一種小葉章莖段組培快繁的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種小葉章莖段組培快繁的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]小葉章(Calamagrostis angustifolia Kom.)是禾本科拂子茅屬多年生根莖型草本植物，在我國主要分布于東北、華北、內(nèi)蒙古等地區(qū)的平原低洼濕地，是三江平原典型草甸、沼澤化草甸的建群植物和優(yōu)勢植物。
[0003]小葉章具有重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值，例如在東北草地地區(qū)其飼用價值僅次于羊草，同時它也是很好的水土保持植物和造紙等輕工業(yè)的良好原料。
[0004]近年來，由于三江平原大量濕地開墾成農(nóng)田，使得濕地生態(tài)系統(tǒng)遭到嚴(yán)重破壞，濕地生物多樣性降低，小葉章的種群受到嚴(yán)重的破壞，生態(tài)功能下降。因此，對小葉章的人工繁殖可以減少對野生資源的破壞。
[0005]目前，小葉章仍處于野生狀態(tài)，種子萌芽率低，結(jié)實率低，而利用植物離體器官直接再生不定芽具有培養(yǎng)時間短，不容易發(fā)生變異，在短期內(nèi)快速繁殖優(yōu)質(zhì)苗木而不受到季節(jié)的限制等優(yōu)點。因此，本發(fā)明以小葉章幼嫩莖段為外植體，通過直接誘導(dǎo)不定芽、繼代增殖、生根和煉苗移栽等過程，從而建立小葉章的組織培養(yǎng)和快速繁殖體系，為小葉章的資源保護、基因工程研究提供可靠的理論基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了解決野生狀態(tài)小葉章的種子萌芽率低和結(jié)實率低的問題，而提供了一種小葉章莖段組培快繁的方法。
[0007]本發(fā)明的小葉章莖段組培快繁的方法按以下步驟進行:
[0008]—、莖段外植體的采集:選取當(dāng)年新生無病蟲害和生長健壯的幼嫩莖段作為外植體；
[0009]二、莖段外植體的消毒:將采集的外植體去除葉片后，剪成3cm?4cm長的莖段，用自來水沖洗8min?1min，再用適量的洗潔精水沖洗2?3遍，然后用自來水沖洗干凈后置于超凈工作臺中，用70%?75%酒精浸泡30s?40s，無菌水沖洗2?3次；用0.1 ^HgCl2溶液消毒2111；[11、41]1；[11、61]1；[11、81]1；[11、101]1；[11和151]1；[11，期間不斷搖晃，無菌水沖洗5?6次，用無菌濾紙吸干表面水分，備用；
[0010]三、誘導(dǎo)培養(yǎng):將消毒好的莖段接種于無菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)出腋芽;所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含有0.lmg/L?0.5mg/L 6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5?5.8;
[0011 ]四、增殖培養(yǎng):將腋芽切下，切取長度為1.5cm?2cm，然后將腋芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；連續(xù)繼代培養(yǎng)2次?3次，腋芽分化形成增殖苗；所述的增殖培養(yǎng)基為:含有
0.5mg/L?1.0mg/L2_iP(植物激素異戊稀基腺嘌呤)、0.lmg/L?0.5mg/L6_BA、0.lmg/L?
