專(zhuān)利名稱(chēng)：小麥一個(gè)抗旱基因TaPK及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及小麥抗旱相關(guān)基因TaPK及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別涉及該基因及其編碼蛋白與其在培育抗旱性提高植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱是影響植物生長(zhǎng)和農(nóng)作物 產(chǎn)量的最主要的環(huán)境因子，是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展的全球性問(wèn)題，干旱不僅嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，造成作物減產(chǎn)，而且是生態(tài)環(huán)境日益干旱。隨著對(duì)植物抗旱的基礎(chǔ)分子生物學(xué)研究的不斷深入和對(duì)抗性基因的不斷發(fā)現(xiàn)和挖掘，利用轉(zhuǎn)基因手段分離克隆抗旱基因，培育抗旱新品種來(lái)獲得抗干旱的轉(zhuǎn)基因植物，已經(jīng)成為當(dāng)今植物生物技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。目前利用基因工程技術(shù)開(kāi)展植物抗旱方面的研究已取得了較大進(jìn)展。研究表明，將植物本身以及其它生物中抗旱相關(guān)基因轉(zhuǎn)入植物中，其異源轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物可以使植物的抗旱能力提高。本實(shí)驗(yàn)室以新疆春小麥主栽品種新春6號(hào)(典型既抗旱又具備高水分利用效率的品種)為實(shí)驗(yàn)材料，利用cDNA-AFLP技術(shù)分析該品種在兩葉一心水分脅迫下基因表達(dá)的差異，獲得一些可能與小麥抗旱和水分高效利用相關(guān)的基因表達(dá)序列標(biāo)簽。通過(guò)測(cè)序及序列分析，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)上調(diào)序列與丙酮酸激酶基因具有很高的同源性，預(yù)測(cè)丙酮酸激酶基因在小麥抗旱過(guò)程中可能發(fā)揮一定的作用。小麥?zhǔn)俏覈?guó)最重要的糧食作物之一，但我國(guó)小麥的主產(chǎn)區(qū)受到干旱和鹽脅迫較為嚴(yán)重，小麥產(chǎn)量不同程度的受到了影響，因此，開(kāi)展小麥抗旱相關(guān)基因的篩選克隆和功能研究，培育抗旱小麥新品種是非常必要的，也是非常迫切的研究課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)小麥干旱脅迫下cDNA-AFLP表達(dá)譜的數(shù)據(jù)選出在小麥葉片在水分脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的TaPK基因，然后根據(jù)序列設(shè)計(jì)特異性引物，從小麥葉片cDNA文庫(kù)中克隆得到其全長(zhǎng)cDNA，并在煙草中進(jìn)行功能驗(yàn)證。本發(fā)明提供了一種小麥抗旱基因TaPK及其編碼蛋白與應(yīng)用。本發(fā)明的小麥抗旱基因，名稱(chēng)為T(mén)aPK，其cDNA是序列表中SEQ ID No. I的核苷酸序列。序列表中的SEQ ID No. I由1542個(gè)堿基組成。以上所說(shuō)的小麥抗旱基因TaPK的編碼蛋白，是下述氨基酸序列之一
(1)序列表中的SEQID No. 2序列；
(2)將序列表中的SEQIDNo. 2氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)取代、缺失和/或添加一至多個(gè)氨基酸殘基且具有同等抗旱活性由(I)衍生的蛋白質(zhì)。以上所說(shuō)的小麥抗旱基因TaPK的編碼蛋白，是具有序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，序列表中的SEQ ID No. 2由514個(gè)氨基酸殘基組成。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植株也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。擴(kuò)增TaPK中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍還包括基因TaPK在培育抗旱植物中的應(yīng)用，該植物為小麥或煙草。提高含有小麥TaPK基因的轉(zhuǎn)基因植物抗旱性的方法，是將小麥基因TaPK導(dǎo)入宿主植物的細(xì)胞、組織或植株個(gè)體，得到具有抗旱性能的植株。提高含有權(quán)利要求I中所述小麥TaPK基因的轉(zhuǎn)基因植物抗旱性的方法，其特征在于，所述的小麥的抗旱基因TaPK通過(guò)含有所述小麥的抗旱基因TaPK的植物表達(dá)載體pCAMBIA-2301/TaPK導(dǎo)入細(xì)胞、植物組織或植物個(gè)體，用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為 pCAMBIA-2301。
