一種時間分辨熒光檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種時間分辨熒光檢測方法，把特異反應體系的一株生物原料包被在磁珠上，將包被生物原料的磁珠與被測樣本反應，清洗后加入另一株已標記β－二酮類稀土配合物的特異性生物原料，發(fā)生免疫反應，使磁珠、被測樣本和熒光示蹤物形成復合物，清洗后再加入熒光增強物，最后用時間分辨熒光儀檢測，獲得被測樣本的濃度等信息。本方法可實現時間分辨熒光法半自動、全自動系統(tǒng)（即隨機系統(tǒng)）檢測，能解決解離增強鑭系元素熒光免疫分析技術的不足之處，提高時間分辨熒光分析法的應用和推廣。
【專利說明】
一種時間分辨熒光檢測方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學檢測技術領域，具體涉及一種時間分辨熒光檢測方法。
【背景技術】
[0002] 時間分辨焚光免疫分析(Timeresolved Fluoroimmunoassay，TRFIA)是一種非同 位素免疫分析技術，它把鑭系元素和配基結合起來形成螯合物，這些螯合物的發(fā)光特點，熒 光壽命較長，可達1~2ms，同時有很強的焚光效率，能夠滿足測量要求。時間分辨焚光分析 法，是關閉激發(fā)光后再測定熒光強度的分析方法，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波 長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈 敏度。
[0003] 目前市場上產品均是采用解離增強鑭系元素熒光免疫分析（Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay DELFIA)是時間分辨焚光分析中的一種。它米 用具有雙功能基團結構的螯合劑，使其一端與銪(Eu 3+)連接，另一端與抗體/抗原分子上的 自由氨基連接，形成Eu3+標記的抗體/抗原，經過免疫反應之后生成免疫復合物。由于這種復 合物在水中的熒光強度非常弱，因此需加入一種解離增強液，首先把Eu 3+從復合物上解離下 來，然后自由Eu3+與解離增強液中熒光增強物(螯合劑)螯合進入膠束的疏水內核，使Eu 3+的 熒光成行萬倍增加。采用這種解離增強步驟分析方法，被稱為解離增強鑭系元素熒光免疫 分析。
[0004] 時間分辨熒光分析法(TRFIA)實際上是利用了發(fā)射熒光的波長與其激發(fā)光波長的 巨大差異(Stokes位移較大)克服了激發(fā)光對發(fā)射熒光的背景影響，由于Eu 3+和其配基形成 的螯合物的發(fā)射熒光的波長在很狹窄光譜范圍內，同時，其熒光壽命又較長，這樣特點就解 決激發(fā)光的雜散光和外界短壽命光對發(fā)射熒光影響，從而大幅度提高了光學分析的靈敏 度。因此TRFIA具有很高的分析靈敏度、寬闊的測量范圍、優(yōu)良的分析精密性和對多個待測 物同時檢測的能力，成為方法學上頗具優(yōu)勢的非放射免疫分析技術之一。
[0005] 時間分辨熒光分析是以稀土離子標記抗原或抗體、核酸探針和細胞等為特征的超 靈敏度檢測技術，它克服了酶標記物的不穩(wěn)定、化學發(fā)光僅能一次發(fā)光且易受環(huán)境干擾、電 化學發(fā)光的非直接標記等缺點。使非特異性信號降低到可以忽略的程度，達到了極高的信 噪比，從而大大地超過了放射性同位素所能達到的靈敏度，且還具有標記物制備簡便、儲存 時間長、無放射性污染、檢測重復性好、操作流程短、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干 擾和應用范圍十分廣泛等優(yōu)點，成為繼放射免疫分析之后標記物發(fā)展的一個新里程碑。
[0006] 隨著檢驗醫(yī)學的發(fā)展，對微量、超微量的測定會越來越多，時間分辨熒光分析法 (TRFIA)具有越來越大的應用空間，但是目前市場上還沒有時間分辨熒光分析法全自動檢 測系統(tǒng)（即隨機系統(tǒng)），因此影響這種檢測方法的進一步應用和推廣。這是由于目前大家均 是采用解離增強鑭系元素熒光免疫分析法(DELFIA)，DELFIA系統(tǒng)的使用原理是采用解離增 強液需把標記Eu 3+解離下來，再增強鑭系元素的長壽命熒光，由于解離增強液內有較強的酸 性和較強的離子強度，影響全自動檢測系統(tǒng)中包被載體磁珠的單分散性，從而影響檢測結 果，也在方法學上限制其使用和推廣。
