專利名稱：四倍體刺槐轉(zhuǎn)基因及組培快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及四倍體刺槐的繁育方法，尤其涉及對(duì)四倍體刺槐進(jìn)行組培快繁和基因轉(zhuǎn)化的方法，屬于植物基因工程領(lǐng)域或農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于抗鹽耐旱植物材料的缺乏，特別是喬木樹種的缺乏，嚴(yán)重制約了北方鹽堿干旱地區(qū)生態(tài)工程建設(shè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展。四倍體刺槐是韓國(guó)通過(guò)染色體加倍育成的刺槐新品種，除保持普通刺槐的優(yōu)良特點(diǎn)外(抗逆性強(qiáng)，適宜多種氣候及土壤條件，木材堅(jiān)硬，用途廣，花為優(yōu)良的蜜源植物，根有根瘤菌，能改善土壤)，還具有葉片大、蛋白質(zhì)含量高、樹體矮化等優(yōu)良特性，如能提高其抗鹽耐旱性，對(duì)于鹽堿干旱地區(qū)生態(tài)和經(jīng)濟(jì)建設(shè)具有重要意義。
自1981年從菠菜分離和部分純化獲得甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)后，BADH基因工程日益受到重視。Manabu等將來(lái)源于大麥的BADH基因轉(zhuǎn)入煙草，在滲透脅迫下，BADH量增加，酶活性也成倍增加。劉風(fēng)華等利用農(nóng)桿菌方法轉(zhuǎn)入到草莓和煙草中、郭北海等和李銀心等將BADH基因分別轉(zhuǎn)入小麥、豆瓣菜上，得到的轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性也有一定提高。但至今尚未見(jiàn)到BADH基因在木本植物上的轉(zhuǎn)化報(bào)道。關(guān)于刺槐的轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，Davis等將種子苗的下胚軸接種根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)，對(duì)植株DNA進(jìn)行Southern分析表明刺槐是農(nóng)桿菌的宿主植物；在受傷子葉上接種攜帶雙元載體pGA472的根癌農(nóng)桿菌A281，結(jié)果子葉產(chǎn)生抗卡那霉素的愈傷組織，并檢測(cè)證明NPT II基因順序整合到刺槐基因組上；Han將下胚軸接種到含發(fā)根農(nóng)桿菌R1601的培養(yǎng)基上，檢測(cè)表明T-DNA整合到了基因組中，并且導(dǎo)入基因得到了表達(dá)(皺葉和大量根的產(chǎn)生)。但是，到目前為止，尚未有具有生產(chǎn)意義的目的基因?qū)氪袒薄６谋扼w刺槐是僅限于帶腋芽的莖段進(jìn)行組培擴(kuò)繁的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種進(jìn)行四倍體刺槐農(nóng)桿菌法介導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)化，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株的組培快繁的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用如下步驟(1)將四倍體刺槐當(dāng)年生新梢的莖段，消毒后接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基中，15～3天后轉(zhuǎn)接到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，得到的愈傷組織，經(jīng)如下含有雙元載體pBin438的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404菌系轉(zhuǎn)基因處理后，再接種到分化培養(yǎng)基中形成叢生芽；上述MS培養(yǎng)基的組成為KNO31900mg·L-1，NH4NO31650mg·L-1，MgSO4370mg·L-1，KH2PO4170mg·L-1，CaCl2·2H20 440mg·L-1，MnSO4·4H2O 22.3mg·L-1，ZnSO4·7H2O 8.6mg·L-1，H3BO36.2mg·L-1，KI 0.83mg·L-1，NaMoO4·2H2O0.25mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.025mg·L-1，CoCl2·6H2O 0.025mg·L-1，Na2-EDTA 37.3mg·L-1，F(xiàn)eSO4·7H20 27.8mg·L-1，甘氨酸2.0mg·L-1，鹽酸噻胺0.1mg·L-1，鹽酸比哆醇0.5mg·L-1，煙酸0.5mg·L-1，肌醇100mg；上述啟動(dòng)培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、6-BA 0.2～1.5mg·L-1、NAA 0.08～2mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、瓊脂6～8g·L-1，加瓊脂之前調(diào)節(jié)pH值為pH值5.8；上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、KT 1.0～5mg·L-1、NAA 