專利名稱：誘導馬尾松未成熟種子胚性胚柄細胞團再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬林業(yè)中的種苗繁殖生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種誘導馬尾松優(yōu)樹未成熟 種子胚性胚柄細胞團(Embryonal Suspensor Mass，簡稱ESM)再生植株的方法。
背景技術(shù)：
馬尾松(Pinus massoniana)是我國南方的主要用材樹種之一，分布范圍廣、蓄積 量大。由于它的適應(yīng)性強、生長快、用途廣泛、造林更新容易、成本低，在綠化荒山、改善生態(tài) 環(huán)境方面起了很大的作用。與商品材杉木和北方紅松相比，馬尾松在彎曲強度、彎曲彈性模 量、順紋壓力、端面硬度4個指標上都超過杉木、紅松；而且其木材纖維素含量較高，木材廣 泛用于建筑、板材、家具、膠合板、造紙和木纖維工業(yè)。馬尾松木材很耐水濕，素有“水浸千 年松”之說，適于水底地下工程，大量用于礦柱和樁木；松脂的主要成份是松香和松節(jié)油，是 重要的天然化工原料，馬尾松還是我國主要的產(chǎn)脂樹種，產(chǎn)脂期長，產(chǎn)量高，單株立木胸徑 18cm以上，每年可割脂5 6kg ；馬尾松木材含纖維素62%，脫脂后是造紙和人造纖維工業(yè) 的重要原料；利用松根、彎曲木可培養(yǎng)名貴的中藥材茯苓，等等。因此，加強對馬尾松現(xiàn)有林 分的保護，研究、保護馬尾松的遺傳資源和發(fā)展馬尾松人工林資源具有的重要意義。在馬尾松森林資源的培育中，采用遺傳改良材料種植是營林成功的關(guān)鍵措施之 一。馬尾松良種繁育目前主要采用種子園育種、優(yōu)樹無性系扦插繁殖等傳統(tǒng)方法，繁殖速度 較慢，難以滿足生產(chǎn)應(yīng)用的需求。被子植物體胚的發(fā)生和植株再生的思想，源于1902年Haberlandt提出的植物細 胞具有全能性的概念，即植物體的每一個細胞都具有發(fā)育成為一個新個體的潛在能力。在 人工培養(yǎng)條件下，植物體細胞可以誘導分化形成如有性生殖合子胚那樣的胚狀結(jié)構(gòu)(胚狀 體)，進而通過覆被人工胚乳形成人工種子或直接再生形成完整的植株。由于植物每一個體 細胞從理論上都存在誘導成胚的可能性，且繁殖速度快、不受地區(qū)、季節(jié)和災(zāi)害性氣候等自 然條件的限制；對于木本植物來說，不必等待漫長的有性世代，也不必像常規(guī)的無性繁殖那 樣需要充足的萌芽插條，一旦獲得優(yōu)良的材料，就可以比常規(guī)繁殖快數(shù)十倍甚至上百倍的 速度繁殖優(yōu)良種苗。作為裸子植物的馬尾松，體胚的發(fā)生與被子植物的體細胞胚發(fā)生有著完全不同的 途徑和機理，成熟的種子以及由種子發(fā)育而來的植株，營養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约毎掷щy。 但在針葉樹種中，雌配子體受精后發(fā)育成種子的過程中有一部分珠心細胞處于未分化的階 段，在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下，可以利用裂生多胚特性，誘導體胚形成。Gupta等(1985,1995) 報道過利用這一生物學特性，誘導出花旗松(Pseudotsuga menziesii)和濕地松(Pinus elliottii)的體胚，其大致可以分為四個步驟ESM的誘導、保持和增殖、體胚的成熟、萌發(fā) 和植株再生，并證明該技術(shù)體系具有達到產(chǎn)業(yè)化的前景。目前雖有馬尾松成熟種子誘導體胚發(fā)生的報道，但誘導率極低，難以在生產(chǎn)上應(yīng) 用。中南林業(yè)科技大學曾報道馬尾松不同成熟度的幼胚離體培養(yǎng)，誘導愈傷組織和體胚發(fā) 生，但尚未獲得具體的結(jié)果。