專利名稱：：Mapkkk家族基因dsm1基因在控制水稻抗旱性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及水稻基因工程領(lǐng)域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗證得到一種能夠提高甘露醇耐受能力的水稻DSM1基因在水稻抗逆性遺傳改良中的應(yīng)用。本發(fā)明采用篩選T-DNA插入水稻突變體庫的方法，克隆到控制水稻抗旱基因DSM1，通過共分離檢測表明該突變體與干旱敏感表型是緊密連鎖的，及通過超量表達(dá)DSM1基因，使轉(zhuǎn)基因水稻甘露醇耐受能力提高，證實了該基因的功能。
背景技術(shù)：
：植物的生長除了有其固有的遺傳基礎(chǔ)外，往往還會受到諸多環(huán)境因素的影響。干旱、高鹽、低溫是最為常見的非生物逆境，嚴(yán)重影響了植物的生長，限制了植物的分布。非生物逆境會造成作物產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，在許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。因此，培育抗逆性作物品種一直是農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究的主要目標(biāo)之一。為了適應(yīng)或抵御這些逆境條件，植物在經(jīng)過長期的生物馴化之后，形成了一套防御干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫的自我保護機制。干旱、高鹽和低溫脅迫，都破壞了植物細(xì)胞的離子平衡，致使細(xì)胞脫水，使植物細(xì)胞受到離子和水分脅迫，引起植物體在基因表達(dá)，新陳代謝以及形態(tài)上的變化，這些變化包括一些基因表達(dá)升高或降低，生長的減緩甚至停止，體內(nèi)激素(如ABA)的瞬時上升，體內(nèi)調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)的聚集等(SekiM，UmezawaT，UranoK，ShinozakiK.Regulatorymetabolicnetworksindroughtstressresponses.CurrOpinPlantBiol，2007，10:296-302)。并且植物在進化過程中也形成了一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑來介導(dǎo)對脅迫的反應(yīng)，從而控制植物的生長發(fā)育。以往對植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的認(rèn)識僅局限于直接感知信號的感應(yīng)或受體蛋白，或直接調(diào)控反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子和目標(biāo)基因。而對處于這兩者之間的基因的了解卻十分有限。在最近幾年中，科學(xué)家們已經(jīng)鑒定多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，如與鹽脅迫有關(guān)的Salt-0ver1y-Sensitive(SOS)路徑、與多種逆境有關(guān)的CDPK信號路徑、與冷脅迫有關(guān)的ICE1(InducerofCBFExpression1)_CBF(C-R印eatBindingProtein)路徑、與滲透壓有關(guān)的ABA依賴型和非ABA依賴型的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑以及裂原激活蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)級聯(lián)信號通路，其中MAPK級聯(lián)信號通路在植物的各種生理反應(yīng)如細(xì)胞分裂、激素反應(yīng)、非生物脅迫和生物脅迫中都起著及其重要的作用(JonakC，KiegerlS，LigterinkW，BarkerPJ，HuskissonNS，HirtH.Stresssignalinginplants:amitogen—activatedproteinkinasepathwayisactivatedbycoldanddrought.ProcNatlAcadSciUSA，1996，93:11274-11279)。MAPK級聯(lián)信號通路是高度保守的，他通過三級激酶級聯(lián)反應(yīng)，即MAPKKK(MAPKinaseKinaseKinase)—MAPKK(MAPKinaseKinase)—MAPK，但是，一直以來，人們只知道MAPK級聯(lián)途徑由這3種激酶組成，但就具體的MAPK級聯(lián)通路的組成、生理功能、目標(biāo)基因等情況還知之甚少，特別是參與非生物逆境應(yīng)答的完整MAPK級聯(lián)通路還未見報道。因此對非生物逆境應(yīng)答的MAPK級聯(lián)通路研究有很重要的意義(TenaG，AsaiT，ChiuWL，SheenJ.Plantmitogen-activatedproteinkinasesignalingcascades.CurrOpinPlantBiol，2001，4:392-400)。水稻是重要的糧食作物和模式植物，通過水稻突變體來研究一些與植物生長、發(fā)育和其他性狀相關(guān)的基因已成為一種重要的基因功能研究手段。在我們的前期研究中分離到一個干旱敏感的水稻T-DNA突變體，其插入基因是一個MAPKKK基因。鑒于水稻中MAPKKK是否能提高植物的抗逆性目前尚無相關(guān)報道。因此，從水稻中分離出MAPKKK基因，并鑒定它在提高水稻抗逆性方面所發(fā)揮的功能，對于培育抗逆水稻新品種將具有非常重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的涉及一個MAPKKK家族基因DSM1基因在控制水稻抗旱性改良中的應(yīng)用。從水稻T-DNA突變體庫中分離得到一個干旱敏感的水稻T-DNA突變體，其插入基因是一個MAPKKK基因，基于這個突變體的表型，申請人將該基因命名為DSM1(drought-sensitivemutant1)。本發(fā)明分離和應(yīng)用一種包含DSM1基因的DNA片段，該片段賦予水稻在逆境條件下抗性增強的能力。