專利名稱：一種新型重組病毒載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，尤其是涉及一種用編碼致病病毒抗原的核苷酸序列和病毒載體序列構(gòu)建的重組體。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是由人乙型肝炎病毒(Human Hepatitis B virus, HBV)引起的，HBV為DNA雙鏈病毒，主要經(jīng)血液、密切接觸和母嬰垂直傳播。不同地區(qū)，HBV的感染幾率及傳播方式也不盡相同。感染HBV后，部分患者將發(fā)展成為慢性持續(xù)性感染狀態(tài)，有的可能演變?yōu)楦斡不蛟l(fā)性肝細(xì)胞癌。目前，據(jù)估計(jì)，全世界乙肝帶毒者約3.5億人，亞洲地區(qū)約2. 2億。我國(guó)約有1. 3億人是乙肝病毒攜帶者，每年用于治療肝炎的醫(yī)療費(fèi)用約300-500億元，并且多數(shù)感染發(fā)生在新生兒或兒童期，由于這一階段發(fā)生的感染早期多無(wú)癥狀，急性期極難被發(fā)現(xiàn)，因此90%以上將發(fā)展為慢性乙肝患者。目前，對(duì)于慢性乙肝患者和乙肝抗原表面攜帶者來(lái)說(shuō)目前尚無(wú)有效的治療方法。有限的化學(xué)療法雖然能在一定程度上抑制HBV復(fù)制，但卻不能徹底清除體內(nèi)的感染病毒。研究發(fā)現(xiàn)，乙肝患者的急性和慢性肝病的不同結(jié)局很大程度上是由于機(jī)體對(duì)HBV感染的免疫反應(yīng)不同所致。在急性乙肝患者體內(nèi)，針對(duì)HBV的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity T lymphocyte, CTL)反應(yīng)是^艮活^夭的、是多位點(diǎn)和高度特異性的，可迅速清除感染病毒；而慢性乙肝患者和乙肝病毒健康攜帶者體內(nèi)針對(duì)HBV的特異性CTL應(yīng)答明顯低下，致使病毒持續(xù)存在，因此目前學(xué)術(shù)界認(rèn)為糾正和克服患者體內(nèi)的CTL低反應(yīng)狀態(tài)可能是機(jī)體清除HBV，使患者得到徹底恢復(fù)的關(guān)鍵。
CTL是通過(guò)什么;f幾理來(lái)達(dá)到清除HBV的目的的呢？由于HBV cccDNA結(jié)構(gòu)特殊，又具有長(zhǎng)期的穩(wěn)定性，最初一直認(rèn)為CTL只有通過(guò)破壞和殺傷感染的肝細(xì)胞才能達(dá)到清除病毒的作用。但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)事實(shí)并非如此。在HBV轉(zhuǎn)基因鼠模型中，病毒特異性的CTL主要是通過(guò)非細(xì)胞致病性過(guò)程來(lái)清除病毒的，只有極小一部分殘存病毒的清除是通過(guò)CTL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞毒性反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，整個(gè)病毒清除過(guò)程中受損肝細(xì)胞不足1 % 。 Guidotti在HBV急性感染黑猩猩動(dòng)物;漠型中也發(fā)現(xiàn)，在急性期，HBV DNA絕大部分被清除，而這個(gè)期間并沒(méi)有肝損害、細(xì)胞凋亡及ALT升高。由此可見(jiàn)在HBV急性感染過(guò)程中，HBV主要是通過(guò)這種非細(xì)胞致病性機(jī)理清除的。其具體過(guò)程為HBV特異性的CTL識(shí)別感染肝細(xì)胞表面的病毒靶抗原，隨即釋放細(xì)胞因子，主要是IFN~y和TNF- a ,通過(guò)旁分泌機(jī)制直接作用于HBV感染肝細(xì)胞，激活肝細(xì)胞內(nèi)的抗病毒分子機(jī)制。同時(shí)，這些細(xì)胞因子激活Kupffer細(xì)胞，并通過(guò)正反饋機(jī)制進(jìn)一步產(chǎn)生更多的TNF-ct 。這種細(xì)胞因子的環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒和病毒RNA的降解。
目前市面上應(yīng)用的乙肝疫苗是酵母重組乙肝疫苗，主要用于乙肝的預(yù)防，不能起到治療乙肝的作用。蔡雄茂等，2002年，將HBV核心和前SI融合蛋白在大腸桿菌及真核進(jìn)行表達(dá)。陳新春等，2003年，用乙型肝炎病毒核心抗原與前SI抗原融合蛋白誘導(dǎo)小鼠，使其產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
國(guó)外進(jìn)入臨床I期和國(guó)內(nèi)外處于實(shí)驗(yàn)室階段的治療性乙肝疫苗都屬于DNA疫苗，DNA疫苗目前存在的問(wèn)題是外源核酸是否會(huì)整合到染色體中引起癌變，能否引起免疫病理作用等問(wèn)題尚未有確切結(jié)論，且疫苗誘發(fā)的免疫反應(yīng)強(qiáng)度較弱。所以應(yīng)用具宿主范圍廣、高效轉(zhuǎn)導(dǎo)、穩(wěn)定、安全、易操作等優(yōu)點(diǎn)的腺病毒做為載體，則能避免上述缺點(diǎn)。