0.5～2mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、瓊脂6～8g·L-1，加瓊脂之前調(diào)節(jié)pH值為pH值5.8；上述分化培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、IBA 0.2～1.5mg·L-1、6-BA 2.0～4mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、瓊脂6～8g·L-1，加瓊脂之前調(diào)節(jié)pH值為5.8；上述培養(yǎng)條件為晝溫度25℃，夜溫度18℃，光照強(qiáng)度40umol.m-2.s-1，光照時(shí)間14h·d-1；(2)挑選上述根癌農(nóng)桿菌單菌落接種于含有卡那霉素(kanamycin，Kan)的YEB液體培養(yǎng)基中，25-34℃，160-220rin/m條件下，培養(yǎng)18～26小時(shí)，轉(zhuǎn)接于無(wú)抗菌素的YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液在離心后，再加入適量無(wú)菌MS液體培養(yǎng)基稀釋至OD6000.3～0.7；上述YEB培養(yǎng)基的組成為每升含細(xì)菌蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉浸膏5g，MgSO4.7H2O 0.493g，pH7.0；(3)將上述愈傷組織切成小塊或薄片，預(yù)培養(yǎng)1～5天后，侵染農(nóng)桿菌菌液4～20分鐘；向共培養(yǎng)培養(yǎng)基(即分化培養(yǎng)基)中加入15～40mg·L-1的乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)，培養(yǎng)3～8天后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基；10～50天后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)80～120天，繼代3～4次得Kan抗性植株；上述從轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基開始，加入濃度為400～600mg·L-1的頭孢霉素(cefotaxime，Cef)抑制農(nóng)桿菌；上述選擇培養(yǎng)基的組成為分化培養(yǎng)基、卡那霉素(kanamycin，Kan)50～100mg·L-1；(4)將上述獲得的Kan抗性植株，經(jīng)分子檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)化植株，如轉(zhuǎn)化植株的叢生芽小苗健壯，可直接生根，如小苗細(xì)弱，可轉(zhuǎn)入拔高培養(yǎng)基，經(jīng)壯苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基；上述拔高培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、KT 1.0～4.0mg·L-1、6-BA 0.1～2.0mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、瓊脂6～8 g·L-1，pH值5.8～6.0；上述生根培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、IBA 1.0～3.0mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、瓊脂6～8 g·L-1，pH值5.8～6.0；(5)幼苗在生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)30天以后，90％以上都會(huì)發(fā)育成健壯的生根幼苗，經(jīng)過(guò)馴化煉苗后，栽入大田。
其中，上述步驟(1)所述的含有雙元載體pBin438的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404菌系，其載體含有CaMV35s啟動(dòng)子、山波菜的甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)以及一個(gè)嵌合的NosNpt-II基因和35sGUS基因。
上述涉及的培養(yǎng)基的配方是啟動(dòng)培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、6-BA 1.0mg·L-1、NAA 1.0mg·L-1、蔗糖30g·L-1、瓊脂7.0g·L-1，加瓊脂之前調(diào)節(jié)pH值為pH值5.8；誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、KT 2.5mg·L-1、NAA 1.5mg·L-1、蔗糖30g·L-1、瓊脂7.0g·L-1，加瓊脂之前調(diào)節(jié)pH值為pH值5.8；分化培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、IBA 1.0mg·L-1、6-BA 3.5mg·L-1、蔗糖30g·L-1、瓊脂7.0g·L-1，加瓊脂之前調(diào)節(jié)pH值為pH值5.8；上述選擇培養(yǎng)基的組成為分化培養(yǎng)基、卡那霉素(kanamycin，Kan)60mg·L-1；拔高培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、KT 3.5mg·L-1、6-BA 1.5mg·L-1、蔗糖30g·L-1、瓊脂7.0g·L-1，加瓊脂之前調(diào)節(jié)pH值為pH值5.8；生根培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、IBA 2.0mg·L-1、蔗糖30g·L-1、瓊脂7.0g·L-1，加瓊脂之前調(diào)節(jié)pH值為pH值5.8。