其中，所述的DSM1基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQNO:1中第159-3494位所示的DNA序列；或2)編碼與1)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列；或3)1)和2)所包含的亞片斷。攜帶有本發(fā)明DSM1基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weissbach，1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress,NewYork,pp.411—463;GeisersonandCorey，1998，PlantMolecularBiology(2ndEdition)。可使用包括本發(fā)明的DSM1基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主是包括水稻在內(nèi)多種植物，培育抗旱，抗鹽或抗寒的植物品種。本發(fā)明基因是受逆境誘導(dǎo)表達(dá)的，因此可將本發(fā)明的基因與任何感興趣的逆境誘導(dǎo)啟動子結(jié)合后連入合適的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化植物宿主，在逆境條件下可誘導(dǎo)表達(dá)基因，提高植物在逆境條件下的生長速度。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。序列表SEQIDNO:1顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有DSM1基因編碼區(qū)的核苷酸序列。圖1.根據(jù)插入位點設(shè)計引物驗證共分離示意圖。A表示在插入位點上游設(shè)計的引物，B表示在插入位點下游設(shè)計的引物，C表示根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計的引物。在T1代植株中，純合突變體只有A和C配對可以擴增的出，因為有T-DNA插入A與B配對的產(chǎn)物太大無法得到擴增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產(chǎn)物，雜合植株則A和C配對以及A和B配對時都可以擴增得到產(chǎn)物。圖2.根據(jù)插入位點設(shè)計引物驗證共分離的PCR結(jié)果。上一行引物A+B，下一行引物C+B，其中泳道2，5，13，16，17，18，19，20，21，22，23，24為T-DNA純合;1，3，6，8'14，15為T-DNA雜合；4，7，9，10，12為T-DNA陰性。圖3.水稻突變體表型。上干旱脅迫前。下干旱脅迫后。ZH11為野生型對照，dsml-1為DSM1T-DNA突變體。圖4.DSM1能被多種逆境(干旱、高鹽、低溫、ABA等)誘導(dǎo)表達(dá)。圖5.正常生長和12Ommol/L甘露醇脅迫下，3個DSM1超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系(Tl)和對照生長狀況的比較。圖6.甘露醇脅迫地上部分統(tǒng)計結(jié)果。圖7.超表達(dá)實驗所用pU1301載體圖。圖8.DSM1基因抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系干旱脅迫表型。具體實施例方式以下實施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離DSM1T-DNA突變體，克隆包含有DSM1基因完整編碼區(qū)段和基因的啟動子區(qū)段的DNA片段，以及驗證DSM1基因功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。實施例1:分離DSM1T-DNA突變體基于已報道的植物MAPK/MAPKK/MAPKKK蛋白質(zhì)序列建立隱馬爾可夫模型(H匪s:HiddenMarkovmodelprofiles)然后用HMMER掃描水稻全基因組，得到水稻基因組里所有可能的MAPKKK基因。然后從水稻突變體庫(http:〃rmd.ncpgr.cn/)中挑取相應(yīng)的T-DNA突變體。本發(fā)明所涉及的序列來源于NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)，TIGR(http:〃www.tigr.org)，KOME(http:〃cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)，定位的基因的位置信息以"TIGRRiceAnnotationRelease4"為準(zhǔn)。其中DSM1T-DNA突變體的側(cè)翼序列為根據(jù)側(cè)翼序列與水稻基因組的匹配情況，可以確定插入位點，在插入位點的兩邊設(shè)計一對引物A和B，及T-DNA上設(shè)計一條引物C，如圖1，A表示在插入位點上游設(shè)計的引5物，B表示在插入位點下游設(shè)計的引物，C表示根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計的引物。在T1代植株中，T-DNA純合植株只有A和C配對可以擴增的出，因為有T-DNA插入A與B配對的產(chǎn)物太大無法得到擴增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產(chǎn)物，雜合植株則A和C配對以及A和B配對時都可以擴增得到產(chǎn)物。根據(jù)插入位點設(shè)計的弓I物序列為A(弓I物)5'CACCGTCCTCGGGTTTATC3'B(弓|物)5'AGTTTCTTGCCGCTGTTCA3'C(引物)5'AATCCAGATCCCCCGAATTA3'。PCR反應(yīng)體系的總體積為20ii1，DNA模板lul(約50ng)、lXTaq酶反應(yīng)緩沖液、25mMMgCL2l.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3單位Taq酶，加水至20ii1。反應(yīng)程序為:94。C變性5min，94°C45s、55。C45s、72。Clmin30cycles，72。C延伸5min。PCR結(jié)果，如圖1，2，5，13，16，17，18，19，20，21，22，23，24為T-DNA純合；1，3，6，8，14，15為T-DNA雜合；4，7，9，10，12為T-DNA陰性。