本發(fā)明屬于植物繁殖技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種適用于油桐組培快繁方法。
背景技術(shù)：
油桐（Vernicia fordii (Hemsl.) Airy Shaw），大戟科油桐屬，屬落葉喬木，樹皮灰色，枝條粗壯，葉卵圓形，花雌雄同株，花萼外面密被棕褐色微柔毛；花瓣白色，有淡紅色脈紋，倒卵形，子房密被柔毛，核果近球狀，種皮木質(zhì)?；ü?-9月。分布于中國(guó)的陜西、河南、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、臺(tái)灣、湖南、湖北、廣東、海南、廣西、四川、貴州、云南等省區(qū)。油桐與油茶、核桃、烏桕并稱中國(guó)四大木本油料植物。油桐生于1000米以上的地區(qū)，喜溫暖 ，忌嚴(yán)寒 。冬季氣溫落差18℃有利于油桐生長(zhǎng)發(fā)育 ，但長(zhǎng)期處在－10℃以下會(huì)引起凍害。適生于緩坡及向陽(yáng)谷地，盆地及河床兩岸臺(tái)地。富含腐殖質(zhì)、土層深厚、排水良好、中性至微酸性沙質(zhì)壤土最適油桐生長(zhǎng)。組織培養(yǎng)能通過(guò)無(wú)性繁殖，遺傳樹種的優(yōu)良特性，能在短時(shí)間內(nèi)快速繁殖獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)的組培苗，為優(yōu)質(zhì)種源推廣提供可能。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)油桐組織培養(yǎng)過(guò)程中芽增殖系數(shù)低，生長(zhǎng)緩慢等問(wèn)題,提供一種生長(zhǎng)效果好、擴(kuò)繁快的油桐嫩枝組培繁殖方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種適用于油桐的組培快繁方法，包括外植體選擇、外植體處理、初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯芽培養(yǎng)和生根培養(yǎng)工序，采集半木質(zhì)化、生長(zhǎng)健壯的當(dāng)年生油桐嫩枝作為外植體，對(duì)外植體進(jìn)行修剪、滅菌消毒處理后接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中獲取初始芽，再將初始芽接種于增殖培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)3-4個(gè)周期增殖培養(yǎng)，形成叢生芽，將叢生芽接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，具體操作步驟如下：
（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長(zhǎng)健壯的當(dāng)年生油桐嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來(lái)水下沖洗10-15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時(shí)間15-20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個(gè)腋芽，1.5-3cm長(zhǎng)的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；
（3）初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長(zhǎng)；
（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)3-4個(gè)周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；
（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進(jìn)行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；
（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)步驟（5），循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽。
以上所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+6-BA 4.0-6.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+TDZ 1.0-2.0 mg/L+ZT 1.5-2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L。
以上所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良1/2MS培養(yǎng)基+6-BA 6.0-8.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+ZT 0.5-1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L。
以上所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良MS培養(yǎng)基+6-BA 3.0-4.0 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L。
以上所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+6-BA 1.5-2.5 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。
以上所述的改良MS培養(yǎng)基的配方為：KNO3 660 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 275 mg·L-1；MgSO4·7H2O 280 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 105 mg·L-1。
以上步驟（3）所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的培育控制條件為：光培養(yǎng)、光照500-1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃；步驟（4）所述的增殖培養(yǎng)、步驟（5）所述的壯芽培養(yǎng)、步驟（6）所述的生根培養(yǎng)的培育控制條件均為：光培養(yǎng)，光照2500-4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃。
相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下：
1、本發(fā)明以油桐當(dāng)年生嫩枝作為外植體，經(jīng)過(guò)初始芽培養(yǎng)基培養(yǎng)，初始芽萌動(dòng)率90%以上；經(jīng)過(guò)3-4個(gè)周期增殖培養(yǎng)，形成叢生芽，芽增殖系數(shù)5/30d-7/30d，再將叢生芽接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，從而縮短了油桐的育苗周期，節(jié)省育苗材料，克服了傳統(tǒng)育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期長(zhǎng)等問(wèn)題，大大降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。
2、本發(fā)明將高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，余下小芽叢繼續(xù)增殖培養(yǎng)，使得材料能夠多次繼代，實(shí)現(xiàn)大量增殖，規(guī)?；a(chǎn)壯芽，實(shí)現(xiàn)黃樟油素型樟樹的擴(kuò)繁。
3、本發(fā)明對(duì)MS基本培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，同時(shí)重點(diǎn)調(diào)整了與油桐出芽壯芽相關(guān)元素，使得培養(yǎng)基更科學(xué)，更有針對(duì)性，更易促使油桐芽誘導(dǎo)的發(fā)生、增殖和壯芽，效果顯著。
4、本發(fā)明操作過(guò)程簡(jiǎn)便，培養(yǎng)周期短，繼代芽產(chǎn)量大,并且質(zhì)量?jī)?yōu)，增殖系數(shù)達(dá)到5以上的組培苗產(chǎn)業(yè)化技術(shù)要求，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會(huì)效益。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1：
（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長(zhǎng)健壯的當(dāng)年生油桐嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來(lái)水下沖洗10 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時(shí)間15 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個(gè)腋芽，1.5-3cm長(zhǎng)的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；