0015以上所說(shuō)的植物宿主為小麥或煙草。本發(fā)明的有益效果在于，克隆得到了小麥抗旱相關(guān)基因TaPK，并通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因轉(zhuǎn)入煙草，經(jīng)過(guò)比較分析證明，與野生型煙草植株相比，含有本發(fā)明的TaPK基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗旱能力明顯提高。


圖I為小麥樣品的cDNA-AFLP的部分?jǐn)U增結(jié)果，A :部分引物選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物；B A中方框的放大圖，箭頭所示為差異表達(dá)片段。M :DNA分子量Marker，下同；CK :正常灌水處理；D :干旱脅迫處理。
圖2為T(mén)aPK基因全長(zhǎng)cDNA序列的擴(kuò)增結(jié)果，CK :陰性對(duì)照；1 :正常灌水處理；2 :干旱脅迫處理；3 :干旱復(fù)水處理。
圖3為構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA-2301/TaPK的酶切驗(yàn)證結(jié)果，I pCAMBIA-2301/TaPK 酶切產(chǎn)物；2 pCAMBIA-2301/TaPK 質(zhì)粒對(duì)照。
圖4為轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定，WT :野生型煙草；1，2，3 :轉(zhuǎn)TaPK基因煙草。
圖5為轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱鑒定，A :野生型煙草干旱18天后的表型；B :轉(zhuǎn)TaPK基因煙草干旱18天后的表型。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例ITaPK基因的克隆I、實(shí)驗(yàn)材料處理本實(shí)驗(yàn)室利用cDNA-AFLP技術(shù)分析新疆春小麥主栽品種新春6號(hào)(典型既抗旱又具備高水分利用效率的品種)在兩葉一心時(shí)期水分脅迫下基因表達(dá)的差異，獲得了一些可能與小麥抗旱和水分高效利用相關(guān)的基因表達(dá)序列標(biāo)簽，如附圖I。通過(guò)測(cè)序及序列分析，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)上調(diào)序列與丙酮酸激酶基因具有很高的同源性，預(yù)測(cè)丙酮酸激酶基因在小麥抗旱過(guò)程中可能發(fā)揮一定的作用。因此，以春小麥品種新春6號(hào)為實(shí)驗(yàn)材料，采用室內(nèi)盆栽種植，苗期兩葉一心時(shí)，進(jìn)行自然干旱處理，對(duì)照材料正常澆水；干旱處理葉片萎蔫時(shí)(6d)，剪取對(duì)照及部分干旱處理的葉片，于液氮中速凍，-70°C冰箱保存。2、RNA提取及cDNA合成
RNA 提取采用 TRizol 法。
(1)取約0.Ig幼葉,在液氮預(yù)冷的研缽中迅速磨成粉末狀,移入裝有ImL Trizol試劑的2. OmL離心管中。
(2)振蕩混勻15-30S,平放離心管在冰上5min,4°C, 12000rpm離心lOmin。
(3)取上清于2mL離心管中，加入與上清等體積的氯仿/異戊醇(24 I)上下顛倒混勻，4°C, 12000rpm 離心 IOmin0
(4)取上清至I.5mL離心管中，加入與上清等體積的預(yù)冷異丙醇，混勻后室溫放置lOmin, 4°C，12000rpm 離心 IOmin0(5)棄上清，加入ImL預(yù)冷的75%乙醇洗滌RNA沉淀，4°C，12000rpm離心lmin。
(6)棄上清，用槍吸取剩余殘液，超凈臺(tái)中，冰上干燥RNA沉淀5-10min，加入30yLl%的DEPC水溶解RNA，_70°C保存?zhèn)溆谩DNA的合成使用Takara的cDNA合成試劑盒進(jìn)行,方法步驟按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行
(1)將RNA溶液于65°C加熱5min后迅速置于冰上，可以減弱二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，提高反轉(zhuǎn)錄效率。
(2)在0.2mL離心管中加入下列試劑
RNA5 卩 L
5XI st strand synthesis buffer 4 jiL dNTP mixture I RNase inhibitor I \xL 01igo(dT)I8 2ML Riverse transcriptase(M-MLV)(200U/fiL) 0.8 (xL RNase-free H Q_6 fiL