[0007] 發(fā)明專利CN201310168516.2，公開了一種新型的f3-二酮類稀土配合物及其制備 方法，以大分子二酮類為母體原料，然后將其在協(xié)同配體鄰菲羅啉的作用下與稀土離子 進行配位得到新型的二酮類大分子稀土配合物。該專利的熒光材料作為有機電致發(fā)光材 料主要應用于彩電行業(yè)，缺乏與蛋白接合的基團，不能應用于免疫檢測領域。
[0008] 發(fā)明專利CN201110287991.2,公開了一種納米微球時間分辨熒光探針，為一高分 子材料包裹稀土元素熒光配合物的納米微球，其特征在于稀土元素熒光配合物包括下列摩 爾比的物質:稀土元素離子二酮體類螯合劑:熒光增強協(xié)同劑=1:4:5,其中所述稀土元 素離子為Eu 3+和其他鑭系離子以100:1-1000:1摩爾比的雙摻混合物。該專利的時間分辨熒 光探針為乳膠納米微球，精密性較差，線性也較差，只適用于快速診斷行業(yè)。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明為了克服上述技術問題，提供了一種時間分辨熒光檢測方法。可實現時間 分辨熒光法半自動、全自動系統(tǒng)（即隨機系統(tǒng))檢測，能解決解離增強鑭系元素熒光免疫分 析技術的不足之處，提高時間分辨熒光分析法的應用和推廣。
[0010] 為了實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案如下： 一種時間分辨熒光檢測方法，包括以下步驟： 1) 把特異性生物原料包被在磁珠上； 2) 用0-二酮類稀土配合物作為熒光示蹤物，標記到另一特異性生物原料上，備用； 3) 將1)所得包被特異性生物原料的磁珠與被測樣本反應，清洗磁珠，加入2)所得被標 記的另一特異性生物原料，反應后，清洗磁珠； 4) 向反應體系中加入熒光增強物，用時間分辨熒光儀檢測反應體系中標記物的熒光， 獲得被測樣本信息。
[0011] 本發(fā)明用于包被磁珠和標記熒光示蹤物的生物原料為細胞、包涵體、蛋白質（抗 原、半抗原、抗體等）、氨基酸、多肽、核苷酸、有機化合物及其它有特異反應的任何體系。 整個特異生物反應過程如下：首先把特異反應體系的一株生物原料包被在磁珠上，將 包被生物原料的磁珠與被測樣本反應，清洗后加入另一株已標記0-二酮類稀土配合物的 特異性生物原料，發(fā)生免疫反應，使磁珠、被測樣本和熒光示蹤物形成復合物，清洗后再加 入熒光增強物，最后用時間分辨熒光儀檢測，獲得被測樣本的濃度等信息。
[0012] 將生物原料包被在磁珠上是指以下兩種包被方式:一種直接把生物原料通過化學 反應，用化學鍵方式連接到磁珠上；另一種方式是磁珠表面先包被鏈親和素(親和素，抗生 物素單抗），特異反應體系中的一株生物原料標記生物素，最后通過生物素和鏈親和素(或 抗生物素單抗)反應，把反應體中的一株生物原料包被在磁珠上。
[0013] 將0-二酮類稀土配合物作為熒光示蹤物標記在另一株生物原料方式有兩種；一 種是直接把熒光材料通過化學鍵與生物原料連接起來，另一種方式是，把熒光材料通過化 學鍵與鏈親和素(或親和素)連接起來，在生物原料標記生物素，最后熒光材料通過生物素 與鍵親和素反應，把生物材料連接起來。
[0014] 本發(fā)明所述的e-二酮類稀土配合物為Eu3+與0-二酮類化合物的配合物。
[0015] 優(yōu)選地，所述的0-二酮類化合物為四齒0-二酮類化合物。
[0016] 進一步優(yōu)選地，所述的四齒0-二酮類化合物為4,4'_雙（l'，r，r，2'，2'，3'，3'-七氣_4'，6'-己二酬基)氣橫基-鄰-二聯(lián)苯(BHHCT)、1，10-雙-(8'-氣橫基噻吩基_4，4_5， 5，-6,6-7,7_ 全氟 _1，3,8，10)_ 葵四酮(BCT0T)或者 1，10_ 雙 _(8'_ 氯磺基二聯(lián)苯基 _4,4，_5， 5，-6，6-7，7-全氟-1，3，8，10)-葵四酮(BCD0T)。以上四齒-二酮類化合物具有能夠連接蛋 白的基團。
