專利名稱：一種促進植物生長的蛋白質(zhì)納米復(fù)合體及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉藥物和植物病害防治領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種促進植物生長
的蛋白質(zhì)納米復(fù)合體的制備方法和應(yīng)用。采用藥物納米控釋系統(tǒng)，將有生物活性的植物
免疫激活劑Harpin蛋白與載體偶聯(lián)，制備納米粒子。該制劑能保護Harpin蛋白、促進植 物對藥物的吸收利用、增強或延長藥效作用，可提高其生物利用率，產(chǎn)生明顯的生物學 效果。這是一種高效、廣譜、安全的用于植物病害防治的新型生物農(nóng)藥。
背景技術(shù)：
植物病害、蟲害長期以來一直是威脅我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國民經(jīng)濟發(fā)展的主要農(nóng)業(yè) 災(zāi)害。農(nóng)作物每年因病蟲害造成的損失約20%，病蟲害各占一半。我國主要的植物病害 近3000種，分為細菌性、真菌性、病毒性病害，其中病毒病害900種。長期以來，植物 病害的防治一直依賴于化學殺菌劑。但是，化學殺菌劑的使用周期越來越短，導致其抗 藥性也越來越嚴重。另外，化學殺菌劑對許多病害是無能為力的。因此，發(fā)展新型的無 污染、無抗性的生物殺菌劑已經(jīng)成為當務(wù)之急。Harpin蛋白是引起蘋果、梨子等玫瑰香植物火疫病的病原菌Erwinia amvlovora hrpN基因編碼的一種蛋白。Harpin蛋白是細菌對寄主植物致病性必需的一種蛋白，但在 非寄主植物上能誘導過敏反應(yīng)，并誘導系統(tǒng)抗性，類似于高等動物所具有的廣譜抗病菌 蟲害的免疫反應(yīng)(WeiZ.M.， LabyR丄，ZumoffC.H.， Bauer D.W.， He S.Y.， CollmerA.， Beer S.V. 1992 ， Harpin， elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora.Science 257 : 5066 85-8)。
Harpin蛋白與植物細胞膜上的受體結(jié)合， 激活植物中多條信號通路，從而促進植物生長、增強抗病能力(Lee， J.， Klessig， D.R， Mirnberger， T. ， 2001 .A harpin binding site in tobacco plasma membranes mediates activation of the pathogenesis-related gene HINlindependent of extracellular calcium but dependent on mitogen-activated protein kinase activity.Plant Cell 13 : 1079-1093)。
因此，用Harpin蛋白 作為抗菌抑菌劑廣泛的應(yīng)用于作物保護，特別是單子葉植物和雙子葉植物，包括主要的 農(nóng)作物和經(jīng)濟作物、蔬菜等。 Harpin蛋白對植物病蟲害良好的防治效果吸引了國內(nèi)外科學家的關(guān)注，美國 Cornell大學的學者于1992年首先發(fā)現(xiàn)Harpin蛋白的抗菌抑菌功能，并與美國的EDEN Bioscience公司合作，在大腸桿菌中表達的Harpin蛋白于2000年通過美國環(huán)保局(EPA)批 準，商品名Messenger,批準號Reg.No.069834-002。 被稱為"在生防領(lǐng)域掀起了一場新 的革命"。Harpin蛋白防治植物病害具有不污染環(huán)境、不產(chǎn)生抗性等優(yōu)點。
納米技術(shù)是被國際上公認的21世紀最具有前途的科研領(lǐng)域。納米材料具有的共 性是粒度極小、表面積極大。根據(jù)對納米材料的研究，其表面部分是原子排列既無長程 有序又無短程有序的非晶層，而在其中心部位存在結(jié)晶有序和周期性排布的原子。正是 納米粒子的這種特殊結(jié)構(gòu)特點，導致了納米材料的特殊表面效應(yīng)和尺寸效應(yīng)。近年來， 納米科技在藥物遞送領(lǐng)域得到了令人矚目的進步，開發(fā)出多種形式的納米藥物。納米藥物的尺寸能明顯影響劑型和藥物遞送機制，例如顆粒粒徑在50-500nm的納米藥物具有 透皮吸收的特性，同時，用生物相容性高的可降解材料作為輔料，還可以達到緩控釋放 的效果(Shekunov， B.Y.， Chattopadhyay， P.， Tong， H.Y.， 2007.Particle size analysis in pharmaceutics: principles, methods and applications.Pharm.Res.24(2)， 203-227)。
采用納米控釋系統(tǒng)，利用Harpin蛋白研制的植物免疫激活劑Harpin蛋白質(zhì)納米 復(fù)合體，具有緩釋藥物，延長藥物作用時間；達到靶向輸送目的；在保證藥物作用的前 提下，減少給藥劑量，減輕或避免毒副反應(yīng)；提高藥物穩(wěn)定性等特性。這對于提高生物 利用率、保護環(huán)境、保障我國人民的身體健康，具有重要的意義。Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù) 合體是一種安全的新型生物農(nóng)藥，用于植物病害的防治具有高效、廣譜、不污染環(huán)境的 優(yōu)點，具有較好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種促進植物生長的蛋白質(zhì)納米復(fù)合體。