上述步驟(2)中，菌液在離心后，再加入適量無(wú)菌MS液體培養(yǎng)基稀釋至OD6000.5。
上述步驟(3)中涉及的愈傷組織經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后，侵染農(nóng)桿菌菌液10分鐘。
上述步驟(3)中乙酰丁香酮的加入量為30mg·L-1。
上述步驟(3)中頭孢霉素的加入濃度為500mg·L-1。
上述步驟(5)中，移栽組培苗時(shí)，開始時(shí)在溫室內(nèi)打開瓶口，逐漸降低濕度，并增強(qiáng)光照，4～5天后洗凈培養(yǎng)基，移入營(yíng)養(yǎng)缽中，利用間歇噴霧裝置保持環(huán)境濕度，經(jīng)過(guò)馴化煉苗15-20天后，栽入大田，適當(dāng)遮蔭，成活率可達(dá)95％以上。
采用本發(fā)明所述的方法可在8～12月之內(nèi)獲得轉(zhuǎn)BADH基因的植株，建立了一個(gè)可重復(fù)的、轉(zhuǎn)化效率高的林木基因轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，獲得了抗鹽性提高的轉(zhuǎn)化植株，并建立了配套的組培快繁育苗技術(shù)體系。


圖1為消毒后的當(dāng)年生新梢的萌發(fā)。
圖2為侵染后處于共培養(yǎng)中的愈傷組織。
圖3為轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)(P-以質(zhì)粒為模板的陽(yáng)性對(duì)照(1.6kp)；1～4-Kan抗性植株；M-DNA marker；CK-以未轉(zhuǎn)化植株為陰性對(duì)照)。
圖4為轉(zhuǎn)基因植株的PCR-Southern檢測(cè)(P-以質(zhì)粒為模板的陽(yáng)性對(duì)照(1.6kb)，CK-以未轉(zhuǎn)化植株為陰性對(duì)照，0-不加任何模板DNA的空白對(duì)照，1～5-轉(zhuǎn)化株系)。
圖5為5‰NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因(左)和對(duì)照(右)叢生芽的分化。
圖6為5‰NaCl脅迫下轉(zhuǎn)基因(左)和對(duì)照(右)小苗生長(zhǎng)情況。
圖7為Kan抗性小苗的分化快繁情況。
圖8為進(jìn)行生根培育的分化苗。
圖9為移栽成活的轉(zhuǎn)基因小苗。
圖10為剛移入大田的轉(zhuǎn)基因植株。
圖11為大田移栽成功的轉(zhuǎn)基因小苗。
圖12為Kan篩選120天后存活的抗性單芽苗。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1植物材料為韓國(guó)引進(jìn)的飼用型四倍體刺槐優(yōu)良品種。外植體采自田間優(yōu)株當(dāng)年生新梢的帶腋芽莖段，用自來(lái)水沖洗，70％酒精消毒，無(wú)菌水沖洗3-5次，再用升汞溶液消毒，無(wú)菌水沖洗5次，接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基中，12天后莖段腋芽開始萌發(fā)，20天發(fā)出嫩梢，作為愈傷組織的誘導(dǎo)材料。
其中，啟動(dòng)培養(yǎng)基組成為MS+6-BA 0.3mg·L-1+NAA 1.5mg·L-1；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS+KT 1.5mg·L-1+NAA 1.5mg·L-1；分化培養(yǎng)基是MS+IBA 1.0mg·L-1+6-BA 3.5mg·L-1。MS培養(yǎng)基組成為KNO31900mg·L-1，NH4NO31650mg·L-1，MgSO4370mg·L-1，KH2PO4170mg·L-1，CaCl2·2H2O 440mg·L-1，MnSO4·4H2O 22.3mg·L-1，ZnSO4·7H2O 8.6mg·L-1，H3BO36.2mg·L-1，KI0.83mg·L-1，NaMoO4·2H2O 0.25mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.025mg·L-1，CoCl2·6H2O0.025mg·L-1，Na2-EDTA 37.3mg·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mg·L-1，甘氨酸2.0mg·L-1，鹽酸噻胺0.1mg·L-1，鹽酸比哆醇0.5mg·L-1，煙酸0.5mg·L-1，肌醇100mg；各培養(yǎng)基蔗糖濃度是30g·L-1，瓊脂6.0g·L-1，pH值5.8。