結(jié)果表明這個T-DNA插在第12個EXON，據(jù)ATG7174bp處。實施例2:鑒定突變體干旱脅迫表型將已鑒定好基因型的純合和野生型家系催芽后直播到小圓桶中。試驗用的土壤為南方水稻土與粗沙按2:3混合而成，每圓桶等量均勻沙土加等體積水，水自行滲漏確保土壤的緊實度一致，試驗設(shè)3次重復(fù)。對健康生長的4葉期的植株進行斷水干旱脅迫12天，然后復(fù)水7天，拍照并調(diào)查植株的存活率。與野生型對照相比，T-DNA純合植株表現(xiàn)為干旱敏感表型，在中度脅迫復(fù)水后，純合植株基本全部死亡，而野生型仍有60%以上的存活率。該實驗經(jīng)行了3次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果一致。說明該突變表型確實是T-DNA插入造成的。為了驗證該突變體的遺傳穩(wěn)定性及進一步驗證共分離情況，又繁殖了一代即T2代。將T1代收獲的種子播種得到T2代純合，雜合和野生型種子。同樣經(jīng)行上述脅迫實驗，結(jié)果一致。實施例3:檢測水稻內(nèi)源DSM1基因的表達(dá)水平我們選用袖稻品禾中中花11號(OryzasativaL.subsp.j即onicacv.Zhonghim11)作為表達(dá)譜分析時材料。種子催芽后，在正常生長條件下培養(yǎng)18-20天，至四葉期時進行各種逆境和激素的處理。干旱處理是將幼苗直接從水培液中取出暴露于空氣中，分別在脅迫前、脅迫后6小時、24小時、36小時取樣；高鹽脅迫是將幼苗由水培液移入含有200mmol/LNaCl的水培液中，分別在脅迫前，2小時、6小時、12小時取樣；低溫脅迫是把水稻幼苗放入4t:人工氣候室，分別于脅迫前、脅迫后3小時、7小時、12時取樣。激素處理是用lOOyM脫落酸(ABA)均勻的噴灑水稻植株表面后，分別在脅迫前、脅迫后3小時、6小時、12小時取樣。所有的處理和取樣過程都是在持續(xù)光照的條件下進行的。總RNA采用TRIZ0L試劑(購自Invitrogen公司)提取(提取方法根據(jù)上述TRIZ0L試劑說明書)，利用反轉(zhuǎn)錄酶SSII(購自Invitrogen公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(方法根據(jù)Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄酶試劑說明書)，反應(yīng)條件為65°C5min，42°C120min，70°C10min。以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用引物(5'-GTGGTCATGGTCCATTATTGCC-3'和5'-CCCAAACCCTCAACTGGCTTA-3')對DSM1基因進行特異的PCR擴增(擴增產(chǎn)物長72bp)。同時用引物(AF:5'-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3'禾PAR:5'-TGCACAATGGATGGGTCAGA—3')對水稻Actinl基因做特異擴增(擴增產(chǎn)物長76bp)，以作為內(nèi)對照進行定量分析。反應(yīng)條件為95。C5min;95。C10sec，60。C5sec，72。C34sec，40個循環(huán)。反應(yīng)過程中進行熒光檢測實時定量分析。結(jié)果表明，DSM1基因在高鹽、ABA和干旱處理后誘導(dǎo)上升表達(dá)，在低溫脅迫中也有輕微地下降表達(dá)(見圖3)。實施例4:DSM1基因超量表達(dá)、抑制表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化為了能更好的分析DSM1基因的功能，申請人將其在水稻中超量表達(dá)和抑制表達(dá)。從轉(zhuǎn)基因植株的表型研究該基因的功能。超量表達(dá)載體構(gòu)建方法如下首先通過查找日本水稻全長數(shù)據(jù)庫Knowledge-based0ryzaMolecularbiologicalEncyclopedia(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所對應(yīng)的cDNA克隆J033107F14(登錄號AK102767)，并購買其全長cDNA。已該全長cDNA為模板，用引物DSMFLF(5'-CCAGGTACCCAACAGTGGGCAATAGG-3')和DSMFLR(5'-CCAGGATCCTGGTTTCAATGAGGCCATG-3')，擴增出包含DSM1全長的DNA片斷，反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3min;94。C30sec，50。C30sec，72。C3min，30個循環(huán)；72。C延伸10min。用BamHI和Kpnl雙酶切，回收次PCR片段；同時，用同樣的方法酶切攜帶Ubiquitin啟動子的遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301U酶切完畢，用氯仿異戊醇(體積比為24:l)抽提，純化酶切產(chǎn)物。用包含DSM1全長的酶切片段和酶切后的載體做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1013(大腸桿菌DH10P菌株購自Invitrogen公司)。通過酶切篩選陽性克隆，獲得轉(zhuǎn)化載體。遺傳轉(zhuǎn)化的載體pCAMBIA1301U(見圖7)是在國際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301(載體pCAMBIA1301來自澳大利亞CAMBIA[CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture]實驗室)基礎(chǔ)上，在酶切位點EcoRI和Sacl處引入廣泛使用的組成型表達(dá)的Ubiquitin啟動子(參見TokiS，TakamatsuS，NojiriC，0obaS，AnzaiH，IwataM，ChristensenAH，QuailPH，UchimiyaH.ExpressionofaMaizeUbiquitinGenePromoter—barChimericGeneinTransgenicRicePlants.PlantPhysiol，1992，100:1503-1507)而得到的(見圖7)，被命名為遺傳轉(zhuǎn)化的載體pCAMBIA1301U。