腺病毒在自然界分布廣泛，在許多哺乳動(dòng)物和畜類中都發(fā)現(xiàn)其存在。至今已分離到IOO種以上不同血清型的各種腺病毒。腺病毒是二十面體病毒殼體結(jié)構(gòu)，其基因組為線性的雙鏈DNA。由于腺病毒做為載體具有高的感染效率和高的外源基因表達(dá)水平、同時(shí)高滴度重組病毒的制備較簡(jiǎn)單、容量適合裝載大多數(shù)外源基因、不整合入輩巴細(xì)胞基因組等等的優(yōu)點(diǎn)，故腺病毒被廣泛用于基因治療的載體。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種新型重組病毒載體。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為 一種新型重組病毒載體，該載體包括病毒載體和一條核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼致病病毒的兩個(gè)抗原的融合蛋白，所述抗原含有B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，該重組載體能使免疫動(dòng)物產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
所述病毒栽體是腺病毒栽體、腺相關(guān)病毒載體、SV40病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒栽體、單純皰滲病毒載體或痘苗病毒載體。所述腺病毒載體是缺失性腺病毒載體。
5所述核苷酸序列插入至腺病毒的El、 E2、 E3或E4區(qū)域。 所述腺病毒載體是人腺病毒載體。
所述腺病毒載體是人5型腺病毒載體、35型腺病毒載體、2型腺病毒載體或6 型腺病毒載體。
所述腺病毒載體是動(dòng)物腺病毒載體。
所述致病病毒是曱型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒 或者戊型肝炎病毒。
所述核苷酸序列是編碼乙型肝炎病毒抗原表位的核苷酸序列。
所述致病病毒的抗原是乙型肝炎病毒的表面抗原、核心抗原、pol抗原或含T 細(xì)胞表位的抗原，所述核苷酸序列編碼上述抗原中的兩種。
所述核苷酸序列編碼乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原的融合蛋白，兩個(gè)抗原 的核苷酸序列可以通過(guò)一段核苷酸序列連接，也可以直接連接。
所述核苷酸序列編碼乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原的融合蛋白，如SEQ ID NO: 1所示。
所述致病病毒為人乳頭瘤病毒、禽流感病毒、sars病毒或者HIV病毒。 所述重組栽體還含有至少 一個(gè)免疫刺激物基因序列。
所述免疫刺激物是白細(xì)胞介素、千擾素、粒細(xì)胞集落刺激因子或者粒細(xì)胞-巨 噬細(xì)胞集落刺激因子。
上述新型重組病毒栽體在制備用于預(yù)防和治療由致病病毒引起的疾病的藥物中 的應(yīng)用。
一種用上述新型重組病毒載體制備的疫苗。
本發(fā)明的新型重組腺病毒是通過(guò)如下方法獲得的，是將兩個(gè)或兩個(gè)以上的目的 基因通過(guò)基因工程方法進(jìn)行融合，然后以酶切方式插入到經(jīng)改良過(guò)的腺病毒載體中 形成重組體，然后在大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)分離、提取、純化后，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞 (人胚腎細(xì)胞)，在2 9 3細(xì)胞內(nèi)包裝成的類病毒顆粒。
根據(jù)上述方案，首先通過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需目的基因，將兩個(gè)目的基因HBc和 HBs通過(guò)PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行連接，得到帶有HBc和HBs基因的新的片段。將該新得 到的目的基因片段克隆入穿梭質(zhì)粒載體pDC515 (io)，通過(guò)FLP-frt重組酶系統(tǒng)在 293細(xì)胞中獲得重組腺病毒。
乙肝核心抗原和乙肝表面抗原具有引起CTL反應(yīng)和體液免疫應(yīng)答的作用。用乙肝核心抗原和表面抗原做為目的基因的重組體作用于動(dòng)物能引起動(dòng)物體內(nèi)CTL反應(yīng) 及體液免疫應(yīng)答。本申請(qǐng)所述重組腺病毒載體作用于動(dòng)物后引起的CTL反應(yīng)強(qiáng)度遠(yuǎn) 遠(yuǎn)大于乙肝核心抗原重組腺病毒載體和表面抗原重組腺病毒載體的組合，也強(qiáng)于單 獨(dú)乙肝核心抗原的重組體，由于腺病毒〗故為栽體具有高的感染效率和高的外源基因 表達(dá)水平、不整合入靶細(xì)胞基因組等等的優(yōu)點(diǎn)，因此注射本發(fā)明所述重組腺病毒載 體具有高度安全性。另外，用乙肝核心抗原、表面抗原和其它抗原做為目的基因的 重組腺病毒載體也能引起4艮強(qiáng)的CTL反應(yīng)。因此，注射本發(fā)明的重組病毒載體后， 能使動(dòng)物體內(nèi)引起體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。