國內(nèi)外尚無利用馬尾松優(yōu)樹未成熟種子的ESM誘導體胚發(fā)生，并實現(xiàn)植株再生的成功方法報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對當前馬尾松組織培養(yǎng)器官發(fā)生困難、植株再生率低，以及用 馬尾松的成熟合子胚誘導體胚成功率極低，難以滿足生產(chǎn)應(yīng)用需要等問題，研究利用馬尾 松優(yōu)樹的ESM誘導體細胞胚的發(fā)生和植株再生的新途徑，快速生產(chǎn)大批高質(zhì)量的苗木，滿 足林業(yè)生產(chǎn)對優(yōu)質(zhì)馬尾松種苗的需求。本發(fā)明以馬尾松優(yōu)樹未成熟種子的ESM為起始材料，在經(jīng)過反復(fù)篩選的基礎(chǔ)上獲 得培養(yǎng)基上進行多步離體培養(yǎng)，長期維持未成熟種子ESM的裂生多胚發(fā)生能力，經(jīng)過胚性 愈傷誘導、維持、增殖、體胚成熟前期和成熟等階段培養(yǎng)，獲得體胚，再經(jīng)萌發(fā)培養(yǎng)實現(xiàn)植株 的再生。本發(fā)明的技術(shù)解決方案為一種誘導馬尾松優(yōu)樹的未成熟種子ESM再生植株的方法，其特征是在每年的6月 中旬采集馬尾松優(yōu)樹球果，置于4°C冷藏保存預(yù)處理一周以上后，在無菌條件下剝?nèi)∏蚬?的未成熟胚，按以下培養(yǎng)條件和先后時間順序培養(yǎng)a.ESM的起始誘導此階段基本培養(yǎng)基采用DCR培養(yǎng)基。在無菌條件下將未成熟種子胚接種至下述誘 導培養(yǎng)基中，在23°C、暗培養(yǎng)40天，誘導獲得大量ESM，培養(yǎng)基配方如下。kno3340mg/L
Ca (N03) 2 4H2056mg/L
nh4no3400mg/L
kh2po4170mg/L
CaCl2 2H2085mg/L
MgS04 7H20370mg/L
Na2-EDTA H2037. 3mg/L
FeS04 7H2027. 8mg/L
H3BO36. 2mg/L
MnS04 H2022. 3mg/L
ZnS04 7H208. 6mg/L
Na2Mo04 2H200. 25mg/L
CuS04 5H200. 25mg/L
KI0. 83mg/L
CoCl20. 025mg/L
NiCl20. 025mg/L
MyO-Inositol200mg/L
Glycine2. Omg/L
Thiamine HCI1. Omg/L
Nictinic acid0. 5mg/L
Pyridoxine HCI0. 5mg/L
2,4-D2mg/L
6-BAlmg/L
谷氨酰胺lg/L
水解酪蛋白0. 5g/L
肌醇lg/L
糖30g/L
瓊脂1. 9g/L
b. EMS的維持與增殖
此階段基本培養(yǎng)基采用DCR培養(yǎng)基。將
3/10 頁
下轉(zhuǎn)入以下配方培養(yǎng)基中，23°C暗培養(yǎng)條件下，維持培養(yǎng)20天kno3340mg/L
Ca (N03)2 4H20556mg/L
nh4no3400mg/L
kh2po4170mg/L
CaCl2 2H2085mg/L
MgS04 7H20370mg/L
Na2-EDTA H2037. 3mg/L
FeS04 7h2027. 8mg/L
H3BO36. 2mg/L
MnS04 h2o22. 3mg/L
ZnS04 7h208. 6mg/L
Na2Mo04 2h200. 25mg/L
CuS04 5h200. 25mg/L
KI0. 83mg/L
CoCl20. 025mg/L
NiCl20. 025mg/L
MyO-Inositol200mg/L
Glycine2. Omg/L
Thiamine HCI1. Omg/L
Nictinic acid0. 5mg/L
Pyridoxine HCI0. 5mg/L
2,4-d0. 6mg/L
6-BA0. 2mg/L
谷氨酰胺lg/L
水解酪蛋白0. 5g/L
肌醇lg/L
糖30g/L
瓊脂7. Og/L
將維持培養(yǎng)20天后的EMS移入以下液體培