抑制表達(dá)載體構(gòu)建方法如下首先通過查找日本水稻全長數(shù)據(jù)庫Knowledge-basedOryzaMolecularbiologicalEncyclopedia(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所對應(yīng)的cDNA克隆J033107F14，并購買其全長cDNA。以該全長cDNA為模板，用引物uz41maif(5'ccaactagtggtaccTTGTAGCACCACCTGACT3')禾Puz41mair(5'ccagagctcggatccATTGAAGACGCAACCACT3')，擴增出包含DSM1全長的400bp片斷，反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3min;94°C30sec，50。C30sec，72。Clmin，30個循環(huán)；72。C延伸10min。用BamHI和Kpnl雙酶切或Spel和Sacl雙酶切，回收該PCR片段；同時，用同樣的方法酶切攜帶Ubiquitin啟動子的遺傳轉(zhuǎn)化載體pdsl301(見圖7)酶切完畢，用氯仿異戊醇(體積比為24:l)抽提，純化酶切產(chǎn)物。用包含DSM1400bp的酶切片段和酶切后的載體pdsl301(見圖7)做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH1013(大腸桿菌DH1013菌株購自Invitrogen公司)。通過酶切篩選獲得陽性克隆。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法(如下述具體步驟)將以上載體(pCAMBIA1301U和pds1301)導(dǎo)入到水稻品種中花11(中國水稻研究所提供的一個公開使用的水稻品種)中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(中花ll)遺傳轉(zhuǎn)化方法(體系)在Hiei等人手艮道的方f去(Hiei等，Efficienttransformationofrice，OryzasativaL.，mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT_DNA，PlantJ，6:271-282，1994)基礎(chǔ)上改良進行(如下述具體步驟)。7具體遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下(1)愈傷組織誘導(dǎo)將成熟的水稻種子中花ll(中國水稻研究所提供的一個公開使用的水稻品種)去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，O.15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；用滅菌水洗種子4-5次；將該消過毒的種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(成分見后)；將接種后的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25±rC。(2)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±rc。(3)預(yù)培養(yǎng)挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±rc。(4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上(成分見后)預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105(來源于CAMBIA，商用菌株)兩天，培養(yǎng)溫度28°C;將所述的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基(成分見后)里，2『C搖床上培養(yǎng)2-3小時。(5)農(nóng)桿菌侵染將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至0D6。。0.8-1.0;將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基(成分見后)上培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度19-20°C。(6)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基(成分見后)上選擇2-3次，每次2周(第一次篩選羧芐青霉素濃度為400卯m，第二次以后為250卯m，潮霉素濃度250卯m)。(7)分化將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗處培養(yǎng)5-7周；轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上(成分見后)，光照下培養(yǎng)，溫度26°C。(8)生根剪掉分化時產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2_3周，溫度26°C。(9)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。培養(yǎng)基組分及其配方(l)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-節(jié)基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧節(jié)青霉素)；KT(Kinetin，激動素)；NAA(N即thaleneaceticacid，萘乙酸)IAA(Indole-3-aceticacid，口引哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide,二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液(10X)]的配制硝酸鉀(KN03)28.3g磷酸二氫鉀(KH2P04)4.0g硫酸銨((NH4)2S04)4.63g硫酸鎂(MgS047H20)1.85g氯化鈣(CaCl22H20)1.66g逐一溶解，然后室溫下定容至1000ml。