total20 ^iL
(3)輕柔攪拌混勻
(4)室溫放置IOmin后，移至42°C恒溫水浴鍋內(nèi)。
(5)42°C反應(yīng) Ih。
(6)反應(yīng)結(jié)束后置于冰上冷卻2min。
(7)在上述離心管內(nèi)，按下列順序配制cDNA第二鏈反應(yīng)液
I st strand cDNA20 (iL
5 X2nd strand synthesis buffer30 ^iL
dNTP mixture3 ^iL
E,Coli DNA Polymerase2
E.Coli RNaseH E.Coli DNA Ligses Mixture 2 ^iL
RNase-free H^O_89 uL
total146 (xL(8)16°C反應(yīng)lh，70°C加熱 IOmin0
(9)加入4iiL 的 T4DNA polymerase,輕輕攪拌，37°C反應(yīng) lOmin。
(10)放入_20°C冰箱停止反應(yīng)。3、引物序列
根據(jù)干旱脅迫下小麥幼苗cDNA-AFLP表達(dá)譜的差異片段設(shè)計(jì)特異性引物，以小麥葉片全長(zhǎng)cDNA為模板擴(kuò)增基因的全長(zhǎng)cDNA。引物序列為T(mén)aPK-F5’-AAGGCATGGTGTCCAACGG_3’ ；TaPK-R5’ -AAAATGGTGTTGCGTTGCC-3’。4、PCR 反應(yīng)體系(50 U L) 模板 cDNAI uL
IOxTaq buffer5 (iL
dNTPs (2.5mM each)0.5 \iL
Primer Il(xL
Primer IIfiL
LATaq0.5 ^iL
dd H2O補(bǔ)至終體積50
PCR 反應(yīng)程序?yàn)?8°C預(yù)變性 2min ;94°C變性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 90sec，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)在大約1500bp處有一個(gè)目的條帶如附圖2所示。5、擴(kuò)增片段的回收、T載體連接
使用OMEGA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶，具體操作步驟參照說(shuō)明書(shū)，同收產(chǎn)物與pGEM-T (Promega)載體連接，連接體系為
回收的PCR產(chǎn)物3iiL
2 X T4Ligase buffer 5 u L
pGEM-T 載體I ii L
dd H2O補(bǔ)至10 ii L于16°C水浴連接過(guò)夜。6、回收片段的克隆與測(cè)序
(I)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
①?gòu)?70°C冰箱中取出保存于甘油管中的E.coliDH5a菌株，放在冰上緩慢解凍；
②使用接種環(huán)在LB固體培養(yǎng)基(不含Amp)上劃線(xiàn)，將平板于37°C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜；
③從LB平板上挑取新活化的E.coli DH5 a單菌落，接種于3 5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(12h左右)；
④將該菌種懸液以I: 100的比例接種，取250 u L菌液轉(zhuǎn)接到25mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2 3h至0D_ = 0. 5左右；
⑤將菌液轉(zhuǎn)入50mL離心管中，冰上放置IOmin；
⑥在4°C下，4000r/min離心lOmin。棄去上清,將管倒置Imin以便培養(yǎng)液流盡；⑦用冰上預(yù)冷的0.lmol/L的CaCl2溶液IOmL輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置30min ；
⑧0 4°C4000r/min離心lOmin,棄去上清,加入2mL預(yù)冷的0. lmol/L的CaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置；
⑨在2mL制備好的感受態(tài)細(xì)胞中加入2mL30%甘油(即I: I體積，甘油終濃度15% )；
⑩將此感受態(tài)細(xì)胞分裝成每份200ii L (I. 5mL離心管)，液氮速凍，快速轉(zhuǎn)入-70°C冰箱保存。
(2)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 ①?gòu)?70°C冰箱中取出I管感受態(tài)細(xì)胞，置冰上緩慢解凍；
②向管中加入連接產(chǎn)物5ii L，輕彈混勻，冰浴靜置30min ；
③將管置于42°C水浴中90sec，不要搖動(dòng)；
④迅速轉(zhuǎn)移至冰浴2min。
⑤加入600u I LB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37°C 220r/min振蕩培養(yǎng)45min ；