8100r. p. m的條件下增殖培養(yǎng)7天kno3340mg/L
Ca (N03) 2 4H20556mg/L
nh4no3400mg/L
kh2po4170mg/L
CaCl2 2H2085mg/L
MgS04 7H20370mg/L
Na2-EDTA H2037. 3mg/L
FeS04 7H2027. 8mg/L
H3BO36. 2mg/L
MnS04 H2022. 3mg/L
ZnS04 7H208. 6mg/L
Na2Mo04 2H200. 25mg/L
CuS04 5H200. 25mg/L
KI0. 83mg/L
CoCl20. 025mg/L
NiCl20. 025mg/L
MyO-Inositol200mg/L
Glycine2. Omg/L
Thiamine HCI1. Omg/L
Nictinic acid0. 5mg/L
Pyridoxine HCI0. 5mg/L
2,4-D0. 6mg/L
6-BA0.2mg/L
谷氨酰胺lg/L
水解酪蛋白0. 5g/L
肌醇lg/L
糖30g/L
c.體胚的成熟前期培養(yǎng)
此階段基本培養(yǎng)基采用DCR培養(yǎng)基。將b.下配方液體培養(yǎng)基中，23°C、暗培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為80廣天
kno3909. 9mg/L
Ca (N03) 2 4H20236. 2mg/L
nh4no3603. 8mg/L
kh2po4136. lmg/L
Mg (N03) 2 6H20256.6mg/L
MgS04 7H20246. 5mg/L
MgCl2 6H2050. Omg/L
100r. p. m的條件下，成熟前期培養(yǎng)7
Na2_EDTA H209. 33mg/LFeS04 7H206. 95mg/LH3BO315. 5mg/LMnS04 H2010. 5mg/LZnS04 7H2014. 4mg/LNa2Mo04 2H200. 125mg/LCuS04 5H200. 125mg/LKI4. 15mg/LCoCl20. 125mg/LMyO-InositollOOOmg/LGlycine2. Omg/LThiamine HCI1. Omg/LNictinic acid0. 5mg/LPyridoxine HCI0. 5mg/LABA5mg/Ld.體胚的成熟培養(yǎng)此階段基本培養(yǎng)基采用改良P6培養(yǎng)基。將c.中經(jīng)成熟前期培養(yǎng)的材料轉(zhuǎn)移到以 下培養(yǎng)基中，在23°C的溫度下暗培養(yǎng)40天kno3909. 9mg/L
Ca (N03) 2 4H20236. 2mg/L
nh4no3603. 8mg/L
kh2po4136. lmg/L
Mg(N03)2 6H20256.6mg/L
MgS04 7H20246. 5mg/L
MgCl2 6H2050. Omg/L
Na2-EDTA H209. 33mg/L
FeS04 7H206. 95mg/L
H3BO315. 5mg/L
MnS04 H2010. 5mg/L
ZnS04 7H2014. 4mg/L
Na2Mo04 2H200. 125mg/L
CuS04 5H200. 125mg/L
KI4. 15mg/L
CoCl20. 125mg/L
MyO-InositollOOOmg/L
Glycine2. Omg/L
Thiamine HCI1. Omg/L
Nictinic acid0. 5mg/L
Pyridoxine HCI0. 5mg/L
活性炭PEG8000糖谷氨酰胺瓊脂ABAGA3
2mg/L
lmg/L
lg/L
130g/L
25g/L
lg/L
7g/L經(jīng)過上述培養(yǎng)階段，體胚完成形態(tài)成熟和生理成熟，具備胚根、胚軸和子葉，形成 結(jié)構(gòu)完整的體胚。當具子葉的體胚生長發(fā)育到約2mm左右長度時，采用改良P6基本培養(yǎng)基 進行培養(yǎng)萌發(fā)，即可實現(xiàn)植株的再生和培育成苗。