該納米復(fù) 合體中包含Harpin蛋白和載體。Harpin蛋白可以誘導植物的抗病性。Harpin蛋白通過 與植物表面的受體HrBPl結(jié)合，激活植物自身的防御機能。Harpin蛋白本身對細菌、病 毒、真菌，線蟲、昆蟲無殺滅或抑制作用，而是通過與植物受體結(jié)合后產(chǎn)生某種信號， 剌激或誘導植物自身的免疫機制來保護植物。因而Harpin具有廣譜的抗病作用，減少 植物病害發(fā)生。Harpin還能促進植物的生長和發(fā)育，如增加植株的個體和根量、促進種 子的萌發(fā)、植物的早熟和結(jié)實，提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。此外，Harpin蛋白可以提高蔬 菜、水果抗腐爛、霉變能力，延長貯藏時間。 Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù)合體中的載體是超微粒載體，如聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚 物、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚己內(nèi)酯、聚氰基丙烯酸烷基酯和聚己內(nèi)酯等其中的一種。 采用藥物納米控釋系統(tǒng)，將有生物活性的植物免疫激活劑Harpin蛋白與載體偶聯(lián)，制備 蛋白質(zhì)納米復(fù)合體。該蛋白質(zhì)納米復(fù)合體能保護Harpin蛋白、促進植物對藥物的吸收利 用、增強或延長藥效作用，可提高其生物利用率，產(chǎn)生明顯的生物學效果。
本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種制備所述蛋白質(zhì)納米復(fù)合體的方法。所 制備的蛋白質(zhì)納米復(fù)合體顆粒平均直徑為190.5nm，納米顆粒中72.5%納米顆粒直徑小于 225nm。 Harpin蛋白位于納米復(fù)合體內(nèi)部。該Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù)合體具有納米控釋系 統(tǒng)特有的性質(zhì)，使其在藥物輸送方面具有許多優(yōu)越性(l)可緩釋Harpin蛋白，從而延長 Harpin蛋白作用時間；(2)可達到靶向輸送的目的；(3)可在保證Harpin蛋白作用的前提 下，減少給藥劑量；(4)可提高Harpin蛋白的穩(wěn)定性，有利于儲存；(5)可用以建立一些 新的給藥途徑。這都是其他輸送體系所無法比擬的。 在本發(fā)明的第三個方面，提供一種藥物組合物，該組合物包含有效劑量的上述 蛋白質(zhì)納米復(fù)合體。 在本發(fā)明的第四個方面，提供上述蛋白質(zhì)納米復(fù)合體或藥物組合物在制備預(yù)防 或治療植物病害藥物中的應(yīng)用。 為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施 在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種制備Harpin蛋白質(zhì)的方法。采用含有 harpin基因的工程菌株E.coli BL21(中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC M202026),誘導表達基因工程重組Harpin蛋白(rHrpZ蛋白，rHrpZ)。離心收集菌體，懸浮。超聲波破碎 離心收集上清。采用Ni-NTASuperflow柱(Qiagen公司產(chǎn)品)，按照Qiagen公司操作手 冊純化Harpin蛋白。PBS緩沖液(pH7.3)透析處理純化的Harpin蛋白。采用SDS-PAGE 電泳和HPLC方法，檢測Harpin蛋白的純度。采用Bradford assay法，測定Harpin蛋白濃度。 在本發(fā)明的一個實施方案中，提供一種制備所述Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù)合體的方 法。該方法包括以下步驟 A、將PLGA(聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物，lactide : glycolide = 75 : 25，分 子量40000)溶解在二氯甲烷中，配成50mg/mL溶液。將0.5mL 20mg/mL Harpin蛋白緩 慢滴加到5mL 50mg/mL PLGA溶液中，同時用超聲波破碎儀乳化(50W處理1分鐘)，形 成油包水(W/0)乳液。 B、將油包水乳液立即倒入50mL 2% PVA(poly vinyl alcohol,分子量70,000)水 溶液中，超聲波乳化(100W處理2分鐘)形成W/O/W乳液。 C、將W/O/W乳液倒入蒸餾瓶中，4(TC減壓蒸餾2小時除去二氯甲烷，固化 PLGA，構(gòu)成Harpin-PLGA蛋白質(zhì)納米復(fù)合體，其中包裹Harpin蛋白。
D、用40mL的蒸餾水，將形成的PLGA-Harpin納米粒懸浮，10000g離心20分 鐘，收集沉淀。沉淀重懸于蒸餾水中，重復(fù)此過程3次以洗凈Harpin-PLGA蛋白質(zhì)納米 復(fù)合體外的PVA，最后將Harpin-PLGA蛋白質(zhì)納米復(fù)合體重懸于蒸餾水中備用。
在本發(fā)明的一個實施方案中，測定了 Harpin蛋白納米復(fù)合體顆粒的直徑。用 動態(tài)光散射顆粒直徑檢測儀測定，合成的rHrpZ-PLGA納米復(fù)合體顆粒平均直徑為 190.5nm，，納米顆粒中72.5%納米顆粒直徑小于225nm。 在本發(fā)明的一個實施方案中，測定了 Harpin蛋白納米復(fù)合體包封率和釋放速 率。rHrpZ-PLGA納米顆粒對rHrpZ的包封率約為62.3X，體外釋放試驗顯示，有51.0% 的rHrpZ在前2天時間內(nèi)從rHrpZ-PLGA顆粒中被釋放出來，而92.7%的rHrpZ在3周內(nèi) 從rHrpZ-PLGA顆粒中釋放出來。說明rHrpZ-PLGA顆粒具有較好的緩控釋放作用。