0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5?5.8;培養(yǎng)條件:溫度25±2°C，光照強度30μπιο1.m-2.s—1 ?40ymol.m-2.s—1，光照 14h/d?16h/d;誘導(dǎo)培養(yǎng)28d?30d;
[0012]五、壯苗伸長培養(yǎng):將步驟四得到的增殖苗的叢生芽切下轉(zhuǎn)接到伸長培養(yǎng)基中，得到伸長的叢生芽；所述的伸長培養(yǎng)基為:含有0.lmg/L?0.5mg/L GA3、0.lmg/L?0.2mg/LNAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5?5.8;
[0013]六、生根培養(yǎng):切取步驟五伸長的叢生芽，然后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，得到組培生根苗，所述的生根培養(yǎng)基為:含有0.lmg/L?2.0mg/L NAA、30g/L?35g//L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5?5.8，培養(yǎng)條件:溫度25 ± 2°C，光照強度30μmo I.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;誘導(dǎo)培養(yǎng)28d?30d;
[0014]七、煉苗移栽:將組培生根苗在煉苗室開蓋鍛煉2天?3天后，移栽至混合基質(zhì)中，得到小葉章再生植株;所述混合基質(zhì)是由草炭土、蛭石和珍珠巖按重量比3: (I?2): (I?3)組成的混合物。
[0015]本發(fā)明相對于現(xiàn)有的技術(shù)的優(yōu)點:
[0016](I)本發(fā)明采用莖段直接再生不定芽具有培養(yǎng)時間短(能在3個月到4個月之間成苗)，不容易發(fā)生變異等優(yōu)點，能較好的保持母本的生物學(xué)性狀，從而為小葉章的資源保護、基因工程研究提供可靠的理論基礎(chǔ)。
[0017](2)本發(fā)明的小葉章莖段組培快繁方法，外植體的腋芽誘導(dǎo)速度快;誘導(dǎo)率高、達(dá)87.44%以上；增殖系數(shù)可達(dá)5.76?6.23，生根率可達(dá)100%，組培生根苗健壯、移栽成活率高達(dá)95%以上。
[0018]附圖及說明
[0019]圖1為實施例1的無菌材料圖片；
[0020]圖2為實施例1的莖段腋芽萌發(fā)圖片；
[0021]圖3為實施例1的莖段增殖培養(yǎng)圖片；
[0022]圖4是實施例1的壯苗伸長培養(yǎng)圖片；
[0023 ]圖5是實施例1的生根培養(yǎng)圖片；
[0024]圖6是實施例1的移栽成活圖片。
【具體實施方式】
[0025]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0026]【具體實施方式】一:本實施方式的小葉章莖段組培快繁的方法按以下步驟進行:
[0027]—、莖段外植體的采集:選取當(dāng)年新生無病蟲害和生長健壯的幼嫩莖段作為外植體；
[0028]二、莖段外植體的消毒:將采集的外植體去除葉片后，剪成3cm?4cm長的莖段，用自來水沖洗8min?1min，再用適量的洗潔精水沖洗2?3遍，然后用自來水沖洗干凈后置于超凈工作臺中，用70%?75%酒精浸泡30s?40s，無菌水沖洗2?3次；用0.1 ^HgCl2溶液消毒2111；[11、41]1；[11、61]1；[11、81]1；[11、101]1；[11和151]1；[11，期間不斷搖晃，無菌水沖洗5?6次，用無菌濾紙吸干表面水分，備用；
[0029]三、誘導(dǎo)培養(yǎng):將消毒好的莖段接種于無菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)出腋芽;所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含有0.lmg/L?0.5mg/L 6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5?5.8;
[0030]四、增殖培養(yǎng):將腋芽切下，切取長度為1.5cm?2cm，然后將腋芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；連續(xù)繼代培養(yǎng)2次?3次，腋芽分化形成增殖苗；所述的增殖培養(yǎng)基為:含有
0.5mg/L?1.0mg/L2-1P、0.lmg/L?0.5mg/L6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L鹿糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5?5.8;培養(yǎng)條件:溫度25 土 2 V，光照強度30μηιο1.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;誘導(dǎo)培養(yǎng)28d?30d;
[0031]五、壯苗伸長培養(yǎng):將步驟四得到的增殖苗的叢生芽切下轉(zhuǎn)接到伸長培養(yǎng)基中，得到伸長的叢生芽；所述的伸長培養(yǎng)基為:含有0.lmg/L?0.5mg/L GA3、0.lmg/L?0.2mg/LNAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5?5.8;
[0032]六、生根培養(yǎng):切取步驟五伸長的叢生芽，然后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，得到組培生根苗，所述的生根培養(yǎng)基為:含有0.lmg/L?2.0mg/L NAA、30g/L?35g//L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5?5.8，培養(yǎng)條件:溫度25 ± 2°C，光照強度30μmo I.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;誘導(dǎo)培養(yǎng)28d?30d;
[0033]七、煉苗移栽:將組培生根苗在煉苗室開蓋鍛煉2天?3天后，移栽至混合基質(zhì)中，得到小葉章再生植株;所述混合基質(zhì)是由草炭土、蛭石和珍珠巖按重量比3: (I?2): (I?3)組成的混合物。
[0034]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含有0.5mg/L 6-BA、0.lmg/L NAA、35g/L蔗糖和7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5。其他步驟與參數(shù)與【具體實施方式】一相同。