四

圖1為誘導初始階段的胚性胚柄細胞團顯微照片；圖2為誘導初始階段的非胚性胚柄細胞團顯微照片；圖3為維持和增殖培養(yǎng)初始階段的ESM顯微照片；圖4為維持和增殖培養(yǎng)早期的ESM顯微照片；圖5為維持和增殖培養(yǎng)后期的ESM顯微照片；圖6為成熟前期培養(yǎng)的早期體性胚顯微照片；圖7為成熟過程中的體胚；圖8為發(fā)育至子葉期的體胚；圖9子葉胚萌發(fā)
五具體實施例方式供試材料為馬尾松優(yōu)樹的未成熟胚，分別采自廣西南寧和福建南平兩地的馬尾松 無性系嫁接種子園，重復(fù)3個年度。球果采集時間為每年的5月底至9月底，每10天采集 一次。各個采種時間點相對應(yīng)的種子發(fā)育階段分別為幼胚至成熟胚發(fā)育階段進程。球果采 集后，現(xiàn)場置預(yù)凍好的冰盒中，濕潤紗布包裹防止失水；隨后速運回實驗室置于4°C冰箱冷 藏保存?zhèn)溆谩?°C冰箱預(yù)處理至少一周，有利于ESM的高效誘導。接種前，將備用球果從冰 箱取出，用含洗滌劑的洗液浸泡清洗，然后流水沖洗2小時。在無菌環(huán)境中用解剖刀將球果 中帶種翅、發(fā)育良好的未成熟種子取出，去除種翅。用解剖刀和鑷子剝?nèi)シN皮，置75%酒精 中速泡30秒，無菌水沖洗3遍，再用稀釋10倍的84消毒液消毒5分鐘，無菌水沖洗3遍， 置于無菌濾紙上吸干，隨后接種于誘導培養(yǎng)基。a.胚性胚柄細胞團誘導培養(yǎng)本發(fā)明的誘導培養(yǎng)基以DCR為基本培養(yǎng)基，附加2，4-D 2mg/L，6_BA lmg/L，谷氨 酰胺lg/L，水解酪蛋白0. 5g/L，肌醇lg/L，糖30g/L，瓊脂7g/L。其中，附加較高濃度的2， 4-D目的在于提高胚性胚柄細胞團的誘導率。未成熟胚接種至上述誘導培養(yǎng)基中，20天左右可見經(jīng)誘導的ESM呈半透明狀粘稠 的物質(zhì)從胚珠孔增殖而出后在培養(yǎng)基上擴展(附圖1)。只有這種呈現(xiàn)半透明，粘稠的絲狀 ESM，才能在適合的培養(yǎng)基下不斷增殖。少數(shù)呈淡黃色致密質(zhì)地且表面偏硬的ESM團，在隨
11后的繼代培養(yǎng)過程中均無法正常增殖(附圖2)。在ESM的誘導中，誘導頻率與未成熟種子胚的采集時間有較大的關(guān)聯(lián)。實驗表明， 用在6月10日 6月20日之間所采集的馬尾松未成熟種子胚為起始材料，才能順利誘導 ESM增殖。從顯微鏡下可以觀察到ESM是由一系列胚頭和胚柄結(jié)構(gòu)物質(zhì)組成。胚頭部分比較 小，具有細胞質(zhì)，連接著長的高度液泡化的透明或者半透明胚柄。整個胚由半透明的松散胚 柄束和輪廓不規(guī)則的胚性頂端構(gòu)成。一系列胚性胚柄細胞就構(gòu)成了胚性胚柄細胞團(附圖 3)。在誘導培養(yǎng)基上誘導增殖的ESM培養(yǎng)物在達到大約4mm直徑時，轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng) 基上。誘導出ESM的未成熟種子胚轉(zhuǎn)移到新鮮的誘導培養(yǎng)基上，可以繼續(xù)誘導增殖更多的 ESM。誘導ESM增殖的時間周期約為四十天，23°C、暗培養(yǎng)。在誘導培養(yǎng)基上誘導EMS的培養(yǎng)時間十分關(guān)鍵。如果誘導培養(yǎng)時間過久，誘導出 的EMS因為培養(yǎng)基中的能源耗盡而萎縮，半透明狀粘稠的EMS轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)地較硬的團狀不透 明的黃色或者淡黃色培養(yǎng)物，進而失去生長活力。DCR(Gupta and Durzan medium)基本培養(yǎng)基的構(gòu)成和標準配方如下
大量元素
kno3340mg/L
Ca (N03) 2 4H20556mg/L
nh4no3400mg/L