在本發(fā)明的一個實施方案中，測定了 Harpin蛋白納米復(fù)合體活性。通過檢測苯 丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)， 領(lǐng)lj定Harpin蛋白纟內(nèi)米復(fù)合體活性，石角 定Harpin蛋白納米復(fù)合體對煙草葉片中防御性物質(zhì)PAL的誘導作用，并與Harpin蛋白的 作用進行比較。試驗中，第一次噴灑rHrpZ蛋白后PAL活性變化幅度明顯大于第二次， 且噴灑rHrpZ蛋白后對PAL活性的影響僅限于14小時內(nèi)。噴灑rHrpZ-PLGA納米復(fù)合 體后，PAL活性變化雖然沒有第一次噴灑rHrpZ蛋白變化幅度大，但是PAL活性增強效 果的延續(xù)時間長達2周以上。試驗結(jié)果表明，rHrpZ-PLGA納米復(fù)合體(rHrpZ-PLGA NP) 能幫助rHrpZ蛋白進入煙草葉片，并在煙草體內(nèi)能緩慢逐步釋放出rHrpZ蛋白，不斷地剌 激PAL活性增強，達到延長時效的作用。 在本發(fā)明的一個實施方案中，測定了 Harpin蛋白納米復(fù)合體對植物抗病作用的 影響。Harpin蛋白可誘導煙草中PR-5dB基因的表達，PR-5dB基因是一類植物病程相 關(guān)蛋白基因，其轉(zhuǎn)錄表達能夠有助于植物抵抗病原菌的侵襲。該基因的表達量與植物抗 病能力直接相關(guān)。根據(jù)PR-5dB基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，評價rHrpZ蛋白和rHrpZ-PLGA NP(rHrpZ-PLGA納米復(fù)合體)的藥效，結(jié)果顯示，rHrpZ蛋白噴施后能快速剌激PR-5dB轉(zhuǎn)錄水平提高，與PAL酶活變化類似，PR-5dB轉(zhuǎn)錄水平提高效果維持時間較短，不超過 48小時。而rHrpZ-PLGA NP對PR-5dB轉(zhuǎn)錄水平的提升作用能維持超過2周，藥效為噴 施同等濃度rHrpZ蛋白的5倍，在煙草內(nèi)實現(xiàn)了持續(xù)緩控釋放，長期有效的發(fā)揮作用，明 顯提高了rHrpZ蛋白的生物利用度，在田間施用時可以避免或減少施用次數(shù)，降低人力 成本。 在本發(fā)明的一個實施方案中，測定了 Harpin蛋白納米復(fù)合體對茄科雷爾氏菌 (Ralstonia solanacearam)感染攻擊保護效力。茄科雷爾氏菌是茄科植物細菌性青枯病的病 原菌，用茄科雷爾氏菌作為典型煙草病原細菌，檢測rHrpZ蛋白和rHrpZ-PLGANP的藥 效。試驗結(jié)果表明rHrpZ蛋白提高了煙草抵抗茄科雷爾氏菌感染的效力。在同等有效 rHrpZ蛋白含量的情況下，Harpin蛋白納米復(fù)合體(rHrpZ-PLGANP)的藥效明顯高于單一 rHrpZ蛋白，能夠長時間剌激植物增強抵抗力，促進煙草生長。 本發(fā)明還涉及Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù)合體在制備治療或預(yù)防抗細菌感染的藥物中 的應(yīng)用。 本發(fā)明還涉及Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù)合體在制備治療或預(yù)防抗真菌感染的藥物中 的應(yīng)用。 本發(fā)明還涉及Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù)合體在制備治療或預(yù)防抗病毒感染的藥物中 的應(yīng)用。 本發(fā)明的優(yōu)點如下 (l)Harpin蛋白與超微粒載體偶聯(lián)后，可提高其生物利用率。
(2)將Harpin蛋白適當包裹，能保護蛋白質(zhì)。 (3)能促進植物對蛋白質(zhì)藥物的吸收利用，作用增強或延長，產(chǎn)生明顯的生物學 效果。 (4)使用簡單、安全。 (5)抗病廣譜、不污染環(huán)境。該蛋白質(zhì)納米復(fù)合體可以用于植物病害的防治、促 進植物的生長、提高農(nóng)作物產(chǎn)量。采用納米控釋系統(tǒng)，Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù)合體具有緩釋Harpin蛋白質(zhì)藥物，延 長Harpin蛋白質(zhì)藥物作用時間；達到靶向輸送目的；在保證Harpin蛋白質(zhì)藥物作用的前 提下，減少給Harpin蛋白質(zhì)藥劑量；提高藥物穩(wěn)定性等特性。這對于提高生物利用率、 保護環(huán)境、保障我國人民的身體健康，具有重要的意義。


本發(fā)明的上述和其它目的，特點和優(yōu)勢可顯而易見地從下面對本發(fā)明優(yōu)選實施 例的詳細描述和附圖示出的內(nèi)容得到，不同視圖中相同的參考符號代表相同的部分。附 圖并不一定是按比例示出，其重點在于說明本發(fā)明的實施和效果。 圖1.10 % SDS-PAGE檢測rHrpZ蛋白質(zhì)純化純度圖譜CL : rHrpZ粗提液FT : rHrpZ粗提液從Ni-NTA Superflow柱上穿漏液El-E5 :分部收集的rHrpZ洗脫液M :中分 子量蛋白質(zhì)Marker(北京TIANGEN)
圖2 : HPLC C8柱檢測rHrpZ蛋白純度圖譜 圖3動態(tài)光散射顆粒直徑檢測儀測定rHrpZ-PLGA納米復(fù)合體顆粒直徑
