本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海風(fēng)藤離體快速繁殖方法。

背景技術(shù)：

海風(fēng)藤別名滿坑香、老藤、大風(fēng)藤、巖胡椒，為雙子葉植物藥胡椒科植物細(xì)葉青蔞藤的藤莖，性味歸經(jīng)為辛、苦，微溫。海風(fēng)藤始載于《開寶本草》，又名風(fēng)藤，具有祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)，理氣，治風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、筋脈拘攣、跌打損傷、哮喘、久咳等功效。

海風(fēng)藤是我國常用大宗中藥材，還是沙縣小吃傳統(tǒng)藥膳調(diào)味秘方的重要成分。據(jù)統(tǒng)計(jì)，分布全國各地的沙縣小吃店對海風(fēng)藤干品每年消耗量在100噸以上。然而，隨著小吃業(yè)快速發(fā)展，對海風(fēng)藤的需求量越來越大，其價(jià)格也水漲船高。野生海風(fēng)藤資源經(jīng)頻繁采挖，日漸稀少，已遠(yuǎn)不能滿足市場需要，人工栽培是解決其問題的主要途徑，而大規(guī)模優(yōu)質(zhì)種苗成為人工栽培的瓶頸。因此建立和完善海風(fēng)藤繁育體系，是保護(hù)和持續(xù)利用野生種質(zhì)資源的主要措施之一。目前，國內(nèi)外對海風(fēng)藤人工繁殖的研究較少。

三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院對海風(fēng)藤試管苗的快速繁殖方法進(jìn)行研究，通過組織培養(yǎng)，可使原先主要依賴野生采摘和扦插繁殖的海風(fēng)藤種苗產(chǎn)量大幅提升。該方法可提高海風(fēng)藤增殖系數(shù)和瓶苗質(zhì)量，是一種試管苗高效快繁方法，可滿足海風(fēng)藤的規(guī)?；N植要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是一種繁殖率高、試管苗品質(zhì)優(yōu)良，能大規(guī)模繁育海風(fēng)藤種苗的海風(fēng)藤離體快速繁殖方法，應(yīng)用該方法能滿足海風(fēng)藤人工栽培的規(guī)?；N植需求，以解決野生海風(fēng)藤資源日漸稀少而市場上供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種海風(fēng)藤離體快速繁殖方法，具體步驟如下：

①外植體的預(yù)處理、選取和消毒

選擇長勢旺盛的健康海風(fēng)藤，噴施30％代森錳鋅懸浮液800倍液，每周噴施一次，連續(xù)3次；然后剪取海風(fēng)藤新長出的前5節(jié)藤莖，將其藤莖剪成3～5cm的帶芽莖，用洗潔精水溶液清洗干凈，晾干備用；在超凈工作臺(tái)上用72％乙醇溶液浸泡30～35秒，再用無菌水沖洗2～3次，用無菌濾紙吸干；再用0.1％升汞溶液消毒，前2節(jié)嫩莖消毒7～9min，后3節(jié)藤莖消毒10～12min，再用無菌水清洗3～4遍，然后用無菌濾紙吸干后備用；

②海風(fēng)藤腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

將步驟①處理后的外植體轉(zhuǎn)接到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)30～40天，誘導(dǎo)出高為3～5cm的腋芽；所述腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2MS+5.5g/L瓊脂+20g/L白糖，PH值為5.8；

③海風(fēng)藤不定芽的增殖培養(yǎng)

將步驟②誘導(dǎo)培養(yǎng)后的腋芽轉(zhuǎn)接到不定芽增殖培養(yǎng)基上，進(jìn)行增殖培養(yǎng)30～40天，再將腋芽分切成一節(jié)節(jié)帶芽部分并將其轉(zhuǎn)接到不定芽增殖培養(yǎng)基上，如此循環(huán)操作，可獲得大量海風(fēng)藤不定芽；所述不定芽增殖培養(yǎng)基的配方為：MS+0.2mg/L 6-BA+5.5g/L瓊脂+30g/L白糖，PH值為5.8；

④海風(fēng)藤不定芽的增殖壯苗培養(yǎng)