kh2po4170mg/L
CaCl2 2H2085mg/L
MgS04 7H20370mg/L
鐵鹽
Na2-EDTA H2037. 3mg/L
FeS04 7H2027. 8mg/L
微量元素
H3BO36. 2mg/L
MnS04 H2022. 3mg/L
ZnS04 7H208. 6mg/L
Na2Mo04 2H200. 25mg/L
CuS04 5H200. 25mg/L
KI0. 83mg/L
CoCl20. 025mg/L
NiCl20. 025mg/L
有機物質(zhì)
MyO-Inositol200mg/L
Glycine2. Omg/L
Thiamine HCI1. Omg/L
Nictinic acid0. 5mg/L
pyridoxine ‘ hci0. 5mg/lb. ems的維持與增殖培養(yǎng)ems的保持和增殖培養(yǎng)基，組成成分與誘導ems的基本培養(yǎng)基相同，但將激素濃度 降低。馬尾松esm維持與增殖培養(yǎng)以dcr為基本培養(yǎng)基，附加2，4-D 0.6mg/l，6_ba 0. 2mg/l,谷氨酰胺lg/l，水解酪蛋白0. 5g/l，肌醇lg/l，糖30g/l,瓊脂7g/l的固體培養(yǎng) 基，維持培養(yǎng)20天，23°c、暗培養(yǎng)；然后使用dcr為基本培養(yǎng)基組成成分的液體培養(yǎng)基，進行esm的增殖。培養(yǎng)基的配 方和固體增殖培養(yǎng)基的配方相同，僅除去凝固劑瓊脂。培養(yǎng)細胞的初始密度為1.20% (v/ v)，搖床轉(zhuǎn)速為80 100r. p. m，23°c、暗培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)的時間控制為7天左右。維持與增殖階段，固體培養(yǎng)主要目的是維持愈傷的胚性和擴大培養(yǎng)物基數(shù)；液體 培養(yǎng)的目的是提高esm的增殖速度。在液體培養(yǎng)階段，要嚴格將搖床轉(zhuǎn)速和增殖培養(yǎng)時間 控制在規(guī)定范圍之內(nèi)。在液體培養(yǎng)條件下，經(jīng)過更換培養(yǎng)液2到3次的繼代培養(yǎng)，胚頭大多呈球形，結(jié)構(gòu) 致密，發(fā)育完整，細胞質(zhì)更濃密，胚柄呈現(xiàn)有規(guī)律的排列(附圖5)。c.體胚的成熟前期培養(yǎng)體胚的成熟前期培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，是終止esm的繼續(xù)裂生和調(diào)節(jié)胚性培養(yǎng)材 料發(fā)育的同步化。經(jīng)過增殖培養(yǎng)以后，esm的發(fā)育處于不同步狀態(tài)。大部分裂生多胚發(fā)育 較快，進入子葉胚前期階段，而仍有一部分esm尚且停留在原胚階段。體胚發(fā)育的同步性， 是后期培養(yǎng)過程中誘導體胚正常發(fā)育的關(guān)鍵。體胚的同步化培養(yǎng)過程中，以P6改良液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，去除所有附加的 激素，添加aba (脫落酸)5mg/l,終止esm繼續(xù)裂生，轉(zhuǎn)向體胚的成熟發(fā)育進程。搖床轉(zhuǎn)速仍 然控制在100r. p. m左右，，23 °c、暗培養(yǎng)7天左右。aba在促進針葉樹體胚的同步化調(diào)控中具有關(guān)鍵作用，可明顯促進體胚的成熟，抑 制早熟體胚的發(fā)育進程，降低不正常胚的發(fā)生頻率。aba同時也有利于促進體胚中儲藏物 質(zhì)的積累。經(jīng)過aba處理后，通過顯微觀察，可以發(fā)現(xiàn)胚頭胚柄都得到了很好的發(fā)育(附圖 6)，胚頭由于儲藏物質(zhì)的積累而更加致密光滑，胚柄更長，并且同步化有了很好的改進。改良P6培養(yǎng)基的構(gòu)成和配方如下