圖4rHrpZ-PLGA納米復(fù)合體誘導PAL活性測定 A:第一次噴灑rHrpZ后，煙草PAL活性變化 B :第二次噴灑rHrpZ后，煙草PAL活性變化 C:噴灑rHrpZ-PLGA納米顆粒后，煙草PAL活性變化 圖5rHrpZ-PLGA納米復(fù)合體誘導PR-5dB基因轉(zhuǎn)錄測定 A:噴灑rHrpZ后，PR-5dB基因轉(zhuǎn)錄水平變化 B :噴灑rHrpZ-PLGANP后，PR-5dB基因轉(zhuǎn)錄水平變化 圖6rHrpZ蛋白、rHrpZ-PLGA NP施藥后煙草抗茄科雷爾氏菌侵染效果圖譜 A噴灑含20ug/mL rHrpZ的rHrpZ-PLGA NP B噴灑20ug/mL rHrpZ蛋白 C噴灑PBS
具體實施例方式
通過結(jié)合下述具體實施例，闡明本發(fā)明。但是，應(yīng)理解的是，這些實施例僅用 于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。在本專利本實施例中，Harin蛋白以基因工程 重組Harpin蛋白(rHrpZ蛋白，rHrpZ)為例進行說明。
實施例1 : Harpin蛋白質(zhì)的制備
1 .Harpin蛋白質(zhì)的純化 采用含有harpin基因的工程菌株E.coli BL21(中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC M202026),誘導表達基因工程重組Harpin蛋白(rHrpZ蛋白，rHrpZ)。 挑取用甘油保存 的菌種，接種于含200iig/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基lL:蛋白胨 10g，酵母粉5g， NaC110g，溶解在800ml雙蒸水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加水定容 至1000ml)中，37°C， 200r/min下振蕩培養(yǎng)8-12h。次日按4%量接種于新鮮含200 y g/mL 氨芐青霉素的2YT液體培養(yǎng)基(蛋白胨16g，酵母粉10g， NaC15g，溶解在800ml雙蒸水 中，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加水定容至1000ml)中，在37。C， 200r/min條件下振蕩培 養(yǎng)至OD600值約為0.6-0.8時，加入誘導物IPTG(異丙基-P -D-硫代半乳糖苷，Promega 公司產(chǎn)品)至終濃度為0.4mM， 37t:下誘導表達，誘導后4小時，4000r/min離心20分鐘 收集菌體。 將收集到的菌體重懸于Lysis Buffer中(50mmol/L NaH2P04 0.5mol/L NaCl 20mmol/L咪唑，pH8.0)，超聲波破碎(200W， IO分鐘)。12000rpm離心20分鐘后收取 上清為rHrpZ蛋白粗提液。 rHrpZ蛋白粗提液以lmL/min速率穿過2mL Ni-NTA Superflow柱(Qiagen公 司產(chǎn)品)兩次，用50柱床體積的Lysis Buffer以同樣速率清洗柱床，再用20mL Elute Buffer(50mmol/L NaH2PO40.5mol/L NaCl 250mmol/L咪唑，pH8.0)洗脫，收集目的蛋白 rHrpZ。 將經(jīng)N廣柱洗脫、收集的rHrpZ蛋白純化樣品裝入經(jīng)處理的透析袋中，放入盛有 lOOOmL PBS緩沖液(20mmol/L NaH2P04， pH7.4)燒杯中透析，透析24小時，其間4次 更換透析PBS。透析后的蛋白用聚乙二醇(分子量約為20000)濃縮過夜。以上操作均在
4t:進行。
2.Harpin蛋白質(zhì)純度的測定 參照《分子克隆》，用10% SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍R250染色檢測rHrpZ 蛋白質(zhì)純度。結(jié)果如附圖l所示。采用高壓液相色譜法(HPLC)檢測Harpin蛋白的純度。流動相設(shè)置為A水；B 甲醇；C乙腈；D 50mM PBS pH6.0。
Agilent 1100HPLC系統(tǒng)管道排氣后，安裝C8柱， 柱溫設(shè)定為2(TC，開紫外燈檢測，測定吸收波長280nm，流速lml/min，用70%甲醇洗 C8柱至基線平穩(wěn)，用5%乙腈，95XPBS平衡柱子至基線水平，開進樣環(huán)，進樣20iiL。 洗脫時，0-5min， 5%乙腈、95%PBS; 6-30min， 5-50%乙腈線性梯度，其余為PBS。 C8 柱檢測rHrpZ蛋白純度如附圖2所示。經(jīng)軟件分析，圖譜上為單一峰，證實純化的rHrpZ 蛋白純度達到色譜純度。
3.Harpin蛋白質(zhì)含量的測定 純化后的rHrpZ蛋白用PBS(20mmol/L NaH2P04， pH7.4)透析24小時，其間4 次更換透析PBS。透析好后的蛋白用聚乙二醇(分子量約為20000)濃縮。采用Bradford 法，濃縮后的rHrpZ蛋白用TIANGEN Bradford蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(TIANGEN公司產(chǎn) 品)測定蛋白質(zhì)濃度，最后用PBS調(diào)整rHrpZ蛋白濃度為20mg/mL。
Bradford法具體操作如下 (l)將O、 1、 2、 3、 4、 5、 6 ii L lmg/ml牛血清白蛋白(BSA)標準溶液依次加入 酶標微孔板中，用PBS補足50 ii L。 (2)向每孔中加入200 ii L Bradford試劑工作液(0.1 X考馬斯亮藍G250， 5%乙 醇，8.5%磷酸)。振蕩、混勻后，室溫放置2分鐘。(3)用酶標儀測BSA蛋白各濃度的OD570值(A = 570nm)。以BSA蛋白質(zhì)濃