將步驟③增殖培養(yǎng)后的不定芽轉(zhuǎn)接到增殖壯苗培養(yǎng)基上，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)30～40天，使植株長高長壯并產(chǎn)生若干叢生苗；所述增殖壯苗培養(yǎng)基的配方為：MS+0.2mg/L 6-BA+1.0mg/L KT+10mg/L多效唑+5.5g/L瓊脂+30g/L白糖，PH值為5.8；

⑤海風(fēng)藤不定芽的生根培養(yǎng)

將經(jīng)步驟④壯苗培養(yǎng)后的叢生苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)30～40天，使幼苗基部長出3條以上根系，即可進(jìn)行海風(fēng)藤組培苗的馴化和移栽；所述生根培養(yǎng)基的配方為：MS+0.3mg/L KT+5.5g/L瓊脂+30g/L白糖+0.2％活性炭，PH值為5.8。

所述步驟②、③、④、⑤中的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25±2℃，散光光照時(shí)間為12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為2000lx。

步驟①中所述剪取海風(fēng)藤新長出的前5節(jié)藤莖為可常年剪取。所述30％代森錳鋅懸浮液、72％乙醇溶液、0.1％升汞溶液均為質(zhì)量百分含量。

所述MS即MS培養(yǎng)基。

所述1/2MS即1/2MS培養(yǎng)基，是指將MS配方中大量元素減半，其它不變而配置的培養(yǎng)基。

所述6-BA即6-芐氨基腺嘌呤，所述KT即激動(dòng)素。

本發(fā)明的有益效果是:1、本發(fā)明通過采用離體快速繁殖，增殖系數(shù)和種苗質(zhì)量高，可用于大規(guī)模繁育海風(fēng)藤優(yōu)質(zhì)種苗，能滿足海風(fēng)藤的規(guī)?；a(chǎn)要求和市場需要，且有利于保護(hù)野生海風(fēng)藤資源和生態(tài)環(huán)境；2、本發(fā)明通過采用科學(xué)配方的腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、不定芽增殖培養(yǎng)基、壯苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，不定芽體的增殖率每個(gè)培養(yǎng)周期可達(dá)3.5倍以上，生根率達(dá)100％，種苗健壯；3、本發(fā)明通過采用對海風(fēng)藤外植體進(jìn)行噴施30％代森錳鋅懸浮液800倍液的預(yù)處理，在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段采用散光培養(yǎng)，有效地降低誘導(dǎo)的消毒污染率，消毒成功率可達(dá)80％以上；4、本發(fā)明通過采用在不定芽增殖壯苗培養(yǎng)基中添加多效唑，有效的誘導(dǎo)出健壯的叢生苗，大大的提升海風(fēng)藤試管苗的品質(zhì)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

一種海風(fēng)藤離體快速繁殖方法，具體步驟如下：

①外植體的預(yù)處理、選取和消毒

選擇長勢旺盛的健康海風(fēng)藤，噴施30％代森錳鋅懸浮液800倍液，每周噴施一次，連續(xù)3次；然后剪取海風(fēng)藤新長出的前5節(jié)藤莖，將其藤莖剪成3～5cm的帶芽莖，用洗潔精水溶液清洗干凈，晾干備用；在超凈工作臺(tái)上用72％乙醇溶液浸泡30秒，再用無菌水沖洗2次，用無菌濾紙吸干；再用0.1％升汞溶液消毒，前2節(jié)嫩莖消毒7min，后3節(jié)藤莖消毒10min，再用無菌水清洗3遍，然后用無菌濾紙吸干后備用；

②海風(fēng)藤腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

將步驟①處理后的外植體轉(zhuǎn)接到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，誘導(dǎo)出高為3～5cm的腋芽；所述腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2MS+5.5g/L瓊脂+20g/L白糖，PH值為5.8；

③海風(fēng)藤不定芽的增殖培養(yǎng)

將步驟②誘導(dǎo)培養(yǎng)后的腋芽轉(zhuǎn)接到不定芽增殖培養(yǎng)基上，進(jìn)行增殖培養(yǎng)30天，再將腋芽分切成一節(jié)節(jié)帶芽部分并將其轉(zhuǎn)接到不定芽增殖培養(yǎng)基上，如此循環(huán)操作，可獲得大量海風(fēng)藤不定芽；所述不定芽增殖培養(yǎng)基的配方為：MS+0.2mg/L 6-BA+5.5g/L瓊脂+30g/L白糖，PH值為5.8；