⑥室溫下6000rpm離心2min，棄掉650U I上清液后重懸菌體，加入32 X-gal和16 u I IPTG，然后用涂布器將其均勻涂布于含60 u g/ml Amp的LB平板上；
⑦將平板于37°C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜，待出現(xiàn)明顯單菌落時(shí)拿出；
⑧放入4°C冰箱I 2h，使藍(lán)白斑顯色明顯；
⑨挑取白斑于LB液體培養(yǎng)基(60ii g/ml Amp)中搖菌，37°C 220r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒。
(3)重組質(zhì)粒的PCR鑒定及測(cè)序
對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取陽(yáng)性克隆的菌液送公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)SEQ ID No. I。實(shí)施例2 CaMV35S啟動(dòng)子植物表達(dá)載體的構(gòu)建
植物表達(dá)載體PCAMBIA2301的多克隆位點(diǎn)上含有限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和HindIII位點(diǎn)，根據(jù)植物CaMV35S啟動(dòng)子和TaPK的序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列分別為CaMV35S_F (EcoRI) 5’ -GAATTCCCGCCTTCAGTTTAGCTTC-3’ ；CaMV35S-R (XbaI) 5’ -TCTAGAAGTCCCCCGTGTTCTCTCC-3’ ；TaPK-UP : (XbaI)5’ -TCTAGAAAGGCATGGTGTCCAACGG-3’ ；TaPK-DOffN (HindIII)5’ -AAGCTTAAAATGGTGTTGCGTTGCC-3，。使用上述引物擴(kuò)增CaMV35S啟動(dòng)子和TaPK基因，然后分別用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)PCAMBIA2301植物表達(dá)載體、CaMV35S啟動(dòng)子和TaPK基因進(jìn)行雙酶切，I %瓊脂糖凝膠電泳分離后同收目的片段，然后進(jìn)行連接，構(gòu)建獲得植物表達(dá)載體pCAMBIA-2301/TaPK。(I)質(zhì)粒pCAMBIA-2301植物表達(dá)載體、CaMV35S啟動(dòng)子和TaPK基因雙酶切 酶切體系如下
內(nèi)切酶 l(EcoRI/XbaI)Iul
內(nèi)切酶 2(XbaI/HindIII) I U I pCAMBIA-2301 載體 (CaMV35S 啟動(dòng)子 /TaPK 基因) 5 y I IOXbuffer MI U I
ddH20 補(bǔ)至20 u I
于37 °C恒溫水浴酶切4h。(2)酶切產(chǎn)物的電泳與回收
雙酶切完成后，以I X TAE為電泳緩沖液，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下使用潔凈刀片分別切下目的基因片段，瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶。
(3)連接
經(jīng)酶切的pCAMBIA-2301植物表達(dá)載體、CaMV35S啟動(dòng)子和TaPK基因目的片段以摩爾t匕I : 2 : 5的比例進(jìn)行16°C過(guò)夜連接。
(4)轉(zhuǎn)化 連接產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌在含有Kan60 u g/ml的LB固體平板上37°C培養(yǎng)16h左右。
(5)重組子鑒定
挑取單克隆搖菌后提質(zhì)粒，使用EcoRI和HindIII雙酶切，酶切體系同實(shí)施例2中的(I)步驟，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，檢測(cè)已切開(kāi)的插入片段和載體片段大小，如附圖3所示，證明載體構(gòu)建正確。實(shí)施例3農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
1、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)的制備
(1)從新鮮的GV3101平板上挑取一個(gè)單菌落于YEB液體培養(yǎng)基(5ml)+Rif(50ug/ml)+Gen(50ug/ml)中，于 28°C、200rpm 振蕩培養(yǎng) 18h ；
(2)取200ul菌液于20ml的含Rif(50ug/ml)及Gen (50ug/ml)的YEB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)至0D600 = 0. 5-0. 8收集菌液，冰浴30min ；