挑選攜帶BADH基因的農(nóng)桿菌單菌落接種于含有Kan的YEB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)22小時(shí)(25℃，160rin/m)，轉(zhuǎn)接于無(wú)抗菌素的YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液在離心后，再加入適量無(wú)菌MS液體培養(yǎng)基稀釋至OD6000.4。將愈傷組織切成小塊，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間1天后侵染農(nóng)桿菌菌液4分鐘；共培培養(yǎng)基中加入30mg·L-1的AS，培養(yǎng)6天后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基；30天后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基〔分化培養(yǎng)基+Kan 50mg·L-1〕，繼代3-4次，選擇80天；從轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基開始，加入濃度為600mg·L-1的Cef抑制農(nóng)桿菌。
對(duì)上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR和PCR-Southern檢測(cè)，植物基因組DNA的提取采用SDS法，PCR擴(kuò)增所用引物15′-AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC-3′，25′-TTCAAGGAGACTTGATCCATCCCCA-3′；25μl PCR反應(yīng)體系模板DNA 2μl，2種引物各0.4μmol，dNTP各0.1mmol，0.5U Taq酶95℃預(yù)變性10分鐘，然后依次在93.5℃變性1分鐘、58℃復(fù)性1分鐘、72℃延伸1.5分鐘，循環(huán)30次，最后在72℃延伸10分鐘。取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl在1.0％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，GeneGenius全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。在凝膠電泳上，轉(zhuǎn)化植株小苗擴(kuò)增出了特異條帶，與陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出的特異條帶一致，陰性對(duì)照(未轉(zhuǎn)化植株)沒(méi)有擴(kuò)增出任何條帶，Kan抗性小苗的PCR陽(yáng)性檢測(cè)率為25％左右，表明外源基因已經(jīng)整合到植株的基因組DNA中。
將分子檢測(cè)得到的轉(zhuǎn)基因植株的愈傷組織塊(見(jiàn)圖5)和分化20天的小苗(高2cm左右)(見(jiàn)圖6)分別接種到含有不同NaCl濃度(2‰、3‰、4‰、5‰、6‰、7‰、8‰)的分化培養(yǎng)基上，每處理重復(fù)5次(瓶)，每重復(fù)(瓶)3個(gè)愈傷組織(或抗性小苗)，經(jīng)20天時(shí)間的培養(yǎng)后，觀察到轉(zhuǎn)化植株的NaCl抗性比未轉(zhuǎn)化植株提高2～3‰。
將獲得轉(zhuǎn)化植株分化增殖后(見(jiàn)圖7)，轉(zhuǎn)入拔高培養(yǎng)基MS+KT 3.5mg·L-1+6-BA1.5mg·L-1，經(jīng)壯苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。幼苗在生根培養(yǎng)基MS+IBA 1.0mg·L-1中生長(zhǎng)30天以后，90％以上都會(huì)發(fā)育成健壯的生根幼苗(見(jiàn)圖8)。在移栽組培苗時(shí)，開始時(shí)在溫室內(nèi)打開瓶口，逐漸降低濕度，并增強(qiáng)光照，4～5天后洗凈培養(yǎng)基，移入營(yíng)養(yǎng)缽中，注意保持環(huán)境濕度(最好利用間歇噴霧裝置)，經(jīng)過(guò)馴化煉苗15-20天后(見(jiàn)圖9)，栽入大田，適當(dāng)遮蔭(見(jiàn)圖10)，成活率達(dá)95％以上(見(jiàn)圖11)。
實(shí)施例2四倍體刺槐外植體(新梢莖段)，消毒后接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1中，12天后莖段腋芽開始萌發(fā)，15天發(fā)出嫩梢，再將嫩梢接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+KT 1.5mg·L-1+NAA 2.0mg·L-1中，獲得的愈傷組織再轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基MS+IBA 1.5mg·L-1+6-BA 2.5mg·L-1中。各培養(yǎng)基蔗糖濃度是25g·L-1，瓊脂7.0g·L-1，pH值5.8。
挑選攜帶BADH基因的農(nóng)桿菌單菌落接種于含有Kan的YEB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜(25℃，180rin/m)，轉(zhuǎn)接于無(wú)抗菌素的YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液在離心后，再加入適量無(wú)菌MS液體培養(yǎng)基稀釋至OD6000.5。將愈傷組織切成薄片，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間3天后侵染農(nóng)桿菌菌液10分鐘；共培培養(yǎng)基中加入15mg·L-1的AS，培養(yǎng)5天后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基；30天后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基〔分化培養(yǎng)基+Kan 60mg·L-1〕，繼代3-4次，選擇120天(見(jiàn)圖12)；從轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基開始，加入濃度為400mg·L-1的Cef抑制農(nóng)桿菌。