④海風(fēng)藤不定芽的增殖壯苗培養(yǎng)

將步驟③增殖培養(yǎng)后的不定芽轉(zhuǎn)接到增殖壯苗培養(yǎng)基上，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)30天，使植株長高長壯并產(chǎn)生若干叢生苗；所述增殖壯苗培養(yǎng)基的配方為：MS+0.2mg/L 6-BA+1.0mg/L KT+10mg/L多效唑+5.5g/L瓊脂+30g/L白糖，PH值為5.8；

⑤海風(fēng)藤不定芽的生根培養(yǎng)

將經(jīng)步驟④壯苗培養(yǎng)后的叢生苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)30天，使幼苗基部長出3條以上根系，即可進(jìn)行海風(fēng)藤組培苗的馴化和移栽；所述生根培養(yǎng)基的配方為：MS+0.3mg/L KT+5.5g/L瓊脂+30g/L白糖+0.2％活性炭，PH值為5.8。

所述步驟②、③、④、⑤中的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25±2℃，散光光照時(shí)間為12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為2000lx。

步驟①中所述剪取海風(fēng)藤新長出的前5節(jié)藤莖為可常年剪取。所述30％代森錳鋅懸浮液、72％乙醇溶液、0.1％升汞溶液均為質(zhì)量百分含量。

所述MS即MS培養(yǎng)基。

所述1/2MS即1/2MS培養(yǎng)基，是指將MS配方中大量元素減半，其它不變而配置的培養(yǎng)基。

所述6-BA即6-芐氨基腺嘌呤，所述KT即激動(dòng)素。

實(shí)施例2

一種海風(fēng)藤離體快速繁殖方法，具體步驟如下：

①外植體的預(yù)處理、選取和消毒

選擇長勢旺盛的健康海風(fēng)藤，噴施30％代森錳鋅懸浮液800倍液，每周噴施一次，連續(xù)3次；然后剪取海風(fēng)藤新長出的前5節(jié)藤莖，將其藤莖剪成3～5cm的帶芽莖，用洗潔精水溶液清洗干凈，晾干備用；在超凈工作臺(tái)上用72％乙醇溶液浸泡35秒，再用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干；再用0.1％升汞溶液消毒，前2節(jié)嫩莖消毒9min，后3節(jié)藤莖消毒12min，再用無菌水清洗4遍，然后用無菌濾紙吸干后備用；

②海風(fēng)藤腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

將步驟①處理后的外植體轉(zhuǎn)接到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)40天，誘導(dǎo)出高為3～5cm的腋芽；所述腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2MS+5.5g/L瓊脂+20g/L白糖，PH值為5.8；

③海風(fēng)藤不定芽的增殖培養(yǎng)

將步驟②誘導(dǎo)培養(yǎng)后的腋芽轉(zhuǎn)接到不定芽增殖培養(yǎng)基上，進(jìn)行增殖培養(yǎng)40天，再將腋芽分切成一節(jié)節(jié)帶芽部分并將其轉(zhuǎn)接到不定芽增殖培養(yǎng)基上，如此循環(huán)操作，可獲得大量海風(fēng)藤不定芽；所述不定芽增殖培養(yǎng)基的配方為：MS+0.2mg/L 6-BA+5.5g/L瓊脂+30g/L白糖，PH值為5.8；

④海風(fēng)藤不定芽的增殖壯苗培養(yǎng)

將步驟③增殖培養(yǎng)后的不定芽轉(zhuǎn)接到增殖壯苗培養(yǎng)基上，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)40天，使植株長高長壯并產(chǎn)生若干叢生苗；所述增殖壯苗培養(yǎng)基的配方為：MS+0.2mg/L 6-BA+1.0mg/L KT+10mg/L多效唑+5.5g/L瓊脂+30g/L白糖，PH值為5.8；

⑤海風(fēng)藤不定芽的生根培養(yǎng)

將經(jīng)步驟④壯苗培養(yǎng)后的叢生苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)40天，使幼苗基部長出3條以上根系，即可進(jìn)行海風(fēng)藤組培苗的馴化和移栽；所述生根培養(yǎng)基的配方為：MS+0.3mg/L KT+5.5g/L瓊脂+30g/L白糖+0.2％活性炭，PH值為5.8。