(3)4°C, 6000rpm離心5min,棄盡上清,收集農(nóng)桿菌細(xì)胞；
(4)將沉淀的農(nóng)桿菌使用IOml預(yù)冷的0.05mol/L CaCl2重懸,4°C, 6000rpm離心5min ；
(5)棄上清，再用lml0.05mol/lCaCl2 (10%甘油)重懸細(xì)胞，分裝菌液200ul/管于I. 5ml離心管，液氮速凍后保存于_70°C。
2、凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101
(1)吸取10u I上述重組載體質(zhì)粒(約0. 5 ii g/ ill)，與200 ill GV3101感受態(tài)細(xì)胞輕輕混勻，冰浴30min ；
(2)液氮凍存5min，然后迅速置于37°C水浴3min；
(3)分別向離心管中加入600ill液體YEB培養(yǎng)基(Rif+Gen)，28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)
5h ；
(4)將上述培養(yǎng)液于6000rpm離心lmin，收集農(nóng)桿菌細(xì)胞，棄去650U I液體培養(yǎng)基，剩余150iU重懸細(xì)胞；
(5)將菌液涂布在含有Kan50 u g/ml，Rif 50 u g/ml及Gen50 u g/ml的固體YEB培養(yǎng)基平板上，28°C倒置培養(yǎng)18-36h。
3、農(nóng)桿菌PCR鑒定
菌體的PCR鑒定引物、體系及程序同實(shí)施例I。實(shí)施例4基因功能驗(yàn)證一煙草的轉(zhuǎn)化、篩選及表性分析 I、煙草無(wú)菌苗的獲得
將煙草種子用70%乙醇浸泡2min,再用0. I %升萊浸泡IOmin,無(wú)菌水反復(fù)沖洗6遍，然后接種于無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上,于26°C, 16hr40 u mo I s—1光照,70%相對(duì)濕度條件下培養(yǎng)4-6周。
2、煙草的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化
(1)取出從_70°C保存的實(shí)施例3中的農(nóng)桿菌活化至OD6tltl= 0. 4-0. 6，作為轉(zhuǎn)化用的浸染液；
(2)于超凈工作臺(tái)上，將浸染液倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將無(wú)菌煙草葉片剪成Icm2大小的方塊，放入菌液中，振蕩浸染IOmin ；
(3)取出煙草葉片，用濾紙吸干凈葉盤(pán)上附著的菌液；
(4)在共培養(yǎng)基(MS+6-BA2. Omg/L+IAA 0. 3mg/L)上覆一張無(wú)菌濾紙，將浸染過(guò)的葉盤(pán)均勻地?cái)[放在濾紙上，在26°C暗培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)2-3天。
3、煙草再生苗的篩選
(1)將共培養(yǎng)過(guò)的煙草葉盤(pán)轉(zhuǎn)移至MS+6-BA2.0mg/L+IAA0. 3mg/L+Kan50mg/L+Cb500mg/L的煙草誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基上，讓葉盤(pán)的傷口充分接觸培養(yǎng)基，直至葉盤(pán)邊緣逐漸產(chǎn)生淡綠色、致密的愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)出叢生芽；
(2)待叢生芽長(zhǎng)至2-3cm左右時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)接到MS+IAAO.3mg/L+Kan50mg/L+Cb500mg/L的煙草生根選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)；
(3)待轉(zhuǎn)基因煙草根系生成后，將根系生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)化植株，去除封口膜，室溫環(huán)境中 進(jìn)行煉苗7天左右，然后用水洗凈培養(yǎng)基，將苗轉(zhuǎn)入基質(zhì)(蛭石腐質(zhì)土 =2 I)中，26°C，16hr 40 v- mo I m_2 s—1光照,70%相對(duì)濕度條件下培養(yǎng),前2_3天需遮陰、避光、保濕。
4、再生煙草的PCR鑒定
(1)再生煙草的DNA提取
①取0.Ig新鮮葉片，用玻棒在1.5ml離心管內(nèi)充分研磨；
②加入400u I提取緩沖液，充分混勻，12000rpm離心5min ；
③小心吸取300iiI上清液，加入300ii I異丙醇，室溫沉淀20min, 12000rpm離心IOmin,收集沉淀；
④將沉淀充分風(fēng)干，加400u I TE溶解沉淀；