度為橫坐標，以BSA蛋白各濃度的OD570值為縱坐標制作標準曲線。 (4)用同樣方法測定樣品的OD570值，用標準曲線中確定樣品的濃度。 實施例2 : Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù)合體的制備 稱取250mg PLGA(poly d， l-lactide-co-glycolide， lactide : glycolide = 75 : 25， 分子量40000，山東雁翎化工有限公司產(chǎn)品)，溶解于5mL二氯甲烷中，配成50mg/mL溶 液。將0.5mL 20mg/mL rHrpZ緩慢滴加到5mL 50mg/mL PLGA溶液中(控制0.5分鐘內(nèi) 滴完)，同時用超聲波破碎儀乳化(50W處理l分鐘)形成油包水(W/O)乳液，將油包水 乳液立即倒入50mL 2%聚乙烯醇(poly vinyl alcohol, PVA，分子量70,000)水溶液中。超 聲波乳化(100W處理2分鐘)形成W/0/W乳液。將W/0/W乳液倒入蒸餾瓶中，4(TC減 壓蒸餾2小時除去二氯甲烷，使PLGA固化形成納米顆粒，即構(gòu)成rHrpZ-PLGA納米復(fù)合 體(rHrpZ-PLGANP)。 將形成的rHrpZ-PLGA納米復(fù)合體顆粒懸液，10000g離心20分鐘，收集沉淀。 將rHrpZ-PLGA納米復(fù)合體顆粒重懸于40mL蒸餾水中，再離心，重復(fù)此過程3次，以洗 凈納米顆粒外的PVA。最后，獲得的rHrpZ-PLGA蛋白質(zhì)納米復(fù)合體懸于蒸餾水中備用。
實施例3 : Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù)合體顆粒直徑的測定 制備的rHrpZ-PLGA納米顆粒重懸于10ml水中，取3ml加入到石英比色皿中， 樣品溫度設(shè)定為20°C 。用動態(tài)光散射顆粒直徑檢測儀測定合成的rHrpZ-PLGA納米復(fù)合 體顆粒直徑。檢測結(jié)果表明，制備的納米顆粒中72.5X納米顆粒直徑小于225nm，平均顆粒直徑為190.5nm。納米顆粒直徑分布如附圖3所示。 實施例4 : Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù)合體包封率和釋放速率的測定l.rHrpZ-PLGA納
米復(fù)合體包封率的測定 rHrpZ-PLGA納米顆粒重懸于IOOI水中，加入lml冷丙酮，混勻，-20°〇冷凍1 小時，20000g離心10分鐘，沉淀用冷丙酮洗滌兩次，離心，沉淀于37t:下將丙酮揮發(fā)干 凈，溶解于50iU水中，Bradford法測定rHrpZ蛋白質(zhì)含量。 包封率二納米顆粒內(nèi)含rHrpZ質(zhì)量/制備時實際使用rHrpZ質(zhì)量X 100 % rHrpZ-PLGA納米顆粒對rHrpZ的包封率約為62.3% 。
2.rHrpZ-PLGA納米復(fù)合體釋放速率的測定 將rHrpZ-PLGA納米復(fù)合體顆粒重懸于PBE溶液中(20mM NaH2P04 ， lmM EDTA， pH7.4)， 25。C下于搖床上緩慢搖動4周，取樣測定蛋白質(zhì)釋放效率。將取得的納 米顆粒懸浮液10000g離心20分鐘，收集沉淀。沉淀溶解于預(yù)冷的丙酮中，在-2(TC靜置 l小時以沉淀蛋白質(zhì)，隨后10000g離心10分鐘，沉淀晾干揮發(fā)完全丙酮后，溶解于lmL 蒸餾水中。蛋白質(zhì)溶液用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，并計算rHrpZ-PLGA納米顆粒釋 放速率。 釋放率=(1-納米顆粒內(nèi)殘留rHrpZ質(zhì)量/納米顆粒初始封rHrpZ質(zhì)量)X 100%
rHrpZ-PLGA納米顆粒對rHrpZ的包封率約為62.3%，體外釋放試驗顯示，有 51.0%的rHrpZ在前2天時間內(nèi)從rHrpZ-PLGA顆粒中被釋放出來，而92.7%的rHrpZ在 3周內(nèi)從rHrpZ-PLGA顆粒中釋放出來。說明rHrpZ-PLGA顆粒具有較好的緩控釋放作 用。 實施例5 : Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù)合體活性的測定 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)是植物和微生物連接初級代 謝和苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)酶，是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶。苯丙烷類代謝途 徑是植物代謝中一條很重要的途徑，所有含苯丙烷骨架的物質(zhì)都由這一途徑直接或間接 生成。苯丙烷類代謝可生成類黃酮、木質(zhì)素等多種次級代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在植物的生 長發(fā)育、抗病、抗逆反應(yīng)中起著重要的作用。(董艷珍，植物苯丙氨酸解氨酶基因的研究 進展。生物技術(shù)通報，2006，增刊，31-33) 苯丙氨酸解氨酶是植物防衛(wèi)反應(yīng)中起重要作用的酶，通過檢測PAL，測定 Harpin蛋白納米復(fù)合體活性，確定Harpin蛋白納米復(fù)合體對煙草葉片中防御性物質(zhì)PAL 的誘導作用，并與Harpin蛋白的作用進行比較。
l.樣品處理 取9株健康的煙草植株，分成3組，每組3株，并分別用3組樣品噴灑。該3 組樣品分別為(1)10 ii g/mL rHrpZ蛋白溶液樣品；(2)10 y g/mL rHrpZ的rHrpZ-PLGA納 米復(fù)合體樣品；(3)PBS緩沖液。 在噴灑后，采集煙葉葉片樣品，稱重，置于EP管中，-201:保存?zhèn)溆谩?