所述步驟②、③、④、⑤中的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25±2℃，散光光照時(shí)間為12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為2000lx。

步驟①中所述剪取海風(fēng)藤新長出的前5節(jié)藤莖為可常年剪取。所述30％代森錳鋅懸浮液、72％乙醇溶液、0.1％升汞溶液均為質(zhì)量百分含量。

所述MS即MS培養(yǎng)基。

所述1/2MS即1/2MS培養(yǎng)基，是指將MS配方中大量元素減半，其它不變而配置的培養(yǎng)基。

所述6-BA即6-芐氨基腺嘌呤，所述KT即激動(dòng)素。

實(shí)施例3

一種海風(fēng)藤離體快速繁殖方法，具體步驟如下：

①外植體的預(yù)處理、選取和消毒

選擇長勢旺盛的健康海風(fēng)藤，噴施30％代森錳鋅懸浮液800倍液，每周噴施一次，連續(xù)3次；然后剪取海風(fēng)藤新長出的前5節(jié)藤莖，將其藤莖剪成3～5cm的帶芽莖，用洗潔精水溶液清洗干凈，晾干備用；在超凈工作臺(tái)上用72％乙醇溶液浸泡32秒，再用無菌水沖洗2次，用無菌濾紙吸干；再用0.1％升汞溶液消毒，前2節(jié)嫩莖消毒8min，后3節(jié)藤莖消毒108min，再用無菌水清洗3遍，然后用無菌濾紙吸干后備用；

②海風(fēng)藤腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

將步驟①處理后的外植體轉(zhuǎn)接到腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)35天，誘導(dǎo)出高為3～5cm的腋芽；所述腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：1/2MS+5.5g/L瓊脂+20g/L白糖，PH值為5.8；

③海風(fēng)藤不定芽的增殖培養(yǎng)

將步驟②誘導(dǎo)培養(yǎng)后的腋芽轉(zhuǎn)接到不定芽增殖培養(yǎng)基上，進(jìn)行增殖培養(yǎng)35天，再將腋芽分切成一節(jié)節(jié)帶芽部分并將其轉(zhuǎn)接到不定芽增殖培養(yǎng)基上，如此循環(huán)操作，可獲得大量海風(fēng)藤不定芽；所述不定芽增殖培養(yǎng)基的配方為：MS+0.2mg/L 6-BA+5.5g/L瓊脂+30g/L白糖，PH值為5.8；

④海風(fēng)藤不定芽的增殖壯苗培養(yǎng)

將步驟③增殖培養(yǎng)后的不定芽轉(zhuǎn)接到增殖壯苗培養(yǎng)基上，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)35天，使植株長高長壯并產(chǎn)生若干叢生苗；所述增殖壯苗培養(yǎng)基的配方為：MS+0.2mg/L 6-BA+1.0mg/L KT+10mg/L多效唑+5.5g/L瓊脂+30g/L白糖，PH值為5.8；

⑤海風(fēng)藤不定芽的生根培養(yǎng)

將經(jīng)步驟④壯苗培養(yǎng)后的叢生苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根培養(yǎng)35天，使幼苗基部長出3條以上根系，即可進(jìn)行海風(fēng)藤組培苗的馴化和移栽；所述生根培養(yǎng)基的配方為：MS+0.3mg/L KT+5.5g/L瓊脂+30g/L白糖+0.2％活性炭，PH值為5.8。

所述步驟②、③、④、⑤中的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25±2℃，散光光照時(shí)間為12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為2000lx。

步驟①中所述剪取海風(fēng)藤新長出的前5節(jié)藤莖為可常年剪取。所述30％代森錳鋅懸浮液、72％乙醇溶液、0.1％升汞溶液均為質(zhì)量百分含量。

所述MS即MS培養(yǎng)基。

所述1/2MS即1/2MS培養(yǎng)基，是指將MS配方中大量元素減半，其它不變而配置的培養(yǎng)基。

所述6-BA即6-芐氨基腺嘌呤，所述KT即激動(dòng)素。

上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的設(shè)計(jì)構(gòu)思并不局限于此，凡利用此構(gòu)思對本發(fā)明進(jìn)行非實(shí)質(zhì)性的改動(dòng)，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。