專利名稱：斑葉蘭組培培養(yǎng)基及其快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及蘭科植物斑葉蘭組培苗的優(yōu)化培養(yǎng)基配方及其快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
斑葉蘭(Goodyera schlechtendaliana)，別名小葉青，屬蘭科植物，分布于中國江蘇、浙江、湖北、貴州、四川、廣東、福建等省，主要產(chǎn)地在大盤山、天目山，是名貴珍稀瀕危藥用植物資源，性寒，味淡；清肺止咳，治支氣管炎，解毒消腫，活血止痛，軟堅散結(jié)；外用治毒蛇咬傷，癰癤瘡瘍；另外，斑葉蘭葉片十分美麗，可作觀賞植物栽培，十分精美，有寶石蘭之稱。由于其用途廣泛、藥效顯著，經(jīng)藥農(nóng)大肆采掘，已處于瀕危境地。
斑葉蘭種子構(gòu)造非常簡單，極其細(xì)小似灰塵，人們至今還沒有發(fā)現(xiàn)比它更小的種子，沒有胚乳，只有薄薄的一層種皮和少數(shù)供自己生長、發(fā)育需要的養(yǎng)料，所以它的生命力很弱，極易夭折，用這些種子來繁衍后代，幾乎是不可能的。斑葉蘭在自然界一般靠無性繁殖，但繁殖率很低，加上人為肆意采挖，故已瀕臨滅絕。蘭科植物應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快速育苗，已有成功的例子，如大花蕙蘭、蝴蝶蘭等，大花蕙蘭主要是利用其腋芽多的特點進(jìn)行腋芽組培獲得成功，蝴蝶蘭主要采用無菌播種技術(shù)，再經(jīng)原球莖分化幼苗途徑大量獲得試管苗。但大家知道，蘭科植物組培經(jīng)原球莖分化幼苗途徑存在種性易分化，后代不整齊，和多一道原球莖增殖環(huán)節(jié)，延長一個繁殖階段(30～45天)，增加了生產(chǎn)成本。斑葉蘭雖屬蘭科植物，但至今尚未見有組培成功的報道；斑葉蘭從種子結(jié)構(gòu)到植株生長發(fā)育對光、溫、水、肥、氣均有一定的要求，所以無論是組培育苗還是組培苗移栽，如何摸索創(chuàng)造條件以滿足斑葉蘭植物對上述因子的特定要求，是組培成功的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是克服以上存在不足，提出一種適于斑葉蘭組織培養(yǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基配方；本發(fā)明的另一目的是提出斑葉蘭應(yīng)用該配方進(jìn)行快速、低成本繁殖組培優(yōu)質(zhì)苗的方法。
本發(fā)明提出的適于斑葉蘭組織培養(yǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基，由基本培養(yǎng)基及分別適用于不同組培階段的培養(yǎng)基組成，各培養(yǎng)基添加物含量為1)基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基或改良MS培養(yǎng)基(1/2MS)，該培養(yǎng)基蔗糖或白糖20～30g/L，瓊脂7～9g/L，pH為5.0～6.0；2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA2.0～5.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L或IBA0.1～0.5mg/L；3)增殖培養(yǎng)基MS+6-BA2.0～5.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L或IBA0.1～0.5mg/L；4)壯苗培養(yǎng)基MS+6-BA0.2～2.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L或IBA0.1～0.5mg/L；5)生根培養(yǎng)基MS或1/2MS+IBA0.1～0.5mg/L和NAA0.1～0.5mg/L及活性碳1g/L中的任意一種、二種或三種的混合物。
所述斑葉蘭優(yōu)化組培培養(yǎng)基，其基本培養(yǎng)基與各階段培養(yǎng)基添加物含量為1)基本培養(yǎng)基MS或1/2MS，其中蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.4；
2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA3.0mg/L+IBA0.5mg/L；3)增殖培養(yǎng)基MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L；4)壯苗培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；5)生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+活性碳1g/L；斑葉蘭應(yīng)用上述組培培養(yǎng)基進(jìn)行快速組培繁殖的方法，包括如下步驟1)外植體的選取與滅菌取斑葉蘭莖尖、莖段、葉柄、葉片或根，經(jīng)滅菌處理后備用；2)誘導(dǎo)培養(yǎng)在無菌條件下將外植體切段或切片接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)30天左右直接從外植體誘導(dǎo)出初代幼芽或叢芽；3)增殖培養(yǎng)在無菌條件下將初代幼芽或叢芽接種在增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天分化出大量繼代幼芽或叢芽；4)壯苗培養(yǎng)將繼代幼芽或叢芽接種到壯苗培養(yǎng)基中，約30天后，幼苗長高、葉片長大，株高和葉面積可增加3～5倍。
