一種速生白榆的組培快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種速生白愉的組培快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白愉化Imus P皿ila)為愉科愉屬植物，根系發(fā)達，適應(yīng)性強，耐寒耐旱，耐中度鹽堿，可 作濱海鹽堿地造林和綠化樹種，速生白愉在實際應(yīng)用中優(yōu)勢明顯，但傳統(tǒng)的桿插無性繁殖 法成活率低、擴繁周期長，致使其擴繁和推廣受到影響。
[0003] 目前國內(nèi)針對白愉的研究主要W資源保存、雜交育種、實生苗選育、非常規(guī)育種為 主，將細胞和組織培養(yǎng)用于白愉遺傳改良的較少，目前公開的白愉組織培養(yǎng)中，外植體W莖 段誘導(dǎo)效果較好，葉片分化效果不佳，培養(yǎng)基WMS最常用，激素 W6-節(jié)氨基腺嚷嶺(6-BA)為 主，輔W嗎I噪乙酸（IAA)、糞乙酸(NAA)、嚷苯隆(TDZ)等，王靜華等(2009) W白愉莖段和葉片 為外植體進行白愉再生研究，莖段再生效果較好，最適增值培養(yǎng)基為MS + 6-BA 0.10 mg/L +IBA 0.005mg/L，增值系數(shù)為243%，平均莖高2.65cm。最適生根培養(yǎng)基為:MS +IBA 0.Olmg/ L，生根率100%，生根系數(shù)8.94,但主根較少?，F(xiàn)有專利中，辛全偉等(2012)公布了一種耐鹽 白愉的繼代和生根配方;慕德宇等(2014)公布了一種耐鹽速生白愉繼代培養(yǎng)基EM及激素配 比;林大為等(2014)公布了一種白愉組培苗復(fù)壯的方法，W上研究集中在基本培養(yǎng)基研發(fā)、 繼代、壯苗、生根等一個或兩個環(huán)節(jié)且缺少煉苗過程，鮮有完整白愉再生體系，無法很好的 指導(dǎo)生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決W上現(xiàn)有技術(shù)中白愉組織培養(yǎng)方法不系統(tǒng)、無法很好的指導(dǎo)生產(chǎn)的問題，本 發(fā)明提供了一種完整的速生白愉的組培快繁方法。
[0005] 本發(fā)明是通過W下步驟得到的： 本發(fā)明所述速生白愉的組培快繁方法，由無菌外植體的獲得，叢生芽誘導(dǎo)，組培苗復(fù) 壯，生根培養(yǎng)和煉苗步驟組成。
[0006] 其中：所述無菌外植體獲得:5-6月份采取新生嫩枝和嫩芽為外植體，用飽和洗潔 凈水浸泡5~IOmin，后用毛筆輕刷表面，再用流水沖洗30~60min;移至超凈工作臺，用70~75% 酒精消毒20~30s，無菌水沖洗2~3次，再用1%次氯酸鋼溶液消毒8~IOmin，后用無菌水沖洗5~ 8次，每次不少于3min，最后再置于少量無菌水中，防止接種時間過長造成外植體缺水失活。 接種時，用無菌濾紙吸去外植體表面多余水分，獲得無菌外植體。
[0007] 其中：所述叢生芽誘導(dǎo)的方法是:將滅菌后的外植體剪成Icm左右?guī)П窝啃《谓臃N 于快繁培養(yǎng)基上，在25±2°C，光照14~1化，光強30001X條件下培養(yǎng)20~30天，獲得叢生芽;其 中所述快繁培養(yǎng)基的組成為:DKW + TDZ 0.075~0.2 mg/L + 6-BA 0.025~0.075 mg/L+ IBA 0.025~0.075 mg/L + NAA 0~0.1 mg/L+薦糖20~30g/L+瓊脂6.5g/L+AC 0.5g/L，抑值 為5.8~6.0;其中DKW培養(yǎng)基組分為:硝酸錠1416. Omg/L，棚酸4.8mg/L，無水氯化巧112.5mg/ L，硝酸巧1367.0mg/L，五水硫酸銅0.25mg/L，乙二胺四乙酸二鋼45.4mg/L，屯水硫酸鐵 33.8mg/L，硫酸儀361.49mg/L，一水硫酸儘33.5mg/L，鋼酸鋼0.39mg/L，六水硫酸儀 0.005mg/L，憐酸二氨鐘265. Omg/L，硫酸鐘1559. Omg/L，六水硝酸鋒17. Omg/L，鹽酸硫胺素 5.22mg/L。