獲得的Kan抗性植株經(jīng)分子檢測(cè)證實(shí)獲得了轉(zhuǎn)化植株，將轉(zhuǎn)化株系轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS+IBA 2.0mg·L-1中生長(zhǎng)33天以后，發(fā)育成健壯的生根幼苗。在煉苗移栽后栽入大田，獲得了轉(zhuǎn)化苗木。
實(shí)施例3四倍體刺槐外植體(新梢莖段)，消毒后接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基MS+6-BA 1.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1中，15天后莖段腋芽開始萌發(fā)，18天發(fā)出嫩梢，將嫩梢接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+KT 2.5mg·L-1+NAA 1.5mg·L-1中獲得愈傷組織，再轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基MS+IBA 0.5mg·L-1+6-BA 3.5mg·L-1中，。各培養(yǎng)基蔗糖濃度是35g·L-1，瓊脂8.0g·L-1，pH值5.8。
挑選攜帶BADH基因的農(nóng)桿菌單菌落接種于含有Kan的YEB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜(30℃，190rin/m)，轉(zhuǎn)接于無(wú)抗菌素的YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液在離心后，再加入適量無(wú)菌MS液體培養(yǎng)基稀釋至OD6000.6。將愈傷組織切成薄片，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間5天后侵染農(nóng)桿菌菌液12分鐘；共培培養(yǎng)基中加入35mg·L-1的AS，培養(yǎng)4天后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基；30天后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基〔分化培養(yǎng)基+Kan 70mg·L-1〕，繼代3-4次，選擇120天；從轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基開始，加入濃度為500mg·L-1的Cef抑制農(nóng)桿菌。
獲得的Kan抗性植株經(jīng)分子檢測(cè)證實(shí)獲得了轉(zhuǎn)化植株，將轉(zhuǎn)化株系轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS+IBA 3.0mg·L-1中生長(zhǎng)30天以后，發(fā)育成健壯的生根幼苗。在煉苗移栽后栽入大田，獲得了轉(zhuǎn)化苗木。
通過(guò)上述3個(gè)實(shí)例，經(jīng)PCR和PCR-Southern檢測(cè)，本項(xiàng)基因轉(zhuǎn)化方法已獲得70個(gè)轉(zhuǎn)BADH基因的株系。
NaCl抗性試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因植株叢生芽的分化在6‰～7‰NaCl脅迫下未受到影響，在8‰時(shí)還可基本正常分化，而未轉(zhuǎn)化植株在5‰分化即受到明顯影響，在8‰時(shí)基本停止分化，轉(zhuǎn)化植株的分化對(duì)NaCl的相對(duì)抗性提高3‰～4‰。未轉(zhuǎn)化植株的生長(zhǎng)在3‰NaCl脅迫下即出現(xiàn)受害癥狀，表現(xiàn)為生長(zhǎng)量減少，并隨NaCl濃度的提高，出現(xiàn)嫩枝、葉片的黃化、干枯和死亡現(xiàn)象，生長(zhǎng)量明顯降低；而轉(zhuǎn)基因植株叢生芽生長(zhǎng)在6‰時(shí)生長(zhǎng)才出現(xiàn)明顯受害癥狀，說(shuō)明其NaCl的相對(duì)抗性提高了2‰～3‰。轉(zhuǎn)化植株能否穩(wěn)定遺傳是其開發(fā)利用的重要前提。本試驗(yàn)對(duì)初次kan選擇、PCR檢測(cè)和耐鹽性實(shí)驗(yàn)的植株，在繼代培育6～8代后，又進(jìn)行了二次Kan選擇(80天)、PCR檢測(cè)和耐鹽抗性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明70％的株系表現(xiàn)穩(wěn)定遺傳特性(即Kan選擇未出現(xiàn)黃化現(xiàn)象、PCR檢測(cè)有特異條帶和耐鹽性提高)；20％的株系分化的部分叢生苗有黃化現(xiàn)象(疑為嵌合體)，現(xiàn)正在提純；10％的株系明顯黃化，已被淘汰。上述結(jié)果說(shuō)明，經(jīng)過(guò)連續(xù)選擇淘汰，完全可以獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化株系。