5)生根培養(yǎng)將生長達(dá)2～5厘米的繼代幼芽或叢芽接種到生根培養(yǎng)基中，約20～30天后，幼苗基部長出數(shù)根根系；6)組培苗的馴化與移栽將生長達(dá)3～7厘米以上的培養(yǎng)瓶生根幼芽苗或叢芽苗，移至常溫下適應(yīng)3～5天后，打開蓋子再適應(yīng)3～5天，洗清根部培養(yǎng)基后移栽入樹皮碎塊或其它基質(zhì)中。
本發(fā)明的有益效果是1)提出的斑葉蘭組培優(yōu)化培養(yǎng)基針對性強、適用性好，由于提高了細(xì)胞分裂素濃度，芽的誘導(dǎo)率達(dá)90％以上；芽的增殖率每個培養(yǎng)周期達(dá)3～5倍，年組培苗生產(chǎn)能力可達(dá)100萬苗以上(一年為8個培養(yǎng)周期)；經(jīng)增設(shè)的壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)后成苗生長速度加快，20～30天苗高可達(dá)2～5厘米，生根率達(dá)100％；移栽成活率90％以上；2)，該方法由于提高了細(xì)胞分裂素濃度并加強前期光照量，促使從外植體快速直接誘導(dǎo)出幼芽或叢芽，達(dá)到了僅采用少量外植體材料，即能實現(xiàn)大批量擴繁斑葉蘭的目的，可有效地挽救珍稀瀕危植物；同時縮短了組培周期(約30～40天)，降低了生產(chǎn)成本25％左右，并保證了斑葉蘭組培苗的種性純度質(zhì)量。
3)斑葉蘭組培苗大量繁殖，可實行規(guī)?；a(chǎn)，推動斑葉蘭種植業(yè)大力發(fā)展，促進(jìn)以斑葉蘭原料為依托的藥品、保健食品、觀賞花卉等相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
具體實施例方式
通過以下實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實施例1(適于斑葉蘭組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基1)1)基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基、其中蔗糖為20g/L，瓊脂為9g/L，pH5.0；2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L；3)增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA5.0mg/L+IBA0.1mg/L；4)壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L；5)生根培養(yǎng)基為MS+IBA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+活性碳1g/L；實施例2(適于斑葉蘭組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基2)1)基本培養(yǎng)基選用改良MS培養(yǎng)基(1/2MS)，白糖為30g/L，瓊脂為8g/L，pH6.0；2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA5.0mg/L+IBA0.4mg/L；3)增殖培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L；
4)壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.3mg/L；5)生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.2mg/L+NAA0.3mg/L；實施例3(適于斑葉蘭組織培養(yǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基)1)基本培養(yǎng)基選用MS或1/2MS培養(yǎng)基、其中蔗糖為30g/L，瓊脂為7g/L，pH5.4；2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0mg/L+IBA0.5mg/L3)增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L；4)壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；5)生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+活性碳1g/L；實施例4(斑葉蘭組培快速繁殖方法)1)組培基本培養(yǎng)基和各階段培養(yǎng)基配方同于實施例3，在無菌環(huán)境下，培養(yǎng)條件為溫度20～28℃，光強1500～2500LuX，光照時間10～12h/d；其中誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)兩階段，改常規(guī)蘭科植物用散射光培養(yǎng)為2000LuX以上的光照進(jìn)行培養(yǎng)；2)外植體的處理與滅菌采用斑葉蘭優(yōu)良單株的莖尖、莖段、葉柄、葉片或根，用洗滌劑和自來水沖洗干凈后，經(jīng)75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液滅菌10～15min，或用2％的次氯酸鈉水溶液滅菌10～15min，然后用無菌水沖洗3～5次，再將外植體切段或切片接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；3)誘導(dǎo)培養(yǎng)經(jīng)30天左右，直接從外植體誘導(dǎo)出初代幼芽或叢芽；4)增殖培養(yǎng)將初代幼芽或叢芽接種在增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)30～45天，分化大量繼代幼芽或叢芽；