（3）初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照500 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長(zhǎng)；所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+6-BA 4.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+TDZ 1.0 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L；
（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)3-4個(gè)周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+6-BA 6.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L；
（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進(jìn)行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良MS培養(yǎng)基+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L；
（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)步驟（5），循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照2500 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導(dǎo)生根，生根率為89%；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。
以上所述的改良MS培養(yǎng)基的配方為：KNO3 660 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 275 mg·L-1；MgSO4·7H2O 280 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 105 mg·L-1。
實(shí)施例2：
（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長(zhǎng)健壯的當(dāng)年生油桐嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來(lái)水下沖洗15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時(shí)間20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個(gè)腋芽，1.5-3cm長(zhǎng)的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；
（3）初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長(zhǎng)；所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+6-BA 5.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+TDZ 1.5 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L；
（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)3-4個(gè)周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+6-BA 7.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L；
（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進(jìn)行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良MS培養(yǎng)基+6-BA 3.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L；
（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)步驟（5），循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照3000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導(dǎo)生根，生根率為92%；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。
以上所述的改良MS培養(yǎng)基的配方為：KNO3 660 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 275 mg·L-1；MgSO4·7H2O 280 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 105 mg·L-1。
實(shí)施例3：
（1）外植體選擇：采集半木質(zhì)化、生長(zhǎng)健壯的當(dāng)年生油桐嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：將外植體置于自來(lái)水下沖洗15 min，然后去除外植體葉片，再將外植體浸泡在體積濃度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡時(shí)間20 min，最后用純凈水洗凈藥物，將外植體裁成帶至少1個(gè)腋芽，1.5-3cm長(zhǎng)的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)，備用；
（3）初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（2）得到的外植體接種于初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)、光照1000 lx，培養(yǎng)溫度20±1℃的環(huán)境中培養(yǎng)30-35 d，初始芽萌發(fā)、生長(zhǎng)；所述的初始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+6-BA 6.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L+ZT 2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+葉酸10mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂3.0 g/L+卡拉膠25 g/L；
（4）增殖培養(yǎng)：將高≥1cm的初始芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中，35-40 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)3-4個(gè)周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+6-BA 8.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.6 g/L+卡拉膠 30 g/L；
（5）壯芽培養(yǎng)：將步驟（4）得到的叢生芽進(jìn)行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中培養(yǎng)35-40 d，形成壯芽；所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良MS培養(yǎng)基+6-BA 4.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+天冬氨酸 20 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 25 g/L；
（6）生根培養(yǎng)：將步驟（5）得到的高≥2cm的單芽插入生根培養(yǎng)基中，余下小芽叢再次接種于步驟（4）的增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)步驟（5），循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽；生根培養(yǎng)是置于光培養(yǎng)，光照4000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度25-28℃的環(huán)境中誘導(dǎo)生根，生根率為93%；；所述的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2改良MS培養(yǎng)基+6-BA 2.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+瓊脂 3.5 g/L+卡拉膠 30 g/L。
以上所述的改良MS培養(yǎng)基的配方為：KNO3 660 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 275 mg·L-1；MgSO4·7H2O 280 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；維生素B1 1.0 mg·L-1；維生素B6 0.5 mg·L-1；煙酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 105 mg·L-1。