圖1是CS9重組腺病毒疫苗構(gòu)建流程圖。
圖2是pDC515 ( io)質(zhì)粒圖譜。
圖3是PBHG厶E1. 3flp質(zhì)粒圖譜。
圖4是PCR方法^r測(cè)重組腺病毒HB-CS的電泳圖片。
圖5是各組小鼠注射重組腺病毒后1 、 4周CTL反應(yīng)強(qiáng)度表(n = 3 )。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、 CS9重組腺病毒疫苗的構(gòu)建
下面結(jié)合圖1對(duì)CS9重組腺病毒疫苗的構(gòu)建做進(jìn)一步詳細(xì)描述。
以下所述5型人腺病毒還可以是2型人腺病毒、6型人腺病毒、35型人腺病毒或
者動(dòng)物腺病毒。
1、 編碼乙型肝炎病毒表面抗原的核苷酸序列HBs的獲得抽取乙肝病人血清， 從病人血清中提取乙肝病毒DNA,以提取的DNA為模板，設(shè)計(jì)引物
HBV-S-F: 5'- ATCTCAATGT GAGAGCACAAC-3'， HBV-S-R: 5'-TCAAATGTATACCCAAAGAC-3'(華大基因上海鼎安合 成)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為第一循環(huán)94。C變性2分鐘，以后各循環(huán)94°C 變性30秒，49。C退火30秒，72。C延伸1分，共35個(gè)循環(huán)，之后72。C延伸7分鐘， 得到HBs片段得，其具體序列如SEQ ID NO: 2所示。
2、 編碼乙型肝炎病毒核心抗原的核苷酸序列HBc的獲得抽取乙肝病人血清，從病人血清中提取乙肝病毒DNA,以提取的DNA為模版，設(shè)計(jì)引物 HBV-C-F: 5'-GCTAGCATGGA CATTGACCCGTAT-3'， HBV-C-R: 5'-GTTGTGCTCTCACATTGAGAT-3'(華大基因上海鼎安合
成)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為第一循環(huán)94。C變性2分鐘，以后各循環(huán)94。C
變性30秒，49'C退火30秒，72'C延伸1分，共35個(gè)循環(huán)，之后72"C延伸7分鐘，
得到HBc片段，其具體序列如SEQ ID NO: 3所示。
3、 CS融合基因片段的獲得先將上兩步得到的HBc片段和HBs片段混合，再加 入dNTPs， rTaq酶，緩沖液和雙蒸水，94。C變性2分鐘，94。C變性30秒，55。C退火 30秒，72。C延伸2分， 一個(gè)循環(huán)后，再往PCR體系中加入引物HBV-C-F和HBV-S-R， 進(jìn)行PCR:第一循環(huán)94。C變性2分鐘，以后各循環(huán)94。C變性30秒，49。C退火30 秒，72'C延伸1. 5分，共35個(gè)循環(huán)，之后72°〇延伸7分鐘。得到CS融合基因片段， 其具體序列如SEQ ID NO: 1所示。將其得到的PCR片段插入到T載體(Promega公 司)中，得到T/CS載體。
4、 腺病毒穿梭栽體PDC515/CS的獲得用Nhel和Sail酶切質(zhì)粒T/CS得到CS 片段；用Nhel和Sail酶切載體PDC515 ( io) (Microbix Biosystems公司)，其質(zhì) 粒圖語(yǔ)如圖2所示，得到PDC515/Nhel + Sail片段，用T4DNA連接酶連接上述兩個(gè) 片段，得到攜帶乙肝表面抗原基因HBs和核心抗原基因HBc的穿梭質(zhì)粒pDC515/CS, 命名為腺病毒穿梭載體PDC515/ CS。
5、同源重組腺病毒穿梭載體PDC515/ CS與5型人腺病毒骨架載體PBHG厶 El. 3flp ( ( Microbix Biosystems 司，其質(zhì)粒圖i普如圖 3所示，利用 Lipofectamine2000 (invitrogen)共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，通過(guò)同源重組的方法獲得病 毒。共轉(zhuǎn)染11-15天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過(guò)3次病毒空斑純化，得到表達(dá)乙肝核心抗 原和乙肝表面抗原的重組腺病毒，命名為HB-CS重組腺病毒疫苗(簡(jiǎn)稱為CS9)。提 取重組腺病毒DNA，PCR方法檢測(cè)插入的CS序列，目的基因檢測(cè)引物為引物HBV-C-F 和HBV-S-R,腺病毒載體檢測(cè)引物為
E2BF : 5' -TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG3',