2)N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制0.08g0.16g4H20)0.44g7H20)0.15g室溫下溶解并定容至1000ml。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(匪)的配制準(zhǔn)備800ml雙蒸水并加熱至70。C，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA2H20)3.73克，充分溶解后在7(TC水浴中保持2小時，定容至1000ml，4t:保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)配制碘化鉀(KI)硼酸(H萬)硫酸錳(MnS04硫酸鋅(ZnS04煙酸(Nicotinicacid)0.lg維生素Bl(ThiamineHC1)0.lg維生素B6(PyridoxineHC1)0.lg甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ml，4t:保存?zhèn)溆谩?)MS培養(yǎng)基大量元素母液(10X)的配制硝酸銨(NH4N03)16.5g硝酸鉀19.Og磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g氯化鈣4.4g室溫下溶解并定容至1000ml。6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(100X)的配制碘化鉀0.083g0.62g0.86g0.025g0.0025g硫酸錳鉬酸鈉(Na2Mo042H20)硫酸銅(CuS045H20)室溫下溶解并定容至1000ml。7)2，4-D貯存液，6-BA貯存液，萘乙酸(NAA)貯存液，吲哚乙酸(IAA)貯存液l均為mg/ml。8)葡萄糖貯存液0.5g/ml。9)AS貯存液的配制秤取AS0.392g，DMSO10ml。(3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方1)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(ioox)10ml2，4-D貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.蔗糖(Sucrose)30gPhytegel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三-角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(ioox)10ml2，4-D貯存液2.Oml脯氨酸0.5gCH0.蔗糖30gPhytegel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌c3)預(yù)培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(匪)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1.75g加蒸餾水至250ml，lN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250ii1AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(匪)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.2g0128]蔗糖5g0129]瓊脂粉1.75g0130]加蒸餾水至250ml，lN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250ii1AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。0131]5)懸浮培養(yǎng)基0132]N6max母液(10X)5ml0133]N6mix母液(100X)0.5ml0134]Fe2+EDTA貯存液(100X)0.5ml0135]維生素貯存液(100X)1ml0136]2，4-D貯存液0.2ml0137]CH0.08g0138]蔗糖2g0139]加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入1ml葡萄糖貯存液和1001AS貯存液。0140]6)選擇培養(yǎng)基0141]N6max母液(10X)25ml0142]N6mix母液(100X)2.5ml0143]Fe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml0144]維生素貯存液(匪)2.5ml0145]2，4-D貯存液0.625ml0146]CH0.15g0147]蔗糖7.5g0148]瓊脂粉1.75g0149]加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250HN和400ppmCN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(匪)2.5ml6-BA貯存液0.5mlKT貯存液0.5mlNAA貯存液50ii1IAA貯存液50ii1CH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口加入250ii1HN和200卯mCN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。使用前溶解培養(yǎng)基，110163]0164]0165]0166]0167]0168]0169]0170]0171]0172]0173]8)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe2+EDTA貯存液(100X)維生素貯存液(100X)6-BA貯存液KT貯存液NAA貯存液IAA貯存液CHPhytegel100ml10ml10ml10ml2ml2ml0.2ml0.2mllg30g3g0177]0178]0179]0180]0181]0182]0183]0174]0175]加蒸餾水至900ml，lN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。