[0035]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，增殖培養(yǎng)基為:含有
0.5mg/L 2-1P、0.5mg/L6_BA、0.lmg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂粉的 1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5。其他步驟與參數(shù)與【具體實施方式】一相同。
[0036]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，步驟四增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)條件:溫度25°C，光照強度30μπκ)1πΓ2.s—S光照15h/d;誘導(dǎo)培養(yǎng)28d。其他步驟與參數(shù)與【具體實施方式】一相同。
[0037]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，伸長培養(yǎng)基為:含有
0.5mg/L GA3、0.lmg/L熟4、308/1蔗糖和68/1瓊脂粉的1/21^培養(yǎng)基，？田直為5.5。其他步驟與參數(shù)與【具體實施方式】一相同。
[0038]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，所述的生根培養(yǎng)基為:含有2.0mg/L嫩4、308/1蔗糖和78/1瓊脂粉的1/21^培養(yǎng)基，？!1值為5.5。其他步驟與參數(shù)與【具體實施方式】一相同。
[0039]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，步驟六生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件:溫度25°C，光照強度40μπιΟ1.πΓ2.s—S光照16h/d;誘導(dǎo)培養(yǎng)30d。其他步驟與參數(shù)與【具體實施方式】一相同。
[0040]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是，混合基質(zhì)中按重量比草炭土:輕石:珍珠巖=3:1: I。其他步驟與參數(shù)與【具體實施方式】一相同。
[0041 ] 實施例1
[0042]本實施例的小葉章莖段組培快繁的方法按以下步驟進行:
[0043]—、莖段外植體的采集:選取當(dāng)年新生無病蟲害和生長健壯的幼嫩莖段作為外植體。
[0044]二、莖段外植體的消毒:將采集的外植體去除葉片后，剪成3cm?4cm長的莖段，用自來水沖洗lOmin，再用適量的洗潔精水沖洗2遍，然后用自來水沖洗干凈后置于超凈工作臺中，用75%酒精浸泡30s，無菌水沖洗2次；用0.1 %HgCh溶液消毒2min、4min、6min、8min、10mir^P15min，期間不斷搖晃，無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分，備用(圖1);
[0045]三、誘導(dǎo)培養(yǎng):將消毒好的莖段接種于無菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)出腋芽;所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(和前面說的無菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基是一個)為:1/2MS(MS大量元素減半，其他不變)+6-BA0.5mg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖35g/L+瓊脂粉7g/L+pH值為5.5(圖2);
[0046]四、增殖培養(yǎng):將長度1.5?2cm的腋芽切下轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基培養(yǎng);連續(xù)繼代2次?3次，腋芽分化形成增殖苗;所述的增殖培養(yǎng)基為:l/2MS+2-1P(植物激素異戊烯基腺嘌呤)0.5mg/L+6-BA0.lmg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖35g/L+瓊脂粉7g/L+pH值為5.5;培養(yǎng)條件:溫度25°C，光照強度40μπιΟ1.πΓ2.s—S光照16h/d;誘導(dǎo)培養(yǎng)28d(圖3);
[0047]五、壯苗伸長培養(yǎng):將步驟四得到的增殖苗的叢生芽切下轉(zhuǎn)接到伸長培養(yǎng)基中，所述的伸長培養(yǎng)基為:1/2MS+GA30.5mg/L+NAA0.lmg/L+蔗糖35g/L+瓊脂粉6g/L+pH值為5.5(圖 4);
[0048]六、生根培養(yǎng):切取叢生芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，得到組培生根苗，所述的生根培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA2.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉7g/L+pH值為5.5，培養(yǎng)條件:溫度25°C，光照強度40μπιΟ1.m—2.s—1，光照 16h/d;誘導(dǎo)培養(yǎng)30d(圖5);
[0049]七、煉苗移栽:將生根苗在煉苗室開蓋鍛煉3天后，移栽至按重量比的草炭土:蛭石:珍珠巖=3:1:1混合的基質(zhì)中，得到小葉章再生植株(圖6)。
[0050]圖2為步驟三誘導(dǎo)培養(yǎng)15d后腋芽可長至3cm左右，葉片開展，形成綠梢，誘導(dǎo)率為87.44%。
[0051 ]圖3為步驟四腋芽的單芽形成芽叢，芽伸長生長快，增殖系數(shù)可高達(dá)5.76。
[0052]圖5表明不定根的誘導(dǎo)率為100%，植株健壯，葉色翠綠，根系粗壯。
[0053]本實施例實現(xiàn)了小葉章莖段快速繁殖成小葉章再生植株，且增殖系數(shù)可高達(dá)5.76和不定根的誘導(dǎo)率為100%。
【主權(quán)項】
