣品檢測做3管平行試驗。在4個陰性對照為陰性、陽性對照為陽性時，整個試驗有效，可進一步判定結(jié)果。每個樣品須作多個備份，以進行穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗。
4、常規(guī)RT-PCR常規(guī)RT-PCR的上游引物用FVP2-F5’-TTA CAA ACC TGT GAT GGCCTC-3’，下游引物用FVP3-R5’-CGC AGG TAA AGT GAT CTG TAG CTT-3’，擴增目標(biāo)片段長度為189bp，按常規(guī)方法進行擴增。檢測用2％瓊脂糖電泳分析，陽性擴增結(jié)果出現(xiàn)一條189bp特異性條帶。
5、FMDV熒光定量RT-PCR的特異性、敏感性用VSV、BVD、BTV、EHD、AKAV以及正常BHK21細(xì)胞、野外采集豬、牛的組織樣品和血清進行特異性比較檢測。對FMDV細(xì)胞培養(yǎng)物、人工感染乳鼠組織樣品進行10倍系列稀釋，用常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測，比較它們的敏感性。
6、熒光定量RT-PCR穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗在評估FMDV熒光定量RT-PCR檢測FMDV方法中的組內(nèi)和組間試驗的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性時，用相當(dāng)于1000TCID50的樣品RNA，在同樣反應(yīng)條件下，反復(fù)進行熒光定量RT-PCR檢測，每次試驗的每個樣品做6個平行的反應(yīng)管，重復(fù)12次。
7、標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品的制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及核酸拷貝數(shù)的計算所用的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品為含有目的擴增片段的質(zhì)粒pBAD-3D，由本實驗室用pBAD/Thio TOPO載體構(gòu)建。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，LB培養(yǎng)基(含Amp100μg/mL)增殖，堿裂解法提取，經(jīng)試劑盒純化，質(zhì)粒濃度用分光光度計測OD260定量。模板濃度的計算在作絕對定量時，首先制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。對標(biāo)準(zhǔn)品進行10-1、10-2、10-3、10-4～10-7稀釋，通過測OD知道質(zhì)粒原液(標(biāo)準(zhǔn)品)的濃度后，可計算出每個PCR管中模板的數(shù)量。例如，已知pBAD/Thio TOPO載體長4436bp，插入的FMDV 3D目的片斷長189bp，每個堿基的平均分子量是330，(每對堿基/bp是660，)質(zhì)粒原液約250μg/mL，阿弗加德羅常數(shù)(每mol的微粒數(shù))是6.02×1023/mol。那么每2μL的絕對模板數(shù)量是(250μg/mL×2μL×6.02×1023/mol)/[(4436+189)bp×660g/(mol×bp)]＝98.6×1018。據(jù)此，10-4～10-7質(zhì)粒的模板分子數(shù)是98.6×1014～1011。做熒光定量RT-PCR檢測，以拷貝數(shù)或TCID50的對數(shù)為X軸，CT值為Y軸作回歸曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
8、引物和探針及其濃度的篩選選擇引物、探針、模板的最佳濃度配比，獲得熒光定量RT-PCR反應(yīng)的最低CT值和最高ΔRn，提高擴增效率和敏感性。應(yīng)用含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和FMDV細(xì)胞毒，經(jīng)系列稀釋，制備DNA和RNA不同含量的檢測樣品。對設(shè)計的二對引物和各自的探針，選用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探針終濃度，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度。
9、對FMDV樣品的檢測用熒光定量RT-PCR對FMDV細(xì)胞培養(yǎng)物、乳鼠組織、VSV、BTV17、BVDV、正常BHK21細(xì)胞、豬牛的上皮組織等試驗樣品進行檢測。提取的RNA稀釋后檢測，陽性樣品的CT值均小于或等于38.50，陰性對照樣品的CT值均大于40，試驗特異性強。CT值40.00可作為是陽性和陰性的臨界值。CT值大于40可判為陰性，CT值小于或等于38.50可判為陽性，在38.50-40之間為可疑，須重新試驗。用第一套引物和探針進行檢測FMDV的熒光定量RT-PCR特異性高，強陽性樣品的CT值小于28.00，試驗的敏感性高，穩(wěn)定性、可靠性、重復(fù)性很好。
10、FMDV熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化試劑和檢測程序10.1試劑盒組成

10.2操作方法10.2.1樣本處理(樣本處理區(qū))取n個1.5ml滅菌離心管(n＝樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，作好標(biāo)記。
首先加入600ul裂解液(裂解液有很強的腐蝕性，切勿沾到皮膚或衣物，否則立即用大量清水沖洗并擦干)，然后分別加入待測樣本、陰性對照、陽性對照各200ul(一份樣本換用一個吸頭)；再加入200ul氯仿，混勻器上振蕩混勻5sec(不宜過于強烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可用手顛倒混勻)。
于12,000g離心15min(如有條件，于4℃進行離心)。
取與步驟1.1.中相同數(shù)量的1.5ml滅菌離心管，加入400ul異丙醇(-20℃預(yù)冷)，作好標(biāo)記。吸取步驟1.3.各管中的上清液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中(上清液應(yīng)至少吸取500ul，注意不要吸出中間層，該層富含DNA和蛋白質(zhì))，顛倒混勻。
本公式是為編制“表A”用的。
在本發(fā)明中，我們把后車叫做A車，前車叫做B車。“表A”中的S′A、B值和實測的SA、B值均指A車測距儀至B車后棱鏡的距離，而非指A車頭至B車尾的距離?！氨鞟”中的S′A、B值和實測的SA、B值都比與其對應(yīng)的后者長3～5m。
10.“LA+LB”、Ta、b、“超車開始”時的“va-vb”和“VA-VB”諸值顯示器(“表D”為其顯示形式)。它設(shè)在顯示屏上的右中部。
“表D”