煮沸并定容至lOOOml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。0176]9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10X)50mlMSmix母液(100X)5mlFe2+EDTA貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖30gPhytegel3g加蒸餾水至900ml，lN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。煮沸并定容至lOOOml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。0184]實施例5:DSM1超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因1\代家系在甘露醇脅迫下的生長狀況0185]本實施例選取了3個DSM1超量表達(dá)1\家系進行了甘露醇脅迫實驗。具體步驟如下將超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系種子去殼消毒(75X酒精處理3min，0.15%氯化汞處理30min，無菌水清洗數(shù)次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，野生型對照家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，2-3天后挑選發(fā)芽好且長勢一致的種子轉(zhuǎn)移到含有Ommol/L和120mmol/L的甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)室生長10天后觀察表型和測量植株的株高。每個家系的每種處理不少于15棵植株，實驗設(shè)置3次重復(fù)。結(jié)果表明DSM1超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的生長在正常條件下略差于對照，但在逆境脅迫處理后生長要顯著(t測驗P〈0.01)優(yōu)于對照，說明本發(fā)明的DSM1基因的表達(dá)可以緩解甘露醇脅迫造成的植株生長受阻，增強轉(zhuǎn)基因植物對非生物逆境的抗性(見圖5、圖6)。實施例6:DSM1抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因1\代家系在干旱脅迫下的生長狀況本發(fā)明選取了3個DSM1抑制表達(dá)T1家系進行了甘露醇脅迫實驗。具體步驟如下將抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因家系種子去殼消毒(75X酒精處理3min，0.15%氯化汞處理30min，無菌水清洗數(shù)次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，野生型對照家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，2-3天后挑選發(fā)芽好且長勢一致的種子轉(zhuǎn)移到正常1/2MS培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)室生長IO天后，將幼苗移入裝有沙土的小圓桶中。試驗用的沙土為南方水稻土與粗沙按重量份2:3混合而成，每圓桶等量均勻沙土加等體積水，水自行滲漏確保土壤的緊實度一致，試驗設(shè)3次重復(fù)。等幼苗生長至4葉期后，對植株進行斷水干旱脅迫12天，然后復(fù)水7天，拍照并調(diào)查植株的存活率。試驗表明，本實施例與野生型對照相比，抑制表達(dá)植株表現(xiàn)為干旱敏感表型(圖8)。序列表〈110〉華中農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉MAPKKK家族基因DSM1基因在控制水稻抗旱性中的應(yīng)用〈130〉〈141>2009-11-10〈160>2〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>3845〈212>DNA〈213>水稻(0ryzasativa〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)(3845)〈223〉〈220〉〈221>CDS〈222〉(159)(3494)〈223〉〈400>1ggagtcaatecctgccteaagttgagtteccccttccgcctcagcgtcagtggccatgtc60ggatccaccc3ccc3ccacc3gc朋cagtgggc朋teggcc朋tegctgctgctgcgacg120gcgacctcggcggcggcggcggcggcggtggcgacggcatgaagaacttcttc￡igg176MetLysAsnPhePheArg15getccacateggggaggggtegggcgacggcgectectegtctccc224LysLeuHislieGlyGluGlySerGlyAspGlyAlaSerSerSerPro101520cctccaccgccctectegaggaaggggageggcggggtggggggt朋t272ProProProProSerSerArgLysGlySerGlyGlyValGlyGlyAsn253035catcacctgcacgecgagcagaggcagccateggcgteggcggtgteg320HisHisLeuHisAlaGluGinArgGinProSerAlaSerAlaValSer404550agetggcttgattecgtcccaggteggcctcagccccctacgccgteg368<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>LeuMetLysLeuAspGinThrAlaLeulieMetSerLeuGluLeuArg265270275g朋tctcctteag朋tttgttgga朋tgatttggttC3g333ctt1040GluSerLysProSerGluPheValGlyAsnAspLeuValGinLysLeu280285290getggcetagtegcc3gaC3CEltgggtggaactttttttgattctgag1088