專利名稱：細(xì)胞程序性死亡基因OsPDCD5在提高水稻耐鹽性方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高水稻耐鹽性的方法。
背景技術(shù)：
水稻是我國主要的糧食作物，在國民經(jīng)濟(jì)中占有極其重要的位置。目前我國水稻生產(chǎn)已達(dá)到相當(dāng)高的水平，要進(jìn)一步提高水稻總產(chǎn)量，主要從兩方面入手一是培育優(yōu)良品種，繼續(xù)提高單位面積產(chǎn)量；另一方面是擴(kuò)大種植面積，在水資源可能的條件下，開發(fā)鹽堿地。鹽害是水稻生產(chǎn)上最重要的非生物逆境危害之一。我國的鹽堿土地面積達(dá)到了一億公頃，受鹽侵害的稻田約占栽培面積的五分之一。并且土壤鹽漬化有日益擴(kuò)大和加劇的趨勢，造成的產(chǎn)量損失己難以估算。培育耐鹽抗旱水稻品種及通過遺傳改良提高作物的抗逆性，是解決這一農(nóng)業(yè)問題的最有效途徑之一。國內(nèi)外學(xué)者研究了鹽分對植物的傷害及植物耐鹽的機(jī)理，克隆并轉(zhuǎn)化了一些耐鹽相關(guān)基因，獲得了一些耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植株，但遠(yuǎn)沒有達(dá)到生產(chǎn)應(yīng)用的水平。程序性細(xì)胞死亡(P⑶)是一種自身調(diào)控的主動死亡形式，是多細(xì)胞生物正常生命活動的一部分，是植物發(fā)育過程中及環(huán)境脅迫情況下自身啟動的重要程序。徹/^^^基因是水稻中的一個程序性細(xì)胞死亡基因，高鹽脅迫能夠誘導(dǎo)其表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出水稻0sPDCD5基因在提高水稻耐鹽性方面的應(yīng)用。本發(fā)明利用水稻程序性死亡基因fls/^O^，將其反向?qū)胨净蚪M中，用以提高水稻的耐鹽性；實施例中，本發(fā)明將水稻0sPDCD5基因反向?qū)胫谢?1基因組中，使中花 11耐鹽性得到顯著提高。即采用中花11為轉(zhuǎn)基因受體，構(gòu)建anti-fls/^O^轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明還提供一種anti-fls/^O^基因表達(dá)載體，該表達(dá)載體采用pCAMBIA1304為表達(dá)載體，將水稻《s/^O^基因反向插入到pCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游而獲得。本發(fā)明還利用Wti-0sPDCD5轉(zhuǎn)基因水稻后代Y7與其它不耐鹽的秈粳品種雜交， 再回交，從而將anti-fls/^O^序列導(dǎo)入其它優(yōu)良品種中，以提高其耐鹽性。本發(fā)明還包括水稻程序性死亡基因(ife/^O^基因)的分離、克隆與轉(zhuǎn)基因功能研究等?；蚺c蛋白結(jié)構(gòu)組成
水稻程序性死亡基因，即水稻fls/^O^基因，genbank登錄號為AY327105，全長cDNA由 7個外顯子組成。正常編碼的cDNA長416 bp，序列如SEQ. ID N01.所示，編碼128個氨基酸，序列如SEQ. ID N02.所示。
該基因的結(jié)構(gòu)與其編碼的蛋白質(zhì)組成如下
水稻fls/^O^基因結(jié)構(gòu)見圖1所示，蛋白結(jié)構(gòu)見圖2所示。2) kx^i_0sPDCD5基因表達(dá)載體的構(gòu)建 大多數(shù)基因工程都是將基因的核苷酸編碼序列正向插入載體 ，而本發(fā)明是將《s/^O^ 反向插入載體。本發(fā)明實施例中使用的《s/^O^反向序列如SEQ. ID N03.所示。采用 pCAMBIA1304 ( Center for the Application of Molecular Biology of International Agriculture, Canberra, ACT, Australia )為表達(dá)載體,將 0sPDCD5 反向序列插入到 PCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游，得到fls/^O^反義序列表達(dá)載體。其結(jié)構(gòu)圖如圖3所示。3) Anti-As/^切5"基因轉(zhuǎn)化實驗
采用中花11為轉(zhuǎn)基因受體，構(gòu)建《s/^O^反義序列表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。將中花11成熟種子去殼消毒后接種在脫分化植物組織培育基上誘導(dǎo)愈傷組織。在愈傷組織誘導(dǎo)2-3周后，采用基因槍微彈轟擊法，將含0sPDCD5反向序列的經(jīng)純化的pCAMBIA1304質(zhì)粒DNA導(dǎo)入中花11愈傷組織細(xì)胞。在添加30ppm潮霉素的MS培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)3_4周篩選抗性細(xì)胞系，然后將篩選的細(xì)胞系轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)長芽和生根。4)轉(zhuǎn)化處理試管苗移栽及轉(zhuǎn)化植株后代的分子檢測