[0017] 進一步優(yōu)選地，當0 -二酮類化合物為四齒0-二酮類化合物時，熒光增強物為三 正辛基氧膦(T0P0)、鄰菲羅啉(phen)和表面活性劑。
[0018] 進一步優(yōu)選地，所述的表面活性劑為Triton x 100、Tween 20或者Tween 40〇 [0019]進一步優(yōu)選地，步驟4)中的熒光增強體系為25mM的磷酸緩沖液，其中含三正辛基 氧勝5-10111〇1凡、鄰菲羅啉5-101]1〇1凡、1'1'；[1:011叉 100 0.15%(質量分數）411為7.5。
[0020] 優(yōu)選地，所述的0-二酮類化合物為二齒二酮類化合物。
[0021] 進一步優(yōu)選地，所述的二齒二酮類化合物為4,7_雙氯磺酸基苯基-1，10-菲咯 啉 _2,9_二羧酸(80?0八）。
[0022]進一步優(yōu)選地，當0-二酮類化合物為二齒二酮類化合物時，步驟4)中的熒光增 強物為含釔的熒光增加體系；所述的熒光增強體系為25mM的磷酸緩沖液，其中含釔Y3+ 5-10mol/L、三正辛基氧膦5-10mol/L、噻吩甲酰三氟丙酮5-10mol/L、Triton x 100 0.15%(質 量分數），pH為7.0~8.0。
[0023]本發(fā)明檢測方法反應體系的反應場所是在反應杯中，它可以是酶標板或管式反應 器內，反應過程在一定溫、濕度條件下（18°〇30°(：范圍內），搖動、振蕩或旋轉磁場下進行。 [0024]本發(fā)明的有益效果在于： 1、本發(fā)明的反應體系從加樣、反應、清洗到報告檢測結果全過程可實現自動化，也適用 于半自動時間分辨熒光檢測系統(tǒng)。它可以應用于檢測生物活性物質和生物樣品免疫分析， 如內分泌激素的檢測、腫瘤標志物的檢測、抗體檢測、病毒抗原分析、藥物代謝分析以及各 種體內或外源性超微量物質的分析，也可以用于核酸探針分析和細胞活性分析、生物大分 子分析。
[0025] 2、目前的時間分辨熒光檢測均采用解離增強方式，由于解離增強體系中增強液會 使磁珠團聚，從而影響磁微珠的單分散性，因此，無法實現時間分辨熒光檢測的自動化和半 自動化。本發(fā)明首次將磁珠包被生物原料技術用于時間分辨熒光檢測，無需解離增強關系， 沒有磁珠團聚現象。填補了時間分辨在全自動化系統(tǒng)檢測的空白。
[0026] 3、現有的的四齒0-二酮類化合物和二齒二酮類化合物作為熒光示蹤物，在使 用過程中由于熒光發(fā)光效率不高，很少被使用。本發(fā)明采用的熒光增強體系解決了發(fā)光效 率不高的問題，且無需解離增強關系，實現了時間分辨的全自化。
【附圖說明】
[0027] 圖1為實施例6中促甲狀腺激素的工作曲線。
[0028] 圖2為實施例7中促甲狀腺激素的工作曲線。
【具體實施方式】
[0029]下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明的實質性內容作進一步詳細的描述。
[0030] 實施例1 一種時間分辨熒光檢測方法，其特征在于:包括以下步驟： 1) 把特異性生物原料包被在磁珠上； 2) 用0-二酮類稀土配合物作為熒光示蹤物，標記到另一特異性生物原料上，備用； 3) 將1)所得包被特異性生物原料的磁珠與被測樣本反應，清洗磁珠，加入2)所得被標 記的另一特異性生物原料，反應后，清洗磁珠； 4) 向反應體系中加入熒光增強物，用時間分辨熒光儀檢測反應體系中標記物的熒光， 獲得被測樣本信息。
[0031] 實施例2 本實施例在實施例1的基礎上： 所述的0-二酮類化合物為4,4'_雙（1'，1'，1'，2'，2'，3'，3'_七氟-4'，6'_己二酮基） 氯磺基-鄰-三聯(lián)苯(BHHCT)。
[0032]步驟4)中的熒光增強物為25mM的磷酸緩沖液，其中含三正辛基氧膦5mol/L、鄰菲 羅啉5111〇1/1、1^^〇11叉 40 0.15%，？11為7.5。
[0033] 實施例3 本實施例在實施例1的基礎上： 所述的0-二酮類化合物為1，10-雙_(8 ' -氯磺基噻吩基-4，4-5，5，-6，6-7，7-全氟-1， 3,8，10)_ 葵四酮(BCT0T)。
[0034]步驟4)中的熒光增強物為25mM的磷酸緩沖液，其中含三正辛基氧膦10m〇l/L、鄰菲 羅啉10111〇1/1、1^^〇11叉 100 0.15%，？11為7.5。