[000引 其中：優(yōu)選快繁培養(yǎng)基為：DKW + TDZ 0.1-0.2 mg/L + 6-BA 0.025-0.05 mg/L+ IBA 0.025-0.075mg/L + NAAO-0.1 mg/L+薦糖25g/L+瓊脂6.5g/L +AC 0.5g/L。
[0009] 所述最適宜的快繁培養(yǎng)基為：DKW + TDZ 0.2 mg/L + 6-BA 0.05 mg/L+ IBA 0.025mg/L + NAAO.l mg/L+薦糖25g/L+瓊脂6.5g/L +AC 0.5g/L。
[0010] 其中：所述組培苗復(fù)壯的方法是:在無菌條件下將獲得的叢生芽分成單株，切去基 部愈傷組織，接種到復(fù)壯培養(yǎng)基上，在25 ±2°C，光照14~1化，光強30001X條件下培養(yǎng)20~30 天，得到莖桿粗壯，葉片開展，葉色濃綠的健壯組培苗；復(fù)壯培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+ TDZ 0.025111邑/1+6-84 0.1111邑/1+184 0.05111邑/1+4(：0.5/1+薦糖25邑/1+瓊脂6.5邑/1，口巧直為5.8 ~6.0 ;其中MS培養(yǎng)基組分為：硝酸錠1650 . Omg/L，硝酸鐘1900 . Omg/L，二水合氯化巧 440.0 mg/L，屯水硫酸儀370.0 mg/L，憐酸二氨鐘170mg/L，乙二胺四乙酸二鋼37.3mg/L，屯水 硫酸鐵27.8mg/L，艦化鐘0.83mg/L，四水硫酸儘22.3mg/L，二水鋼酸鋼0.25mg/L，棚酸 6.2mg/L，五水硫酸銅0.025mg/L，六水氯化鉆0.025mg/L，肌醇100 . Omg/L，鹽酸硫胺素 O.lmg/L，鹽酸化唉醇0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
[0011] 其中：所述生根培養(yǎng)的方法是:在無菌環(huán)境下將復(fù)壯后的組培苗剪去基部愈傷組 織，接種到生根培養(yǎng)基上，在25±2°C，光照14~1化，光強30001X條件下培養(yǎng)20~30天，得到生 根組培苗;生根培養(yǎng)基組成為DKW或1/2DKW或1/2MS培養(yǎng)基+ IBA 0.01~0.05 mg/L + NAA 0~0.05mg/L + AC0.5g/L+薦糖12.5g/L+瓊脂6.5g/L，pH值為5.8~6.0。
[001 ^ 其中1/2DKW培養(yǎng)基組分為：硝酸錠708. Omg/L，棚酸4.8mg/L，無水氯化巧56.25mg/ L，硝酸巧683.5mg/L，五水硫酸銅0.25mg/L，乙二胺四乙酸二鋼45.4mg/L，屯水硫酸鐵 33.8mg/L，硫酸儀361.49mg/L，一水硫酸儘33.5mg/L，鋼酸鋼0.39mg/L，六水硫酸儀 0.005mg/L，憐酸二氨鐘132.5mg/L，硫酸鐘779.5mg/L，六水硝酸鋒17 . Omg/L，鹽酸硫胺素 5.22mg/L。