將anti-fls/^O^轉(zhuǎn)化處理的中花11試管苗移栽田間，并分別采用PCR擴(kuò)增和基因組 southern雜交檢測候選的抗性植株，共獲得7株含有w\i-0sPDCD5的陽性植株。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，基因組southern雜交結(jié)果如圖5所示。5) Anti~0sPDCD5 轉(zhuǎn)中花 11 植株的實時定量 PCR (RealTime PCR)檢測基因fls/^O^在中花11轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量比野生型植株降低。見圖6所示。6) Anti-fls/^O^轉(zhuǎn)基因T3代三葉期幼苗經(jīng)鹽處理后，其表型、葉片相對電導(dǎo)率、 Fv/Fm值的變化與比較
將H-0sPDCD5轉(zhuǎn)基因T3代種子催芽14天后，用200mM的Nacl溶液處理72小時， 后用雙蒸水代替鹽溶液使其恢復(fù)生長。分別于鹽處理前(0小時)，鹽處理后24小時、48小時、72小時，用水恢復(fù)生長后48小時、96小時觀察、測定并記錄其表型和Fv/Fm值。重復(fù)六次。以上實驗同時設(shè)立中花11作為對照。水稻^mXi-0sPDCD5轉(zhuǎn)基因鹽脅迫下表型和Fv/Fm值變化見圖7—圖8所示。根據(jù)上述表型鑒定及生理指標(biāo)測定，anti-fls/^O^轉(zhuǎn)基因中花11的耐鹽性優(yōu)于對照
對照中花11植株在鹽處理72小時后，葉片嚴(yán)重卷曲、變黃；而Anti-fls/^o^轉(zhuǎn)基因植株雖也能觀察到葉片卷曲變黃等現(xiàn)象，但程度明顯比對照組輕，大部分葉片依舊舒展呈綠色。經(jīng)水處理搶救后，對照組全部死亡；而轉(zhuǎn)基因組大部分得以存活，并有新葉長出。7)雜交轉(zhuǎn)育
利用轉(zhuǎn)anti-fls/^O^中花11后代Y7與其它不耐鹽的秈粳品種雜交，再回交，把 anti-fls/^O^基因通過雜交轉(zhuǎn)育的方法轉(zhuǎn)移到其它優(yōu)良品種中，經(jīng)分子檢測及鹽堿地種植，確證了含有anti-fls/^O^基因的雜交后代株系表現(xiàn)出了不同程度的耐鹽特性。用于雜交的受體品種有特青、9311、明恢63、鎮(zhèn)稻88、武育粳4號、T022等。Y7與T022雜交后代的大田耐鹽性見圖9所示。


圖1為水稻0sPDCD5基因結(jié)構(gòu)。圖2為水稻0sPDCD5基因蛋白結(jié)構(gòu)。圖3為水稻0sPDCD5基因的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。圖4為水稻an\i-0sPDCD5轉(zhuǎn)基因陽性植株P(guān)CR擴(kuò)增檢測結(jié)果。圖5為水稻^mXi-0sPDCD5轉(zhuǎn)基因陽性植株southern雜交檢測結(jié)果。圖6為fls/^O^基因在中花11轉(zhuǎn)基因植株中與野生型植株中表達(dá)量的比照。圖7為水稻miti-0SPDCD5轉(zhuǎn)基因植株與對照植株鹽脅迫下表型變化。圖8為水稻^mXi-0sPDCD5轉(zhuǎn)基因植株與對照植株鹽脅迫下Fv/Fm值變化。圖9為水稻e^ti-0sPDCD5轉(zhuǎn)基因株系Y7分別與對照中花11和T022雜交，親本和雜交后代的鹽堿地大田耐鹽性表型。
具體實施例方式1、用帶酶切位點的引物克隆水稻程序性死亡基因0sPDCD5的全長cDNA，將cDNA和植物表達(dá)載體PCAMBIA1304用BsmFI和BstEII酶切后連接，這樣fls/^O^就反向插入到了 35s promoter 的下游。的反義序列表達(dá)載體 pCAMBIA1304/antisense-fls/^0^ 構(gòu)建完成。見圖3。2、誘導(dǎo)水稻愈傷組織培養(yǎng)基
(1)誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基=MS + 2 mg/L 2，4-D。(2)高滲培養(yǎng)基MS + 2 mg/L 2，4_D + 46.67 g/L 山梨醇 + 46.67 g/L 甘露醇。(3)第一輪篩選培養(yǎng)基MS + 2 mg/L 2，4_D + 30 mg/L 潮霉素。(4)第二輪篩選培養(yǎng)基MS + 2 mg/L 2，4_D + 50 mg/L 潮霉素。(5)分化培養(yǎng)基:MS + 3 mg/L 6-BA + 0. 5 mg/L NAA + 50mg/L 潮霉素。(6)生根壯苗培養(yǎng)基1/2 MS + 0. 1 mg/L NAA。(注1.以上培養(yǎng)基均含30g/L蔗糖+2.5 g/L agar,pH 5.8。2.愈傷誘導(dǎo)、繼代、篩選培養(yǎng)條件為26-28°C暗培養(yǎng)，分化、生根壯苗為26-28°C及16小時光周期)
3、愈傷組織誘導(dǎo)與處理