E2BR: 5' -CATCTGAACTCAAAGCGTGG3';
PDC515F: 5' ACA TCC ACT TTG CCT TTC TC 3'，
PDC515R: 5'GAC,AAA,CCA，CAA,CTA,GAA,TGC3'(華大基因上海鼎安)，對(duì)重組腺病毒進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4:泳道1為DL2000 marker,泳道2 -4以E2BF和E2BR為引物2為陽(yáng)性對(duì)照，3為樣品，4為陰性對(duì)照，泳道5-7 以pDC515F和pDC515R為引物5為陽(yáng)性對(duì)照，6為樣品，7為陰性對(duì)照，泳道10 -12以HBV-C-F和HBV-S-R為引物IO為樣品，ll為陽(yáng)性對(duì)照，12為陰性對(duì)照。 同時(shí)進(jìn)行測(cè)序(華大基因上海鼎安)，測(cè)序結(jié)果正確的腺病毒命名為腺病毒疫苗 HB-CS (簡(jiǎn)稱為CS9)。
實(shí)施例2、重組腺病毒生產(chǎn)實(shí)驗(yàn) 重組腺病毒擴(kuò)增
培養(yǎng)293細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)，接種重組腺病毒于293細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增方 法為本技術(shù)領(lǐng)域已知的，可以參考《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(鄂征北京出版 社)。
重組腺病毒純化
采用離子交換柱HPLC純化系統(tǒng)對(duì)重組腺病毒進(jìn)行純化。 重組腺病毒活性測(cè)定
TCID50方法測(cè)得重組腺病毒CS9的比滴度為4. 80%。 實(shí)施例3、重組腺病毒疫苗免疫小鼠實(shí)驗(yàn)
整合了乙肝核心抗原基因與乙肝表面抗原基因的腺病毒疫苗CS9在感染動(dòng)物后 會(huì)模擬正常腺病毒感染模式，誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)乙肝核心抗原的特異性細(xì)胞免 疫和體液免疫，當(dāng)機(jī)體再次接觸病原體時(shí)，通過(guò)多信號(hào)途徑刺激特異性免疫記憶細(xì) 胞分泌細(xì)胞因子Y-IFN， Y-IFN已經(jīng)證實(shí)具有抗病毒效果。ELISPOT實(shí)驗(yàn)即通過(guò)檢 測(cè)y -IFN的分泌從而間接檢測(cè)特異性CTL反應(yīng)。重組腺病毒CS9免疫C5VBL小鼠， 同時(shí)用單獨(dú)含HBc基因的重組腺病毒C7和單獨(dú)含HBs基因的重組腺病毒S8 ( H和 S8的構(gòu)建方法參考本申請(qǐng)所述重組腺病毒CS9的構(gòu)建方法，此處未詳細(xì)敘述)組合 (C7/S8)做為對(duì)照，于第1、 4周取其脾臟制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，分別以乙肝核心抗 原多肽和乙肝表面抗原多肽為體外刺激物，進(jìn)行ELISPOT試驗(yàn)。相同條件下，看試 驗(yàn)組分泌Y-IFN的鼠脾細(xì)胞即形成斑點(diǎn)的細(xì)胞(spot forming cell, SFC )是否 比對(duì)照組顯著增多。
實(shí)3僉共分三組，分別注射CS9, C7/S8和病毒保存液，每組動(dòng)物注射6只C5〃BL 小鼠(雄性，6-8周齡，中山大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心)。后腿肌肉注射100ul/只，CS9組10'。vp/小鼠，C7/S8組:C710"Vp + S810'。vp/小鼠。注射后1、 4周時(shí)，每組取3只 動(dòng)物處死。
體液免疫實(shí)驗(yàn)摘眼球取全血，5000rpm離心10分鐘后吸出上層血清，1: 2 稀釋后進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)(按上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)有限公司說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，測(cè)HBV 表面抗體。結(jié)果顯示，1、 4周實(shí)驗(yàn)組小鼠和注射C7/S8組小鼠血清抗HBV表面抗體 均為陽(yáng)性，注射病毒保存液組均為陰性。即注射腺病毒后誘導(dǎo)了體液免疫反應(yīng)，說(shuō) 明本發(fā)明的腺病毒疫苗具有預(yù)防乙肝的作用。
ELISPOT實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后無(wú)菌取脾臟研磨制成單個(gè)細(xì)胞懸液，進(jìn)行稀釋，將 之加于預(yù)先包被并封閉好的ELISPOT板上96孔內(nèi)，每孔5 x 105個(gè)脾細(xì)胞。加入乙 肝核心抗原多肽和乙肝表面抗原多肽(華大基因上海天源合成)作為刺激物。進(jìn)行 ELISPOT實(shí)驗(yàn)具體步驟參考見(jiàn)U-Cytech試劑盒說(shuō)明書(shū)。