[0013] 其中1/2MS培養(yǎng)基組分為：硝酸錠825 . Omg/L，硝酸鐘950 . Omg/L，二水合氯化巧 220.0 mg/L，屯水硫酸儀185. Omg/L，憐酸二氨鐘85. Omg/L，乙二胺四乙酸二鋼37.3mg/L，屯 水硫酸鐵27.8mg/L，艦化鐘0.83mg/L，四水硫酸儘22.3mg/L，二水鋼酸鋼0.25mg/L，棚酸 6.2mg/L，五水硫酸銅0.025mg/L，六水氯化鉆0.025mg/L，肌醇100 . Omg/L，鹽酸硫胺素 O.lmg/L，鹽酸化唉醇0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
[0014] 其中：優(yōu)選DKW或 1/2MS培養(yǎng)基+IBA 0.01-0.05 mg/L+NAAO-0.05 mg/L+ AC 0.5g/ L+薦糖 12.5g/L+瓊脂 6.5g/L，pH 值為 5.8~6.0。
[0015] 最適宜的生根培養(yǎng)基為：1/2MS培養(yǎng)基WBA 0.05 mg/L+NAA0.025 mg/L+ AC 0.5g/L+薦糖 12.5g/L+瓊脂 6.5g/L，pH 值為 5.8~6.0。
[0016] 其中：所述煉苗的方法是:將獲得的生根組培苗移至遮陰溫室，遮陰法控制自然光 500-10001X，室內(nèi)溫度20~25°C，濕度40% W上，閉瓶煉苗2-3天，開瓶蓋煉苗2-3天，取出小 苗，洗凈培養(yǎng)基后，移栽至賠石:草炭=1:1的基質(zhì)中，在溫室內(nèi)繼續(xù)煉苗30-40天，待根系發(fā) 育正常，苗株生長健壯后移栽至大田。
[0017] 本發(fā)明的有益效果： 1)本發(fā)明公開的速生白愉組培快繁方法是將外植體直接接種到快繁培養(yǎng)基上獲得叢 生芽，并將叢生芽分成單株后接種到復(fù)壯培養(yǎng)基上進行復(fù)壯，再將復(fù)壯組培苗接種到生根 培養(yǎng)基上。步驟中沒有初代培養(yǎng)，得到無菌苗直接進行快繁，快繁后經(jīng)壯苗再進行生根，提 高了組培苗生根質(zhì)量和煉苗成活率，經(jīng)檢索在目前公開的能找到的快繁方法的文獻中，本 發(fā)明的快繁出苗率是最高的，即速生白愉擴繁系數(shù)可達到4.5,生根率達到96.3%，煉苗成活 率 95〇/〇。
[0018] 2)本發(fā)明建立了針對速生白愉的組培快繁體系，利用改良培養(yǎng)基即在DKW培養(yǎng)基 基礎(chǔ)上添加不同濃度的和不同種類的激素提高繁殖效率，解決了速生白愉快繁難題，并且 本發(fā)明方法較常規(guī)步驟擴繁系數(shù)高、出苗質(zhì)量好，為速生工廠化育苗或規(guī)模化生產(chǎn)及推廣 奠定了良好基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0019] 圖1:本發(fā)明所述速生白愉組培及煉苗情況 其中：a:芽增殖b:組培苗復(fù)壯C:生根情況d:煉苗。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明。 實施例
[0021] 5-6月份采取新生嫩枝和嫩芽為外植體，用飽和洗潔凈水浸泡5~lOmin，后用毛筆 輕刷表面，再用流水沖洗30~60min;移至超凈工作臺，用70~75%酒精消毒30s，無菌水沖洗2~ 3次，再用1%次氯酸鋼溶液消毒8min，后用無菌水沖洗5~8次，每次不少于3min，最后再置于 少量無菌水中，防止接種時間過長造成外植體缺水失活。接種時，用無菌濾紙吸去外植體表 面多余水分，接種到含不同激素配比的快繁培養(yǎng)基上(見表1)。在25(±2)°C，光照14~1化， 光強30001x條