大量元素
kno3909. 9mg/l
ca (n03)2 4h20236. 2mg/l
nh4no3603. 8mg/l
kh2po4136.lmg/l
mg(n03)2 6h20256. 6mg/l
mgs04 7h20246. 5mg/l
mgcl2 6h2050.omg/l
鐵鹽
na2-edta h209.33mg/l
fes04 7h206.95mg/l
13
微量元素
H3B0315. 5mg/L
MnS04 H2010. 5mg/L
ZnS04 7H2014. 4mg/L
Na2Mo04 2H200. 125mg/L
CuS04 5H200. 125mg/L
KI4. 15mg/L
CoCl20. 125mg/L
有機物質(zhì)
MyO-InositollOOOmg/L
Glycine2. Omg/L
Thiamine HCI1. Omg/L
Nictinic acid0. 5mg/L
Pyridoxine HCI0. 5mg/L
d.體胚的成熟培養(yǎng)
體胚的成熟過程與諸多因素有關(guān)
首先，與其早期體胚的發(fā)育狀況有關(guān)。早期體胚的生長狀態(tài)可以通過顯微觀察判斷。胚頭細胞結(jié)構(gòu)致密，體積變大，同時胚柄細胞變的修長緊密，與合子胚發(fā)育過程中的子
葉胚前期類似(附圖5)，這種狀態(tài)的體胚，在后期培養(yǎng)中發(fā)育為正常體胚的成功率比較高。 也有少數(shù)體胚在預(yù)成熟完成后，胚頭沒有變大變光滑，胚柄變短變畸形甚至于消失，這種狀 態(tài)在后期培養(yǎng)中無法發(fā)育形成體胚，或者只能形成畸形的體胚，停留在柱狀胚不再繼續(xù)發(fā) 育生長。其次，體胚的成熟過程還與培養(yǎng)基和培養(yǎng)微環(huán)境有關(guān)。本實施例中體胚的成熟培養(yǎng)，采用P6改良基本培養(yǎng)基，附加2mg/L ABA和3mg/L 赤霉素GA3，活性炭lg/L，瓊脂7g/L。為了調(diào)節(jié)滲透壓，添加PEG (聚乙二醇)8000 130g/L, 另外加入試劑級純度的糖25g/L，谷氨酰胺lg/L。在這個階段，滲透壓的調(diào)節(jié)作用非常明顯。蔗糖，鹽，聚乙二醇(PEG)，甘露醇等都 可以作為調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)。但是他們調(diào)節(jié)滲透壓的機制不同。細胞對糖、鹽類、甘露醇等 物質(zhì)具有主動運輸能力。糖、鹽類、甘露醇等透過細胞膜和細胞壁進入細胞內(nèi)，來改變細胞 的滲透壓。PEG作為一種高分子滲壓劑，它本身不能滲入活細胞，而是通過水分脅迫的方式 調(diào)節(jié)細胞的滲透壓，降低體胚內(nèi)的水分。PEG與糖具有協(xié)同作用，兩者可以通過調(diào)整細胞膜 的滲透性和物理狀態(tài)共同影響體胚的發(fā)育。相比較而言，PEG與糖組合使用，更有利于體胚 的發(fā)育。培養(yǎng)基中加入一定濃度的活性炭，對體細胞胚的分化和發(fā)育有一定的促進作用。 單獨使用ABA并不能抑制早熟子葉胚的發(fā)育，只有在含有ABA的培養(yǎng)基中加入活性炭，才能 抑制早熟子葉胚的繼續(xù)發(fā)育，改善子葉胚頂端分生組織的發(fā)育，使其形態(tài)和生理的發(fā)育上 更加接近合子胚。體胚的成熟培養(yǎng)時間控制為40天(23°C、暗培養(yǎng))。經(jīng)過一個多月的培養(yǎng)，體胚完成形態(tài)成熟和生理成熟，形成具備胚根、胚軸和子葉的完整胚結(jié)構(gòu)。在合適的培養(yǎng)條件下，此階段的胚具有萌發(fā)能力并最終產(chǎn)生完整植株的形 態(tài)發(fā)生能力。子葉胚生長到大概2mm左右長度時，采用常規(guī)的方法培養(yǎng)萌發(fā)，實現(xiàn)植株的再生 和培育成苗。有益效果本發(fā)明的優(yōu)勢在于繁殖系數(shù)高、繁殖不受季節(jié)的限制，為馬尾松遺傳改良材料的 快速繁殖提供了一種高效途徑，不僅有利于馬尾松遺傳資源的保存，而且對于加速馬尾松 優(yōu)良材料的發(fā)育，提供大量的經(jīng)遺傳改良的種植材料，緩解社會對馬尾松遺傳改良苗木的 緊迫需求，提供了一種周期短，效率高，成本低的苗木生產(chǎn)技術(shù)。