試驗(yàn)組同時(shí)攜帶乙肝核心抗原表位和表面抗原表位，在誘導(dǎo)CTL反應(yīng)上具有優(yōu) 勢(shì)。由圖5結(jié)果可知試驗(yàn)組的CTL反應(yīng)強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組。
由上可知小鼠注射重組腺病毒CS9后在體外經(jīng)特異性多肽刺激后能釋放y -IFN，從而證明重組腺病毒CS9可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，當(dāng)激活的 細(xì)胞再次遇到相同病原體時(shí)，就會(huì)釋放y-IFN等細(xì)胞因子發(fā)揮抗病毒作用。
所以說(shuō)本發(fā)明的重組腺病毒CS9可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生HBV核心抗原特異性CTL反 應(yīng)和HBV表面抗原特異性CTL反應(yīng)，從而提示重組腺病毒CS9對(duì)乙肝具有更好的治 療作用。
10<formula>formula see original document page 11</formula>gactaccaag gtatgttgcc cgtttgtcct ctacttccag gaacaacaac taccagtacg 900 ggaccatgca agacctgcac gattcctgct caaggaacct ctatgtttcc ctcttgttgc 960 tgtacaaaac cttcggaegg aaactgcact tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc 1020 gcaagattcc tatgggagtg ggcctcagtc cgtttctcct ggctcagttt actagcgcca 1080 tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc actgtttggc tttcagttat atggatgatg1140 tggtattggg ggccaagtct gtacaacatc ttgagtccct ttttacctct attaccaatt 1200 ttcttttgtc tttgggtata catttga 1227
<210> 2
<211> 688
<212> DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400> 2
atctcaatgt gagagcacaa catcaggatt cctaggaccc ctgctcgtgt tacaggcggg 60 gtttttcttg ttgacaagaa tcctcacaat accacagagt ctagactcgt ggtggacttc 120 tctcaatttt ctagggggag cacccacgtg tcctggccaa aattcgcagt ccccaacctc 180 caatcactca ccaacctctt gtcctccaat ttgtcctggc tatcgctgga tgtgtctgcg 240 gcgttttatc atattcctct tcatcctgct gctatgcctc atcttcttgt tggttcttct 300 ggactaccaa ggtatgttgc ccgtttgtcc tctacttcca ggaacaacaa ctaccagtac 360 gggaccatgc aagacctgca cgattcctgc tcaaggaacc tctatgtttc cctcttgttg 420 ctgtacaaaa ccttcggacg gaaactgcac ttgtattccc atcccatcat cctgggcttt 480 cgcaagattc ctatgggagt gggcctcagt ccgtttctcc tggctcagtt tactagcgcc 540 atttgttcag tggttcgtag ggctttcccc cactgtttgg ctttcagtta tatggatgat 600 gtggtattgg gggccaagtc tgtacaacat cttgagtccc臓acctc tattaccaat 660
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56權(quán)利要求