2.苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定 取約0.2-0.8g葉片，剪小，分別放入冰預(yù)冷的研缽內(nèi)，加入3-5mL預(yù)冷含 5mmol/L巰基乙醇的硼酸(O.lmol/L硼酸，pH8.8)緩沖液，加0.05g聚乙烯吡咯烷酮，冰 浴研磨成漿，4。C下4800r/min離心25min，上清為PAL酶粗提液。
PAL酶活反應(yīng)體系(3.1ml) : 0.1ml酶液；1ml 0.02mol/L苯丙氨酸；2ml蒸餾水 對照不加底物(酶粗提液)，多加0.1ml蒸餾水。反應(yīng)液置恒溫水浴鍋中30°C 保溫30min，立即放入冰浴，力B 0.25ml 5mol/L HC1終止反應(yīng)。每種反應(yīng)液取3ml到比色 皿中，用UV-120-02型紫外分光光度計測290nm波長下的吸光度。各重復(fù)3次，取平均值。 PAL酶活性二 (AOD290nmXVT)/(0.01XWFXVSXt)
反應(yīng)時間內(nèi)290nm波長下吸光值變 A OD290腿
化VT 提取PAL酶液總體積(ml) WF 葉片鮮重(g) VS 測定時取用PAL酶液體積(ml) t 反應(yīng)時間(min) PAL酶活變化如附圖4。從圖4中可見，第一次噴灑rHrpZ蛋白后PAL活性變 化幅度明顯大于第二次，且噴灑rHrpZ蛋白后對PAL活性的影響僅限于14小時內(nèi)。這 是由于rHrpZ蛋白能剌激PAL活性上升。而PAL是木質(zhì)素形成的關(guān)鍵酶，也是其形成的 限速酶，由于PAL活性上升，木質(zhì)素快速形成，致使植物細胞壁由初生細胞壁快速向次 生細胞壁發(fā)展，同時導致細胞壁通透性下降。由于細胞壁通透性的下降，使得更少的蛋 白質(zhì)能通過細胞壁與細胞膜上的受體結(jié)合發(fā)生作用，所以第二次噴灑同樣濃度rHrpZ蛋 白比第一次噴灑的藥效明顯降低。而噴灑rHrpZ-PLGA納米復(fù)合體后，PAL活性變化雖 然沒有第一次噴灑rHrpZ蛋白變化幅度大，但是PAL活性增強效果的延續(xù)時間長達2周 以上。試驗結(jié)果表明，rHrpZ-PLGA納米復(fù)合體(rHrpZ-PLGANP)能幫助rHrpZ蛋白進 入煙草葉片，并在煙草體內(nèi)能緩慢逐步釋放出rHrpZ蛋白，不斷地剌激PAL活性增強， 達到延長時效的作用。 實施例6 : Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù)合體對植物抗病作用的影響 Harpin蛋白可誘導煙草中PR-5dB基因的表達，PR-5dB基因是一類植物病程相 關(guān)蛋白基因，其轉(zhuǎn)錄表達能夠有助于植物抵抗病原菌的侵襲。該基因的表達量與植物抗 病能力直接相關(guān)，可作為研究Harpin蛋白藥效的重要依據(jù)。 用反轉(zhuǎn)錄PCR半定量方法測定煙草病程相關(guān)蛋白PR-5dB基因轉(zhuǎn)錄水平變化。 采用實施例5中測定PAL酶活性相同的方法，分別噴灑rHrpZ蛋白和rHrpZ-PLGA NP樣 品，并設(shè)PBS樣品對照。
l.煙草總RNA的提取 煙草植株經(jīng)rHrpZ蛋白、rHrpZ-PLGA NP納米復(fù)合體和PBS樣品處理后，取少 量葉片用Trizol試劑按如下步驟提取總RNA。(1)樣品加入氯仿(200 ii 1/mlTrizo1)100 y 1，劇烈振蕩30秒，室溫靜置15分鐘；
(2)12000g離心15分鐘； [O104] (3)取上層水相；(4)加入等體積異丙醇室溫(20-25°C以下相同)靜置30分鐘；
(5)12000g離心10分鐘，去上清；
(6)加入75%乙醇(lml/mlTrizol)500 u 1，懸浮沉淀; (7)8000g， 4"離心5min去上清，重復(fù)步驟6、 7兩次，室溫干燥； (8)用20 ii L RNA Free H20溶解沉淀。 (9)RNA甲醛-瓊脂糖電泳鑒定。 2.引物設(shè)計與合成 為了對比PR-5dB在植物體內(nèi)表達的相對含量，以actin基因的轉(zhuǎn)錄水平為內(nèi)參c 根據(jù)actin基因及PR-5dB基因設(shè)計引物(表1)，引物由上海生工公司合成。 表1 Sequences of gene-specific primers used in RT-PCR analysis
G咖
3Vrimer (5*to 30
Product
sizc(bpjdo.