權(quán)利要求
一種誘導馬尾松未成熟種子胚性胚柄細胞團再生植株的方法，其特征是在每年的6月中旬采集馬尾松優(yōu)樹球果，置于4℃冷藏保存預(yù)處理一周以上后，在無菌條件下剝?nèi)∏蚬械奈闯墒炫?，按以下培養(yǎng)條件和先后時間順序培養(yǎng)a.ESM的起始誘導在無菌條件下將未成熟種子胚接種至下述誘導培養(yǎng)基中，在23℃的溫度下暗培養(yǎng)40天，誘導獲得大量ESM，培養(yǎng)基配方如下KNO3 340mg/LCa(NO3)2·4H2O 56mg/LNH4NO3 400mg/LKH2PO4 170mg/LCaCl2·2H2O 85mg/LMgSO4·7H2O 370mg/LNa2-EDTA·H2O37.3mg/LFeSO4·7H2O 27.8mg/LH3BO36.2mg/LMnSO4·H2O 22.3mg/LZnSO4·7H2O 8.6mg/LNa2MoO4·2H2O0.25mg/LCuSO4·5H2O 0.25mg/LKI 0.83mg/LCoCl20.025mg/LNiCl20.025mg/LMyO-Inositol 200mg/LGlycine 2.0mg/LThiamine·HCI1.0mg/LNictinic·acid 0.5mg/LPyridoxine·HCI 0.5mg/L2，4-D 2mg/L6-BA 1mg/L谷氨酰胺 1g/L水解酪蛋白 0.5g/L肌醇 1g/L糖 30g/L瓊脂 1.9g/Lb.EMS的維持與增殖將a.中所誘導培養(yǎng)所得的EMS在無菌條件下轉(zhuǎn)入以下配方培養(yǎng)基中，在23℃、暗培養(yǎng)條件下，維持培養(yǎng)20天KNO3 340mg/LCa(NO3)2·4H2O556mg/LNH4NO3400mg/LKH2PO4170mg/LCaCl2·2H2O 85mg/LMgSO4·7H2O 370mg/LNa2-EDTA·H2O37.3mg/LFeSO4·7H2O 27.8mg/LH3BO36.2mg/LMnSO4·H2O 22.3mg/LZnSO4·7H2O 8.6mg/LNa2MoO4·2H2O0.25mg/LCuSO4·5H2O 0.25mg/LKI 0.83mg/LCoCl20.025mg/LNiCl20.025mg/LMyO-Inositol 200mg/LGlycine 2.0mg/LThiamine·HCI1.0mg/LNictinic·acid 0.5mg/LPyridoxine·HCI 0.5mg/L2，4-D 0.6mg/L6-BA 0.2mg/L谷氨酰胺 1g/L水解酪蛋白 0.5g/L肌醇 1g/L糖 30g/L瓊脂 7.0g/L將維持培養(yǎng)20天后的EMS移入以下液體培養(yǎng)基中，在23℃、暗培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為80～100r.p.m的條件下增殖培養(yǎng)7天KNO3 340mg/LCa(NO3)2·4H2O556mg/LNH4NO3400mg/LKH2PO4170mg/LCaCl2·2H2O 85mg/LMgSO4·7H2O 370mg/LNa2-EDTA·H2O 37.3mg/LFeSO4·7H2O 27.8mg/LH3BO3 6.2mg/LMnSO4·H2O22.3mg/LZnSO4·7H2O 8.6mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25mg/LCuSO4·5H2O 0.25mg/LKI0.83mg/LCoCl2 0.025mg/LNiCl2 0.025mg/LMyO-Inositol 200mg/LGlycine 2.0mg/LThiamine·HCI 1.0mg/LNictinic·acid0.5mg/LPyridoxine·HCI 0.5mg/L2，4-D0.6mg/L6-BA 0.2mg/L谷氨酰胺 1g/L水解酪蛋白0.5g/L肌醇 1g/L糖30g/Lc.