1.一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特征在于:該方法按以下步驟進行: 一、莖段外植體的采集:選取當(dāng)年新生無病蟲害和生長健壯的幼嫩莖段作為外植體； 二、莖段外植體的消毒:將采集的外植體去除葉片后，剪成3cm-4cm長的莖段，用自來水沖洗Smin?lOmin，再用適量的洗潔精水沖洗2?3遍，然后用自來水沖洗干凈后置于超凈工作臺中，用70%?75%酒精浸泡30s?40s，無菌水沖洗2?3次；用0.1 ^HgCl2溶液消毒2min、4min、6min、8min、1min和15min，期間不斷搖晃，無菌水沖洗5?6次，用無菌濾紙吸干表面水分，備用； 三、誘導(dǎo)培養(yǎng):將消毒好的莖段接種于無菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)出腋芽;所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含有0.lmg/L?0.5mg/L 6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L鹿糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5?5.8; 四、增殖培養(yǎng):將腋芽切下，切取長度為1.5cm?2cm，然后將腋芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng);連續(xù)繼代培養(yǎng)2次?3次，腋芽分化形成增殖苗;所述的增殖培養(yǎng)基為:含有0.5mg/L?1.0mg/L2_iP、0.lmg/L?0.5mg/L6_BA、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L鹿糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的I /2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5?5.8 ;培養(yǎng)條件:溫度25 ± 2 °C，光照強度30μmo I.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;誘導(dǎo)培養(yǎng)28d?30d; 五、壯苗伸長培養(yǎng):將步驟四得到的增殖苗的叢生芽切下轉(zhuǎn)接到伸長培養(yǎng)基中，得到伸長的叢生芽;所述的伸長培養(yǎng)基為:含有0.lmg/L?0.5mg/L GA3、0.lmg/L?0.2mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5?5.8; 六、生根培養(yǎng):切取步驟五伸長的叢生芽，然后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，得到組培生根苗，所述的生根培養(yǎng)基為:含有0.lmg/L?2.0mg/L NAA、30g/L?35g/L蔗糖和6g/L?7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5?5.8，培養(yǎng)條件:溫度25 ± 2°C，光照強度30ymol.m—2.s—1 ?40μηιο1.m—2.s一工，光照 14h/d?16h/d;誘導(dǎo)培養(yǎng)28d?30d; 七、煉苗移栽:將組培生根苗在煉苗室開蓋鍛煉2天?3天后，移栽至混合基質(zhì)中，得到小葉章再生植株;所述混合基質(zhì)是由草炭土、蛭石和珍珠巖按重量比3: (I?2): (I?3)組成的混合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特征在于:誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:含有0.5mg/L 6-BA、0.lmg/L NAA、35g/L蔗糖和7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特征在于:增殖培養(yǎng)基為:含有0.5mg/L 2-1P、0.5mg/L6_BA、0.lmg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂粉的 1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特征在于:步驟四增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)條件:溫度25°C，光照強度30μπιΟ1.πΓ2.s—S光照15h/d;誘導(dǎo)培養(yǎng)28d。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特征在于:伸長培養(yǎng)基為:含有0.5mg/L GA3、0.lmg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特征在于:所述的生根培養(yǎng)基為:含有2.0mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L瓊脂粉的1/2MS培養(yǎng)基，pH值為5.5。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特征在于:步驟六生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件:溫度25°C，光照強度40μηιο1.m—2.s—S光照16h/d;誘導(dǎo)培養(yǎng)30d。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小葉章莖段組培快繁的方法，其特征在于:混合基質(zhì)中按 重量比草炭土:蛭石:珍珠巖= 3:1:1。
【專利摘要】一種小葉章莖段組培快繁的方法，本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種小葉章莖段組培快繁的方法。本發(fā)明的目的是為了解決野生狀態(tài)小葉章的種子萌芽率低和結(jié)實率低的問題。本發(fā)明的小葉章莖段組培快繁的方法按以下步驟進行：一、莖段外植體的采集、二、莖段外植體的消毒、三、誘導(dǎo)培養(yǎng)、四、增殖培養(yǎng)、五、壯苗伸長培養(yǎng)、六、生根培養(yǎng)、七、煉苗移栽。本發(fā)明采用莖段直接再生不定芽具有培養(yǎng)時間短(能在3個月到4個月之間成苗)，不容易發(fā)生變異等優(yōu)點且本發(fā)明的小葉章莖段組培快繁方法，外植體的腋芽誘導(dǎo)速度快；誘導(dǎo)率高。本發(fā)明的培養(yǎng)方法用于植物快速繁殖。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105706934
【申請?zhí)枴緾N201610124898
【發(fā)明人】張玉, 倪紅偉, 徐明怡, 冷海楠, 王麗媛, 隋心
【申請人】黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所