扁1週2
PR-5dB
ACTTTOATGGTGCTGGTAGAGTAGGCATCTCCAATGGGA 510
AB121785
:0115] 3.cDNA合成
:0116] 溶解后的RNA按如下配比制備反轉(zhuǎn)錄體系，用TOYOBO公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將
mRNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。 反轉(zhuǎn)錄體系組分 5X反轉(zhuǎn)錄溶液 4iiL dNTPs(10mM) 2 ii L 反轉(zhuǎn)錄酶 liiL Oligo(dT)20(10pmol/ U L)1 y 1 RNA酶抑制劑 lyl 總RNA XiU 水 11-XiU 反轉(zhuǎn)錄條件 42 °C 20分鐘 99 °C 5分鐘 4°C 5分鐘 4.PCR反應(yīng) 將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA作為模板，進行PCR擴增。向無菌PCR管中加下述組 分，用移液槍抽吸混勻。1000rpm離心10sec后，將PCR管置于PCR儀上。
:0131] PCR反應(yīng)體系
:0132] 10 X PCR buffer(La) 2.5 ii 1
:0133] dNTPs(2.5mM) 1P 1
:0134] MgCl2(25mM) 1.5 iU
上游引物(20iiM) 2iU 下游引物(20iiM) 2iU 模板 2iU Taq DNA聚合酶 1 P 1 _ 補無菌ddH20至 25 ii 1 PCR反應(yīng)條件 94 °C 2min; 94 °C 30s 57 °C 30s 72 °C 45s， 28次； 72 °C 5min 4°C 15min。 取5iUPCR產(chǎn)物于1.0X瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙碇染色，紫外燈下觀察擴增 結(jié)果。將電泳結(jié)束后的凝膠經(jīng)數(shù)碼成像并分析，記錄各條帶量的不同。用1D灰度分析 軟件分析條帶灰度值，條帶灰度值與PCR產(chǎn)物質(zhì)量成正比。將每種樣品的PR-5dB條帶 灰度值除以該樣品actin基因擴增條帶灰度值得到該樣品中PR-5dB的相對表達量，以降 低實驗誤差。根據(jù)各組試驗中PR-5dB相對表達量，繪制PR-5dB基因轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢 圖，如附圖5。根據(jù)PR-5dB基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，評價rHrpZ蛋白禾P rHrpZ-PLGA NP(rHrpZ-PLGA納米復(fù)合體)的藥效，用以下公式計算藥效
藥效=曲線下面積-初始PR-5dB相對表達量X藥效持續(xù)時間
結(jié)果顯示，rHrpZ蛋白噴施后能快速剌激PR-5dB轉(zhuǎn)錄水平提高，與實施例5 中PAL酶活變化類似，PR-5dB轉(zhuǎn)錄水平提高效果維持時間較短，不超過48小時。而 rHrpZ-PLGA NP對PR-5dB轉(zhuǎn)錄水平的提升作用能維持超過2周，藥效為噴施同等濃度 rHrpZ蛋白的5倍，在煙草內(nèi)實現(xiàn)了持續(xù)緩控釋放，長期有效的發(fā)揮作用，明顯提高了 rHrpZ蛋白的生物利用度，在田間施用時可以避免或減少施用次數(shù)，降低人力成本。
實施例7 : Harpin蛋白質(zhì)納米復(fù)合體對植物抗茄科雷爾氏菌感染攻擊保護試驗
茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearam)是茄科植物細菌性青枯病的病原菌，青枯 病是在全世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)作的茄科植物重要疾病，給農(nóng)作物生產(chǎn)帶來巨大的損失。用 茄科雷爾氏菌作為典型煙草病原細菌，檢測rHrpZ蛋白和rHrpZ-PLGANP的藥效。
茄科雷爾氏菌用下述培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。
成分含量CL)
水解酪蛋白I接
酵母裔
蔗糖
MgS040,2錢
KH2P042.8窩用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2。 取lmL過夜培養(yǎng)的茄科雷爾氏菌12000rpm離心5分鐘，將菌體重懸于lmL雙蒸 水中。取長勢均等的煙草3株，以每株5iiL的劑量將茄科雷爾氏菌懸液注射入煙草離土 0.5cm處的主莖中。同時，三株煙草分別噴灑PBS、 20ug/mLrHrpZ蛋白溶液、含20ug/ mL rHrpZ的rHrpZ-PLGA NP，觀察10天后發(fā)病狀況。煙草生長和發(fā)病情況如附圖6。
IO天后噴灑PBS的煙草明顯發(fā)病，葉片巻縮、色澤黯沉，噴灑rHrpZ蛋白的煙 草葉片長勢較好、色澤較為光亮；而噴灑rHrpZ-PLGANP的煙草長勢極為旺盛，葉片色 澤鮮亮。試驗結(jié)果表明rHrpZ蛋白提高了煙草抵抗茄科雷爾氏菌感染的效力。在同等有 效rHrpZ蛋白含量的情況下，Harpin蛋白納米復(fù)合體(rHrpZ-PLGANP)的藥效明顯高于單 一rHrpZ蛋白，能夠長時間剌激植物增強抵抗力，促進煙草生長。
0159]SEQUENCE LISTING
0160]<110>武漢大學
0161]<120> —種促進植物生長的蛋白質(zhì)納米復(fù)合體及制備方法和應(yīng)用