1. 一種新型重組病毒載體，其特征在于該載體包括病毒載體和一條核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼致病病毒的兩個(gè)抗原的融合蛋白，所述抗原含有B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，該重組載體能使免疫動(dòng)物產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型重組病毒載體，其特征在于所述病毒載體是腺病毒 載體、腺相關(guān)病毒載體、SV4G病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、單純皰滲病毒載體 或疰苗病毒載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的新型重組病毒載體，其特征在于所述腺病毒載體是缺失 性腺病毒載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的新型重組病毒載體，其特征在于所述核苦酸序列插入至 腺病毒的E1、 E2、 E3或E4區(qū)域。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的新型重組病毒載體，其特征在于所述腺病毒載體是人腺 病毒栽體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的新型重組病毒載體，其特征在于所述腺病毒載體是人5 型腺病毒載體、35型腺病毒栽體、2型腺病毒載體或6型腺病毒載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的新型重組病毒載體，其特征在于所述腺病毒載體是動(dòng)物 腺病毒載體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型重組病毒載體，其特征在于所述致病病毒是曱型肝 炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或者戊型肝炎病毒。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的新型重組病毒載體，其特征在于所述核苷酸序列是編碼 乙型肝炎病毒抗原表位的核苷酸序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的新型重組病毒載體，其特征在于所述致病病毒的抗原是 乙型肝炎病毒的表面抗原、核心抗原、pol抗原或含T細(xì)胞表位，所述核苷酸序 列編碼上述抗原中的兩種。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的新型重組病毒載體，其特征在于所述核苷酸序列編碼 乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原的融合蛋白，兩個(gè)抗原的核苷酸序列可以通過(guò) 一段核脊酸序列連接，也可以直接連接。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的新型重組病毒載體，其特征在于所述核脊酸序列編碼 乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原的融合蛋白，如SEQ ID NO: 1所示。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型重組病毒載體，其特征在于所述致病病毒為人乳頭 瘤病毒、禽流感病毒、sars病毒或者HIV病毒。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型重組病毒載體，其特征在于重組載體還含有至少一 個(gè)免疫刺激物基因序列。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的新型重組病毒載體，其特征在于所述免疫刺激物是白 細(xì)胞介素、干擾素、粒細(xì)胞集落刺激因子或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。
16. 權(quán)利要求1 - 15任一項(xiàng)所述的新型重組病毒載體在制備用于預(yù)防和治療由致病 病毒引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，尤其是涉及一種新型重組病毒載體，該載體包括病毒載體和一條核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼致病病毒的兩個(gè)抗原的融合蛋白，所述抗原含有B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，該重組載體能使免疫動(dòng)物產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。同時(shí)注射本發(fā)明所述重組腺病毒載體具有高度安全性。
文檔編號(hào)C12N15/869GK101497891SQ200810065359
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2008年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月3日
發(fā)明者劉俊云, 周向軍, 唐云霞, 進(jìn) 李, 華 秦, 軍 郭 申請(qǐng)人:深圳市源興生物醫(yī)藥科技有限公司