本顯示器中儲存有各檔“LA+LB”所屬范圍值及與之相對應(yīng)的Ta、b值、“超車開始”時的“va-vb”值和“VA-VB”值，并能成組地顯示在其中。它由“LA+LB”旋鈕控制。
“表D”中LA+LB——A、B二車車長之和(指范圍值，共設(shè)七檔)，m，Ta、b——A車“超車時間”，秒(僅限2、3、4整數(shù)秒)，va-vb——“超車開始”時的A、B二車每秒前進距離之差，超車前，它等于SA、B值在1秒內(nèi)的減少量ΔSA、B1，ΔSA、B1＝va-vb，ΔSA、B1值也等于石英閃秒器閃第1秒和閃第2秒時測距值顯示窗中顯示的兩個SA、B值之差，VA-VB——“超車開始”時，A、B二車的速度差，Km/h，Ta,b=LA+LBva-vb.]]>由Ta、b關(guān)系式計算出的Ta、b值按五舍六入法取其為整數(shù)秒，并以不同的Ta、b值(僅限2、3、4秒)及與之相對應(yīng)的“LA+LB”范圍值(共設(shè)七檔8～12.5m，12.6～17m，17～19m，19～21m，21～24m，24～26m，26～29m)、“超車開始”時的“va-vb”值和“VA-VB”值編制出“表D”。
“超車開始”時實際的“VA-VB”值達(dá)到顯示屏上“表D”中“VA-VB”欄的顯示值是A車實施超車必須具備的兩個決定性條件之一。此“條件”確保了“超車時間”不會超出限定范圍。
對于超車，我們特做如下界定超車時，我們把A車車頭到達(dá)B車尾沿時界定為“超車開始”，把A車車尾到達(dá)B車前沿時界定為“超越B車”，而把A車從“超越B車”位置開回到原車道上B車前方時界定為“超車結(jié)束”；A車從“超車開始”處開到“超越B車”<p>●循環(huán)條件設(shè)置

10.2.5結(jié)果分析條件設(shè)定讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)。
10.2.6質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)●陰性對照的檢測結(jié)果為陰性。
●陽性對照的Ct值應(yīng)小于等于28.0。
10.2.7結(jié)果判斷●Ct值無數(shù)值的樣本為陰性樣本。
●Ct值≤38.5的樣本為陽性。
●Ct值大于38.5的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性。
10.2.8定量檢測在作絕對定量檢測時，首先制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。對試劑盒中提供的定量用標(biāo)準(zhǔn)對照品(重組質(zhì)粒)，按說明書要求進行序列稀釋，與被檢樣品同時進行熒光定量RT-PCR檢測。以標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸，CT值為Y軸作回歸曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可對被樣品進行定量。
權(quán)利要求
1.一種口蹄疫病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑，其特征在于包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標(biāo)片段長度為86bp，引物和探針序列為引物FVP2-F5’-TTA CAA ACC TGT GAT GGC CTC-3’FVP2-R5’-CGG AGA TCA ACT TCT CCT GTA TG-3’探針(FAM)5’-CCT CTC CTT TGC ACG CCG TGG-3’(TAMRA)。
2.一種口蹄疫病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑，其特征在于包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標(biāo)片段長度為135bp，引物和探針序列為引物FVP3-F5’-CGT GGG ACC ATA CAG GAG AA-3’FVP3-R5’-CGC AGG TAA AGT GAT CTG TAG CTT-3’探針(FAM)5’-TGA TCT CCG TGG CAG GAC TCG C-3’(TAMRA)。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的口蹄疫病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑的制備方法，其特征在于由以下步驟組成(一)、選擇FMDV基因的3D區(qū)為靶目標(biāo)，其基因片段的擴增目標(biāo)核苷酸序列為TTACAAACCTGTGATGGCCTCAAAGACCCTTGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCAGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAAGGTCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCG；(二)、應(yīng)用primer Express軟件和primer prere5.0軟件，設(shè)計引物和探針；(三)、引物和探針的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動DNA合成儀進行OligoDNA的合成；(四)、探針合成同時進行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報告基團是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團為TAMAR；(五)、將設(shè)計合成的多對引物和探針進行最佳配對篩選實驗后，確定并得到擴增效率和特異性好的引物和探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以口蹄疫病毒基因片段為靶目標(biāo)，應(yīng)用primer Express軟件和primer prere5.0軟件設(shè)計合成的生物制劑，尤其是能夠?qū)谔阋卟《具M行檢測的試劑以及這種試劑的制備方法。本發(fā)明所述的口蹄疫病毒熒光定量RT－PCR檢測試劑包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針。本首次用FMDV 3D區(qū)域的基因序列的最保守片段，設(shè)計合成了引物和探針，建立了熒光定量RT－PCR并制備成檢測試劑盒，可對細(xì)胞培養(yǎng)物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液、肉品中的FMDV進行快速檢測，首次創(chuàng)立FMDV熒光定量RT－PCR。
文檔編號C12Q1/68GK1560279SQ20041002854
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者花群義, 徐自忠, 董俊, 楊晶焰, 周曉黎, 楊云慶 申請人:云南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 云南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中