⑤加入400iil酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)，充分混勻，靜置10min，12000rpm離心IOmin ；
⑥小心吸取上清，加入400u I氯仿/異戊醇(24/1)，充分混勻，靜置lOmin，12000rpm離心IOmin ；
⑦小心吸取上清，加入40u 13M NaAC (pH5. 2),800 U I無(wú)水乙醇，_20°C沉淀過(guò)夜；
⑧4°C, 12000rpm 離心 15min,棄上清；
⑨70%酒精洗滌兩次，吹干后用30ill TE溶解。
(2)再生煙草的PCR鑒定
以提取得到的再生煙草DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系同實(shí)施例1，擴(kuò)增結(jié)果如附圖4所示。
5、轉(zhuǎn)基因煙草的表型鑒定
對(duì)PCR鑒定呈陽(yáng)性的植株和對(duì)照植株同時(shí)進(jìn)行干旱(控水)處理，停止?jié)菜?8d后觀(guān)察植株表型，結(jié)果表明對(duì)照植株已經(jīng)萎蔫，部分葉片出現(xiàn)枯黃，而轉(zhuǎn)TaPK基因的煙草植株生長(zhǎng)良好，如附圖5所示，說(shuō)明本發(fā)明的小麥基因TaPK具有良好的抗旱性。
權(quán)利要求
1.小麥的抗旱基因TaPK，其cDNA序列是序列表SEQID No. I的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求I所屬的小麥抗旱基因TaPK，其編碼蛋白是下述氨基酸序列之一 (1)序列表中的SEQID No. 2序列； (2)將序列表中的SEQID No. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)取代、缺失和/或添加一至多個(gè)氨基酸殘基且具有同等抗旱活性由(I)衍生的蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求2所述的小麥抗旱基因TaPK的編碼蛋白，其特征在于，所述的蛋白是序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸序列。
4.含有權(quán)利要求I所述基因的表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求I所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6.含有權(quán)利要求I所述基因TaPK在培育抗旱植物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6中所述基因TaPK在培育抗旱植物中的應(yīng)用，所述的植物為小麥或煙草。
8.提高含有權(quán)利要求I中所述小麥TaPK基因的轉(zhuǎn)基因植物抗旱性的方法，是將小麥基因TaPK導(dǎo)入宿主植物的細(xì)胞、組織或植株個(gè)體，得到具有抗旱性能的植株。
9.如權(quán)利要求6中所述的提高含有權(quán)利要求I中所述小麥TaPK基因的轉(zhuǎn)基因植物抗旱性的方法，其特征在于，所述的小麥的抗旱基因TaPK通過(guò)含有所述小麥的抗旱基因TaPK的植物表達(dá)載體pCAMBIA-2301/TaPK導(dǎo)入細(xì)胞、植物組織或植物個(gè)體，用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCAMBIA-2301。
10.如權(quán)利要求8或9中所述的提高含有權(quán)利要求I中所述小麥TaPK基因的轉(zhuǎn)基因植物抗旱性的方法，其特征在于，所述的植物宿主為小麥或煙草。
全文摘要
本發(fā)明涉及小麥的一個(gè)抗旱相關(guān)基因TaPK及其編碼蛋白，同時(shí)涉及TaPK基因在提高小麥抗旱能力中的應(yīng)用。本發(fā)明小麥抗旱基因TaPK具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列。該基因的編碼蛋白是下述氨基酸序列之一(1)序列表中的SEQ ID No.2序列；(2)將序列表中的SEQ ID No.2氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)取代、缺失和/或添加一至多個(gè)氨基酸殘基且具有同等抗旱活性由(1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的基因能夠有效提高植物對(duì)干旱脅迫的抗性，將在培育抗旱性增強(qiáng)的植物中發(fā)揮重要的作用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102952810SQ201210322068
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月4日
發(fā)明者王重, 張躍強(qiáng), 樊哲儒, 李劍峰, 海熱古麗·阿不力孜, 王子霞, 張宏芝 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所