AlaGlyLeuValAlaArgHisMetGlyGlyThrPhePheAspSerGlu295300305310ggcEltgttggtgaaatacCElgatgatg3gatecctg3gaaccagt1136GlyMetLeuValLysTyrGinLysMetMetArgTyrLeuArgThrSer315320325attElgtgtegttgttcctcttggcc朋tte朋aattggtctggca1184lieGlySerValValValProLeuGlyGinLeuLyslieGlyLeuAla330335340cgtcatcgtgCElctgetattt朋ggttttggccgataacattggtate1232ArgHisArgAlaLeuLeuPheLysValLeuAlaAspAsnlieGlylie345350355ccctgtCg￡letcctggg￡i￡lggcagtacactggateggacgatggg1280ProCysArgLeuLeuLysGlyArgGinTyrThrGlySerAspAspGly360365370getttg朋tattgtgaaatttgatgatggaagggagttcattgttgat1328AlaLeuAsnlieValLysPheAspAspGlyArgGluPhelieValAsp375380385390cttgtcgCElgatcctggtcttattcctteagatggtgetgttttg1376LeuValAlaAspProGlyThrLeulieProSerAspGlyAlaValLeu395400405tctg朋tttg朋g朋Elgttecttcteaaataatcatcattttaac1424SerThrGluPheGluGluSerSerPheSerAsnAsnHisHisPheAsn410415420gat朋tg￡lCate￡lggCElgttgggatctteaaatagtttetegaat1472LysAspAsnAsplieArgGinLeuGlySerSerAsnSerLeuSerAsn425430435tctgCEltgtElgttcttttgagtgtgagttecttgac3ga3gatctsea1520SerAlaCysSerSerPheGluCysGluLeuLeuAspArgArgSerThr440445450tggate朋cgttggtccttctgat3gtg3tgg3get3CgageC3g1568TrplieAsnValGlyProSerAspSerAspGlyAlaThrThrSerGin455460465470Elgt朋c朋tc朋c朋朋tacacteteagatteattcgggatt1616ThrSerLysAsnAsnGinGinAsnThrLeuSerAspSerPheGlylie475■485ttatctgttagettcactElgtg朋朋t3ggCCt3tt3C3朋tg朋1664LeuSerValSerThrPheThrSerGluAsnArgProlieThrAsnGlu490495500tea3gaElgtg￡lCg￡lCattgetgccgC333g朋3g朋3g3tea1712SerArgSerThrAspAsplieAlaAlaAlaLysAsnLysGluArgSer505510515Elgtgt￡latt朋ttcttcgteaactteacctteaccttctteccca1760SerValThrlieAsnSerSerSerThrSerProSerProSerSerPro520525530g朋gt￡lggcElgtactCC3getgtceggaggatg朋agte朋ggatatt1808GluValGlySerThrProAlaValArgArgMetLysValLysAsplie535540545550tcggagtacEltgatt朋tgetgcca朋gag朋tccac朋ctegetcag1856SerGluTyrMetlieAsnAlaAlaLysGluAsnProGinLeuAlaGin555560565朋gatecatgaggttttacttg朋朋tggagttgtegcaccacctgac1904LyslieHisGluValLeuLeuGluAsnGlyValValAlaProProAsp570575580ttgtttteag朋gattecEltgg朋gagcca朋ggacetcategtgtet1952LeuPheSerGluAspSerMetGluGluProLysAspLeulieValTyr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etMet305310315320ArgTyrLeuArgThrSerlieGlySerValValValProLeuGlyGin325330335LeuLyslieGlyLeuAlaArgHisArgAlaLeuLeuPheLysValLeu340345350AlaAspAsnlieGlylieProCysArgLeuLeuLysGlyArgGinTyr355360365ThrGlySerAspAspGlyAlaLeuAsnlieValLysPheAspAspGly370375380ArgGluPhelieValAspLeuValAlaAspProGlyThrLeuliePro385390395400SerAspGlyAlaValLeuSerThrGluPheGluGluSerSerPheSer405410415AsnAsnHisHisPheAsnLysAspAsnAsplieArgGinLeuGlySer420425430SerAsnSerLeuSerAsnSerAlaCysSerSerPheGluCysGluLeu435440445LeuAspArgArgSerThrTrplieAsnValGlyProSerAspSerAsp450455460GlyAlaThrThrSerGinThrSerLysAsnAsnGinGinAsnThrLeu465470475■SerAspSerPheGlylieLeuSerValSerThrPheThrSerGluAsn48549049520ArgProlieThrAsnGluSerArgSerThrAspAsplieAlaAlaAla500505510LysAsnLysGluArgSerSerValThrlieAsnSerSerSerThrSer515520525ProSerProSerSerProGluValGlySerThrProAlaValArgArg530535540MetLysValLysAsplieSerGluTyrMetlieAsnAlaAlaLysGlu545550555560AsnProGinLeuAlaGinLyslieHisGluValLeuLeuGluAsnGly565570575ValValAlaProProAspLeuPheSerGluAspSerMetGluGluPro580585590LysAspLeulieValTyrAspThrThrLeuPheGinSerLysAspGlu595600605MetLysLysArgMetAsnGluLeuGlySerArgGluTyrAlaAspArg610615620GlyHisGlyProLeuLeuProHisHisProGlyHisGluLeuProSer625630635640LysValProHisArgAlaProLeuAspSerLeuLysProValGluGly645650655LeuGlylieAspHisProProAsplieGinAspAsnThrSerPhelie660665670SerGinTyrGluProSerAlaProProGinGluAlaSerSerGinLeu675680685ThrLysGinLeuProValThrAlaAlaAlaValAlaThrAlaAlaVal690695700ValAlaSerSerMetValValAlaAlaAlaLysSerAsnAsnAspVal705710715720AsnPheAspValProValAlaAlaAlaAlaThrValThrAlaAlaAla725730735ValValAlaThrThrAlaAlaValSerLysGinTyrGluHisLeuGlu740745750ProGlyAsnGinLeuHisSerLeuProSerProSerGluGlyAsnGlu755760765SerlieGluLysSerAlaAspGluPheTrpAspLysGinAsnPheGlu770775780lieAspHisGlyGinAspAsnThrLeuAspGinGluLysAspSerAla785790795■GluValArgGinAspAlaGluArgThrSerAspLysSerSerGlyThrGluSerAlalieGinPheLys865ArgLeuGluAsnArg945AspValSerArgValMetArglieAlaAlaGly850LysThrPhePheGin930GlyLeuCysArgAsn1010lie1025Asn1040Leu1055Ala1070Asp1085Gin1100Trp835GluPheGluMetLeu915LeuLys820GluValLeuValGly■Pro805SerGluTyrGinArg885AlaArgGluMetAsnTyrAspLysAspSer995GluLeuAlaAspLyslieAlaSerPhe980ThrPro965GlyAlaGlulieArgGin870lielieGlyArgLeu950AsnlieThrGly855AsplieThrSerLys935HisThrlie840GluLeu825Gly810AspAspArgTrpHisGlyGluVallieThr860AlaAlaGly845GluLeuGlu830LeuValGlulieSerSerAsp875ArgHisProAsnLysArgLeu920ArgAsnArgVal905PheLeuLeu890Pro815PheGlyAlaGluVal895ValGluSerValPhe880ValThrAsnLeuSerlie910ArgProAsnCysLeuLeuValArgLeulieArgThrMetLeuSerLysMet985Asp970LysPro955LysAla940ValHis925LeulieTrpAsnLysThrAsnAspValAlaValValHisPhe990Val975LeuArg960LysSerGlyProSerAspThrTrpGluMetGinlieProCysTrpMetAlaProArgLeuValAspGinSerGinAlaGluTrpMetAlaProGluValLeu10001005GluLysCysAspValPheSer1020GinPro1035GlyPhe1050Alalie1065ProLysLeuArg1080ProLeuLeuLys1095GinGinThrAsp11101015Cys1030Val1045Asn1060Thr1075Leu1090Arg1105ThrGlyThrAspLysValLeuLeuAlaValAspProTrpGinAlaProAsnGluTyrGlyGlyGlyAsnArgGlulieSerPheMetThr權(quán)利要求一種控制水稻抗旱性的基因DSM1在水稻抗旱性遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于，該基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQNO1中第159-3494位所示的DNA序列；或2)編碼與1)中第159-3494位編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列。全文摘要本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種MAPKKK家族基因DSM1基因在控制水稻抗旱性中的應(yīng)用。通過功能分析和鑒定獲得一個控制水稻抗旱性的關(guān)鍵基因DSM1，驗證了該基因在水稻抗旱性抗逆遺傳改良中的應(yīng)用。所述的DSM1基因是下列核苷酸序列之一序列表SEQNO1中第159-3494位所示的核苷酸序列；或編碼與1)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。將水稻內(nèi)源基因DSM1的功能缺失或其表達(dá)量降低后，水稻抗旱性極限著下降；將含DSM1基因的核苷酸序列與外源啟動子連接后轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱能力得到顯著提高。文檔編號A01H5/00GK101705234SQ20091027269公開日2010年5月12日申請日期2009年11月10日優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日發(fā)明者寧婧,熊立仲申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)