5)壯苗培養(yǎng)將繼代幼芽或叢芽接種到壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)約30天后，幼苗加速長高、葉片長大，株高和葉面積可增加3～5倍；6)生根培養(yǎng)當(dāng)繼代幼芽或叢芽生長達(dá)2～5厘米時接種到生根培養(yǎng)基中，20～30天后幼苗基部長出根系；7)組培苗馴化、移栽當(dāng)組培苗生長達(dá)3～7厘米以上，長出發(fā)達(dá)根系時，將培養(yǎng)瓶移到常溫下放置3天左右進(jìn)行馴化，再打開瓶蓋，3天后取出組培苗，洗去根部培養(yǎng)基后移栽入樹皮碎塊或其它基質(zhì)中，最初兩周適當(dāng)遮陰，注意保持基質(zhì)濕度。
本發(fā)明采用上述組培培養(yǎng)基及與之配套的快繁方法后，外殖體初代幼芽的誘導(dǎo)率達(dá)90％以上；繼代幼芽的增殖率每個培養(yǎng)周期達(dá)3～5倍；年組培苗生產(chǎn)能力可達(dá)100萬苗以上；經(jīng)壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)后成苗生長速度加快，20～30天苗高可達(dá)2～5厘米，組培苗素質(zhì)提高，生根率達(dá)100％；移栽成活率90％以上。
權(quán)利要求
1.斑葉蘭組培培養(yǎng)基，包括基本培養(yǎng)基及分別適用于不同組培階段的培養(yǎng)基組成，其特征是基本培養(yǎng)基與各階段培養(yǎng)基添加物含量為1)基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基蔗糖或白糖20～30g/L，瓊脂為7～9g/L，pH為5.0～6.0；2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA2.0～5.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L或IBA0.1～0.5mg/L；3)增殖培養(yǎng)基MS+6-BA2.0～5.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L或IBA0.1～0.5mg/L；4)壯苗培養(yǎng)基MS+6-BA0.2～2.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L或IBA0.1～0.5mg/L；5)生根培養(yǎng)基MS或1/2MS+IBA0.1～0.5mg/L和NAA0.1～0.5mg/L及活性碳1g/L中的任意一種、二種或三種的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述斑葉蘭組培培養(yǎng)基，其特征是基本培養(yǎng)基與各階段培養(yǎng)基添加物含量為1)基本培養(yǎng)基MS或1/2MS，其中蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.4；2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA3.0mg/L+IBA0.5mg/L；3)增殖培養(yǎng)基MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L；4)壯苗培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；5)生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+活性碳1g/L；
3.應(yīng)用權(quán)利要求1所述斑葉蘭組培培養(yǎng)基進(jìn)行快速繁殖的方法，其特征是包括如下步驟1)外植體的選取與滅菌取斑葉蘭莖尖、莖段、葉柄、葉片或根，經(jīng)滅菌處理后備用；2)誘導(dǎo)培養(yǎng)在無菌條件下將外植體切段或切片接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)30天左右直接從外植體誘導(dǎo)出初代幼芽或叢芽；3)增殖培養(yǎng)在無菌條件下將初代幼芽或叢芽接種在增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30～45天分化出大量繼代幼芽或叢芽；4)壯苗培養(yǎng)將繼代幼芽或叢芽接種到壯苗培養(yǎng)基上，約30天后，幼苗株高和葉面積可增加3～5倍；5)生根培養(yǎng)將生長達(dá)2～5厘米繼代幼芽或叢芽接種到生根培養(yǎng)基上，約20～30天后，幼苗基部長出數(shù)根根系；6)組培苗的馴化與移栽將生長達(dá)3～7厘米以上的培養(yǎng)瓶生根幼芽或叢芽，移至常溫下適應(yīng)3～5天后，打開蓋子再適應(yīng)3～5天，洗清根部培養(yǎng)基后移栽入樹皮碎塊或其它基質(zhì)中。
全文摘要
本發(fā)明公開了斑葉蘭組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其快速繁殖的方法。斑葉蘭屬蘭科植物，為中草藥材，也可作為花卉觀葉植物，由于其用途廣泛、藥效顯著，經(jīng)藥農(nóng)長期采掘，使之處于瀕危境地。斑葉蘭種子微小、構(gòu)造極簡單，生命力很弱，極易夭折，一般自然界靠無性繁殖，但繁殖率很低。本發(fā)明針對性強、適用效果好，芽的誘導(dǎo)率達(dá)90％以上，芽的增殖率每個培養(yǎng)周期達(dá)3～5倍，年組培苗生產(chǎn)能力可達(dá)100萬苗以上，生根率100％，移栽成活率90％以上。
文檔編號A01H4/00GK1631111SQ20041008237
公開日2005年6月29日 申請日期2004年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日
發(fā)明者徐剛, 汪一婷, 牟豪杰, 呂永平, 陳劍平, 陳炯 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院