本方法建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效、可重復(fù)的林木基因轉(zhuǎn)化方法，已成功的將甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)整合到四倍體刺槐基因組中，獲得了抗鹽性提高的轉(zhuǎn)化植株，現(xiàn)已成功移栽到大田，獲得了大量轉(zhuǎn)化植株；建立了轉(zhuǎn)化植株的組培快繁、溫室煉苗、營(yíng)養(yǎng)缽移栽、大田成苗的全部技術(shù)。此項(xiàng)研究申報(bào)國(guó)家招標(biāo)項(xiàng)目“國(guó)家轉(zhuǎn)基因植物研究與產(chǎn)業(yè)化專項(xiàng)”獲得通過(guò)，現(xiàn)正在進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，在生產(chǎn)上極有推廣利用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種四倍體刺槐轉(zhuǎn)基因及組培快繁方法，由以下步驟組成(1)將四倍體刺槐當(dāng)年生新梢的莖段，消毒后接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基中，15～30天后轉(zhuǎn)接到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，得到的愈傷組織，經(jīng)如下含有雙元載體pBin438的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404菌系轉(zhuǎn)基因處理后，再接種到分化培養(yǎng)基中形成叢生芽；上述啟動(dòng)培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、6-BA 0.2～1.5mg·L-1、NAA 0.08～2mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、瓊脂6～8g·L-1，pH值5.8；上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、KT 1.0～5mg·L-1、NAA 0.5～2mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、瓊脂6～8g·L-1，pH值5.8；上述分化培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、IBA 0.2～1.5mg·L-1、6-BA 2.0～4mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、瓊脂6～8g·L-1，pH值為5.8；上述培養(yǎng)條件為晝溫度25℃，夜溫度18℃，光照強(qiáng)度40umol.m-2.s-1，光照時(shí)間14h·d-1；(2)挑選上述根癌農(nóng)桿菌單菌落接種于含有卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，25-34℃，160-220rin/m條件下，培養(yǎng)18～26小時(shí)，轉(zhuǎn)接于無(wú)抗菌素的YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液在離心后，再加入適量無(wú)菌MS液體培養(yǎng)基稀釋至OD6000.3～0.7；上述YEB培養(yǎng)基的組成為每升含細(xì)菌蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉浸膏5g，MgSO4.7H2O 0.493g，pH7.0；(3)將上述愈傷組織切成小塊或薄片，預(yù)培養(yǎng)1～5天后，侵染農(nóng)桿菌菌液4～20min；向共培養(yǎng)培養(yǎng)基即分化培養(yǎng)基中加入15～40mg·L-1的乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)，培養(yǎng)3～8天后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基；10～50天后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)80～120天，繼代3～4次得Kan抗性植株；上述從轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基開始，加入濃度為400～600mg·L-1的頭孢霉素(cefotaxime，Cef)抑制農(nóng)桿菌；上述選擇培養(yǎng)基的組成為分化培養(yǎng)基、卡那霉素(kanamycin，Kan)50～100mg·L-1；(4)將上述獲得的Kan抗性植株，經(jīng)分子檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)化植株，如轉(zhuǎn)化植株的叢生芽小苗健壯，可直接生根，如小苗細(xì)弱，可轉(zhuǎn)入拔高培養(yǎng)基，經(jīng)壯苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基；上述拔高培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、KT 1.0～4.0mg·L-1、6-BA 0.1～2.0mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、瓊脂6～8g·L-1，pH值5.8～6.0；上述生根培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、IBA 1.0～3.0mg·L-1、蔗糖25～35g·L-1、瓊脂6～8g·L-1，pH值5.8～6.0；(5)幼苗在生根培養(yǎng)基中生長(zhǎng)30天以后，90％以上都會(huì)發(fā)育成健壯的生根幼苗，經(jīng)過(guò)馴化煉苗后，栽入大田。