(1)取授粉后12-15天的未成熟種子，在無菌條件下，先用70%乙醇浸洗10 min，轉(zhuǎn)入 0. 1%升汞浸泡20 min，無菌水清洗3次。(2)在無菌條件下剝離幼胚，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26-28°C暗培養(yǎng)約20天后切芽，繼代一次。(3)在繼代培養(yǎng)基中挑選生長旺盛、淡黃色的愈傷30-50塊(每塊3 mm左右)，置于高滲培養(yǎng)基上中央，排成直徑約2. 5 cm的圓圈內(nèi)，培養(yǎng)約4-5 h后用于轉(zhuǎn)化。4、基因槍轉(zhuǎn)化
(1)基因槍從寧波新芝科技有限公司購置的高壓氣體基因槍，型號GJ-1000。(2)微粒子彈制備。(3)稱取60mg鎢粉(直徑約1 um)，加入到1. 5 ml滅菌離心管中，再加入Iml無水乙醇，振蕩1 min，于10000 rpm離心10 s，棄上清，重復(fù)洗一次后，將金粉懸浮于1 ml無菌水中現(xiàn)用或-20°C保存。 (4)吸取50 ul鎢粉懸浮液于1.5 ml離心管，依次加入5 ug DNA,50 ul 2. 5 M CaCl2,20 ul 0.1 M亞精胺，振蕩5分鐘，10000 rpm離心20 s，棄上清，以140 ul無水乙醇漂洗兩次，加入60 ul無水乙醇，懸浮待用。5、轟擊受體材料
(1)將基因槍放于超凈工作臺上，用70%酒精擦凈真空室，并將可裂膜、載粒膜、金屬擋網(wǎng)(均由寧波新芝科技有限公司供貨)于70%酒精中消毒30分鐘，然后用無菌濾紙吸干或吹凈殘余酒精。( 2 )打開電源開關(guān)，真空泵及氦氣瓶閥。(3)將可裂膜裝入固定、旋緊。(4)取10 ul包被DNA的鎢粉無水乙醇懸浮液，均勻涂布于載粒膜中心，放在超凈臺上吹干。(5)將載有微彈的載粒膜及擋網(wǎng)裝入微彈發(fā)射裝置，使有顆粒的一面朝下。(6)將培養(yǎng)皿放在托盤上，使愈傷集中于培養(yǎng)皿中央。(7)打開氣瓶，調(diào)節(jié)壓力1100 Psi。(8)抽真空，當(dāng)真空度達(dá)到需要值時，將VAC鍵轉(zhuǎn)到Hold位置。(9)轟擊，每皿轟擊2次(第一次轟擊后將培養(yǎng)皿旋轉(zhuǎn)90度后進(jìn)行第二次轟擊)，按放氣鍵使真空表讀數(shù)回零，取出樣品，轟擊后于高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)12-16 h。6、轉(zhuǎn)化愈傷組織篩選
(1)將打槍后高滲培養(yǎng)基上的愈傷轉(zhuǎn)入不含篩選劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上恢復(fù)生長5-7天。(2)將愈傷轉(zhuǎn)到含30 mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，均勻擺放，暗培養(yǎng)14_17天進(jìn)行第一次抗性篩選。(3)將抗性愈傷轉(zhuǎn)入含50 mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)8-12天進(jìn)行第二次抗性篩選。7、轉(zhuǎn)化植株篩選與檢測
(1)將篩選后存活的愈傷于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)30天。( 2 )待分化出小植株后，將小植株轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基，長大后移入溫室。(3)分別采用PCR擴(kuò)增和基因組southern雜交法檢測候選的轉(zhuǎn)化植株，共獲得7 株含有&Rti-0sPDCD5的陽性植株。
權(quán)利要求
1.水稻OsPDCD5基因在提高水稻耐鹽性方面的應(yīng)用，其特征在于利用水稻程序性死亡基因權(quán)，將其反向?qū)胨净蚪M中，用以提高水稻的耐鹽性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于采用中花11為轉(zhuǎn)基因受體，構(gòu)建 ant i~0sPDCD5轉(zhuǎn)基因植株。
3.一種anti-OsPDCD5基因表達(dá)載體，其特征在于采用pCAMBIA1304為表達(dá)載體，將水稻OsPDCD5基因反向插入到pCAMBIA1304載體35S組成型啟動子下游而獲得。
全文摘要
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體為細(xì)胞程序性死亡基因OsPDCD5在提高水稻耐鹽性方面的應(yīng)用。本發(fā)明利用水稻程序性死亡基因OsPDCD5，將其反向?qū)胨净蚪M中，用以提高水稻的耐鹽性；此外，還利用anti-OsPDCD5轉(zhuǎn)基因水稻后代Y7與其它不耐鹽的秈粳品種雜交，再回交，從而將anti-OsPDCD5序列導(dǎo)入其它優(yōu)良品種中，以提高其耐鹽性。
文檔編號C12N15/29GK102199609SQ201110075238
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者楊夢飛, 楊金水, 羅小金 申請人:復(fù)旦大學(xué)