體胚的成熟前期培養(yǎng)將b.中所增殖培養(yǎng)完成后的EMS轉(zhuǎn)移到以下配方液體培養(yǎng)基中，在23℃、暗培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為80～100r.p.m的條件下，成熟前期培養(yǎng)7天KNO3 909.9mg/LCa(NO3)2·4H2O 236.2mg/LNH4NO3 603.8mg/LKH2PO4 136.1mg/LMg(NO3)2·6H2O 256.6mg/LMgSO4·7H2O246.5mg/LMgCl2·6H2O50.0mg/LNa2-EDTA·H2O 9.33mg/LFeSO4·7H2O6.95mg/LH3BO3 15.5mg/LMnSO4·H2O 10.5mg/LZnSO4·7H2O14.4mg/LNa2MoO4·2H2O 0.125mg/LCuSO4·5H2O0.125mg/LKI 4.15mg/LCoCl2 0.125mg/LMyO-Inositol 1000mg/LGlycine2.0mg/LThiamine·HCI 1.0mg/LNictinic·acid 0.5mg/LPyridoxine·HCI0.5mg/LABA5mg/Ld.體胚的成熟培養(yǎng)將c.中經(jīng)成熟前期培養(yǎng)的材料轉(zhuǎn)移到以下培養(yǎng)基中，在23℃的溫度下暗培養(yǎng)40天KNO3 909.9mg/LCa(NO3)2·4H2O 236.2mg/LNH4NO3 603.8mg/LKH2PO4 136.1mg/LMg(NO3)2·6H2O 256.6mg/LMgSO4·7H2O246.5mg/LMgCl2·6H2O50.0mg/LNa2-EDTA·H2O 9.33mg/LFeSO4·7H2O6.95mg/LH3BO3 15.5mg/LMnSO4·H2O 10.5mg/LZnSO4·7H2O14.4mg/LNa2MoO4·2H2O 0.125mg/LCuSO4·5H2O0.125mg/LKI 4.15mg/LCoCl2 0.125mg/LMyO-Inositol 1000mg/LGlycine2.0mg/LThiamine·HCI 1.0mg/LNictinic·acid 0.5mg/LPyridoxine·HCI0.5mg/LABA2mg/LGA3 1mg/L活性炭1g/LPEG8000 130g/L糖25g/L谷氨酰胺 1g/L瓊脂 7g/L當具子葉的體胚生長發(fā)育到約2mm左右長度時，采用改良P6基本培養(yǎng)基進行培養(yǎng)萌發(fā)，即可實現(xiàn)植株的再生和培育成苗。
全文摘要
一種誘導馬尾松未成熟種子ESM再生植株的方法，利用馬尾松未成熟種子ESM所具有的持續(xù)裂生能力特征，通過固體和液體培養(yǎng)的交替培養(yǎng)，經(jīng)過維持、增殖、體胚成熟前期、成熟培養(yǎng)四個階段，使ESM形成發(fā)育完整、結(jié)構(gòu)正常的體胚，經(jīng)萌發(fā)培養(yǎng)獲得馬尾松植株。采用本發(fā)明所提供的方法，可以獲得大量遺傳基礎(chǔ)一致的馬尾松體胚的再生植株，為馬尾松珍稀遺傳資源的保存、優(yōu)良基因型苗木的大量生產(chǎn)，提供了一種周期短、發(fā)生效率高的新技術(shù)。
文檔編號A01H4/00GK101849505SQ20101010975
公開日2010年10月6日 申請日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者席夢利, 施季森, 邊黎明, 鄭仁華, 陳金慧, 高燕, 黃壽先 申請人:南京林業(yè)大學