0162]<130> —種促進植物生長的蛋白質(zhì)納米復(fù)合體及制備方法和應(yīng)用
0163]<140>2009102722035
0164]<141>2009-09-23
0165]<160>4
0166]<170>PatentIn version 3.1
0167]<210>1
0168]<211>20
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0170]<213>人工合成
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0172]agtaagcaac tgggacgata 20
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0174]<211>20
0175]<212>DNA
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0178]ccactaagga cgatgtttcc 20
<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3actttgatgg tgctggtaga 20<210>4<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>4gtaggcatct ccaatggga 19
權(quán)利要求
一種促進植物生長的蛋白質(zhì)納米復(fù)合體，其特征在于，該納米復(fù)合體中包含Harpin蛋白和載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于該載體是超微粒載體，超微粒載體為 聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚己內(nèi)酯、聚氰基丙烯酸烷基酯或 聚己內(nèi)酯。
3. 權(quán)利要求1所述的一種制備蛋白質(zhì)納米復(fù)合體的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1) 將PLGAlactide : glycolide = 75 : 25，分子量40000溶解在二氯甲烷中，配成 50mg/mL溶液，將0.5mL 20mg/mL Harpin蛋白緩慢滴加到5mL50mg/mL PLGA溶液中， 同時用超聲波破碎儀乳化50W處理1分鐘形成油包水W/0乳液；(2) 將油包水乳液倒入50mL 2% PVA水溶液中，超聲波乳化100W處理2分鐘形成w/o/w乳液；(3) 將W/0/W乳液倒入蒸餾瓶中，4(TC減壓蒸餾2小時除去二氯甲烷，固化PLGA， 制備PLGA-Harpin納米粒，其中包裹Harpin蛋白；(4) 用40mL的蒸餾水，將形成的PLGA-Harpin納米粒懸浮，lOOOOg離心20分鐘，收集沉淀，沉淀重懸于蒸餾水中，重復(fù)此過程3次以洗凈納米顆粒外的PVA，最后將納米 顆粒重懸于蒸餾水中備用。
4. 如權(quán)利要求3所述一種蛋白質(zhì)納米復(fù)合體的制備方法，其特征在于，所述的PLGA 為納米乳劑。
5. —種藥物組合物，其特征在于該組合物包含有效劑量的權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)納 米復(fù)合體。
6. 權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)納米復(fù)合體或權(quán)利要求5所述的藥物組合物在防治植 物病害藥物中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)納米復(fù)合體在制備治療或預(yù)防抗細菌感染的藥物中的 應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)納米復(fù)合體在制備治療或預(yù)防抗真菌感染的藥物中的 應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)納米復(fù)合體在制備治療或預(yù)防抗病毒感染的藥物中的 應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進植物生長的蛋白質(zhì)納米復(fù)合體及制備方法和應(yīng)用。采用藥物納米控釋系統(tǒng)，將有生物活性的植物免疫激活劑Harpin蛋白與載體偶聯(lián)，制備納米復(fù)合體。通過分離與純化，獲得具有生物活性的Harpin蛋白。采用PLGA和PVA，通過超聲技術(shù)制備納米粒，其中包裹Harpin蛋白，構(gòu)成載有Harpin蛋白的PLGA-蛋白質(zhì)納米復(fù)合體。采用本發(fā)明制備的蛋白質(zhì)納米復(fù)合體具有以下優(yōu)點(1)Harpin蛋白與超微粒載體偶聯(lián)后，可提高其生物利用率。(2)將Harpin蛋白適當包裹，能保護蛋白質(zhì)。(3)能促進植物對蛋白質(zhì)藥物的吸收利用，作用增強或延長，產(chǎn)生明顯的生物學效果。(4)使用簡單、安全。(5)抗病廣譜、不污染環(huán)境。該蛋白質(zhì)納米復(fù)合體可以用于植物病害的防治、促進植物的生長、提高農(nóng)作物產(chǎn)量。
文檔編號A01P3/00GK101690492SQ20091027220
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日
發(fā)明者孟小林, 徐進平, 梁焯, 王健 申請人:武漢大學