2.如權(quán)利要求1所述的一種四倍體刺槐轉(zhuǎn)基因及組培快繁方法，其特征在于，步驟(1)所述的含有雙元載體pBin438的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404菌系，其載體含有CaMV35s啟動(dòng)子、山波菜的甜菜堿醛脫氫酶基因(BADH)以及一個(gè)嵌合的NosNpt-II基因和35sGUS基因。
3.如權(quán)利要求1所述的一種四倍體刺槐轉(zhuǎn)基因及組培快繁方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基的配方是啟動(dòng)培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、6-BA 1.0mg·L-1、NAA 1.0mg·L-1、蔗糖30g·L-1、瓊脂7.0g·L-1，加瓊脂之前調(diào)節(jié)pH值為pH值5.8；誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、KT 2.5mg·L-1、NAA 1.5mg·L-1、蔗糖30g·L-1、瓊脂7.0g·L-1，加瓊脂之前調(diào)節(jié)pH值為pH值5.8；分化培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、IBA 1.0mg·L-1、6-BA 3.5mg·L-1、蔗糖30g·L-1、瓊脂7.0g·L-1，加瓊脂之前調(diào)節(jié)pH值為pH值5.8；上述選擇培養(yǎng)基的組成為分化培養(yǎng)基、卡那霉素(kanamycin，Kan)60mg·L-1；拔高培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、KT 3.5mg·L-1、6-BA 1.5mg·L-1、蔗糖30g·L-1、瓊脂7.0g·L-1，加瓊脂之前調(diào)節(jié)pH值為pH值5.8；生根培養(yǎng)基的組成為MS培養(yǎng)基、IBA 2.0mg·L-1、蔗糖30g·L-1、瓊脂7.0g·L-1，加瓊脂之前調(diào)節(jié)pH值為pH值5.8。
4.如權(quán)利要求1所述的一種四倍體刺槐轉(zhuǎn)基因及組培快繁方法，其特征在于，所述步驟(2)中，菌液在離心后，再加入適量無(wú)菌MS液體培養(yǎng)基稀釋至OD6000.5。
5.如權(quán)利要求1所述的一種四倍體刺槐轉(zhuǎn)基因及組培快繁方法，其特征在于，所述步驟(3)中涉及的愈傷組織經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后，侵染農(nóng)桿菌菌液10min。
6.如權(quán)利要求1所述的一種四倍體刺槐轉(zhuǎn)基因及組培快繁方法，其特征在于，所述步驟(3)中乙酰丁香酮的加入量為30mg·L-1。
7.如權(quán)利要求1所述的一種四倍體刺槐轉(zhuǎn)基因及組培快繁方法，其特征在于，所述步驟(3)中頭孢霉素的加入濃度為500mg·L-1。
8.如權(quán)利要求1所述的一種四倍體刺槐轉(zhuǎn)基因及組培快繁方法，其特征在于，所述步驟(5)中，移栽組培苗時(shí)，開始時(shí)在溫室內(nèi)打開瓶口，逐漸降低濕度，并增強(qiáng)光照，4～5天后洗凈培養(yǎng)基，移入營(yíng)養(yǎng)缽中，利用間歇噴霧裝置保持環(huán)境濕度，經(jīng)過(guò)馴化煉苗15-20天后，栽入大田，適當(dāng)遮蔭，成活率可達(dá)95％以上。
全文摘要
本發(fā)明公開一種四倍體刺槐轉(zhuǎn)基因及組培快繁方法，由以下步驟組成將四倍體刺槐當(dāng)年生新梢的莖段，消毒后經(jīng)啟動(dòng)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到的愈傷組織，經(jīng)含有雙元載體pBin438的根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌系轉(zhuǎn)基因處理后，再經(jīng)分化培養(yǎng)和選擇培養(yǎng)獲得的Kan抗性植株，經(jīng)分子檢測(cè)篩選出轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)馴化煉苗后，栽入大田。本發(fā)明的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的目的基因在木本植物上的轉(zhuǎn)化及包括叢生芽分化、生根和移栽等組培快繁技術(shù)提供了依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1582641SQ200410024208
公開日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月25日
發(fā)明者夏陽(yáng), 梁慧敏, 孫仲序, 王太明, 陳受宜 申請(qǐng)人:山東省林業(yè)科學(xué)研究院