[0035] 實施例4 本實施例在實施例1的基礎上： 所述的0-二酮類化合物為1，10-雙_(8 ' -氯磺基二聯(lián)苯基-4，4，-5，5，-6，6-7，7-全氟-1，3,8，10)_ 葵四酮(BCD0T)。
[0036]步驟4)中的熒光增強物為25mM的磷酸緩沖液，其中含三正辛基氧膦6mol/L、鄰菲 羅啉6111〇1/1、1^^〇11叉 20 0.15%，？11為7.5。
[0037] 實施例5 本實施例在實施例1的基礎上： 所述的0-二酮類化合物為4，7-雙氯磺酸基苯基-1，10-菲咯啉-2，9-二羧酸。
[0038]步驟4)中的熒光增強物為25mM的磷酸緩沖液，其中含釔Y3+ 5-10m〇l/L、三正辛基 氧膦5-10mol/L、噻吩甲酰三氟丙酮5-10mol/L、Triton x 100 0.15%，pH為7.5。
[0039] 實施例6 采用四齒二酮類化合物，用增強熒光反應體系檢測促甲狀腺素 具體工藝方法如下： 1. 1、把抗人TSH的亞單元單克隆抗體包被磁珠上。
[0040] 把lmg的抗人TSH 亞單元單克隆抗體(購于Mitsubishi chem. Co.)用pH8.0的 0.05M硼酸緩沖溶液，2~8 °C透析四次，最后取出體積不超過lml。
[0041]把10ml的粒徑2微米（固含量2%)表面帶羧基的磁微粒用磁鐵吸在某一位置，吸出 上清液，取5毫升25mM MES緩沖液(pH7.4)溶解，再加入混合均勻后加入5毫克NHS(N-羥基琥 珀酰亞胺)活化劑和2~5毫克EDC(碳二亞胺)活化劑，并充分攪拌30分鐘；把活化后的磁珠 用磁鐵吸住，把上清液吸走，然后加入2毫升硼酸緩沖液(pH8.2)。
[0042]把透析好的抗人TSH的亞單元單克隆抗體放入活化的磁珠，低溫振蕩反應24小 時后，用磁鐵吸住，把上清液吸出，再注入10微升1%BSA封閉液，室溫下振蕩封閉12小時后， 磁鐵吸住，把上清液吸出，最后把稀釋液加入，2~8 °C低溫貯存 1.2、把四齒0-二酮類化合物(BHHCT)和Eu3+的螯合物標記在抗人-TSH的a-亞單元單 克隆抗體 BHHCT-Eu3+的結構式如下：
首先把lmg抗人-TSHa-亞單元單克隆抗體(購于Mitsubishi chem. Co.)用pH9.2的 0.05M碳酸緩沖溶液，2~8°C透析四次。加入0.2~0.5mg的BHHCT-Eu3+低溫反應1~4小時。
[0043] 用Sephadex G-50柱層析分離標記了BHHCT-Eu3+的單抗和沒在標記的單抗，用蛋白 儀區(qū)分不同分子量的蛋白，同時檢定標記到單抗的BHHCT-Eu 3+的比例。
[0044] 1.3、配制熒光增強液 配制10-5mol的三正辛基氧膦(T0P0)、0.05%的表面活性劑Triton X-100、0.025M磷酸 緩沖液(PH7.5)配制熒光增強液。
[0045] 1.4、促甲狀腺素試劑盒的制備 配制TSH標準品：配制TSH標準溶液，具體濃度分別是0、0.09、0.84、4.4、22.5、115 mlU/ L〇
[0046] 把1.1制備的抗人TSH 亞單元單克隆抗體標記的磁珠和1.2標記BHHCT-Eu3+的抗 人-TSH的a-亞單元單克隆抗體分濃度調試，確定最合適的配比，然后與TSH標準品組合在一 起，反應過程如下，取一定量的1.1制備的抗人TSH 亞單元單克隆抗體標記的磁珠放入管 式反應器中加入標準品反應，旋轉磁場反應1小時后，用電磁場分離磁珠，上清液取走，清 洗，再加入1.2標記BHHCT-Eu 3+的抗人-TSH的a-亞單元單克隆抗體，旋轉磁場反應1小時后， 用電磁場分離磁珠，上清液取走，清洗，加入1.3制備的熒光增強液，旋轉磁場振蕩5分鐘檢 測。依次把剩下的五個標準品反應，檢測，測定條件為:激發(fā)波長340nm;接收波長615nm; 遲延時間0.2ms;窗口時間0.4ms;循環(huán)時間1.0ms。結果如下：促甲狀腺素的工作曲線見 圖1，該工作曲線具有較好的線性，結合表1數值和圖1可知，該檢測方法具有較好的靈敏度， 且實現了熒光檢測的自動化。
[0047] 表1時間分辨熒光免疫檢測法測定促甲狀腺素
實施例7 采用二齒二酮類化合物，增強熒光反應體系檢測促甲狀腺素 具體工藝方法如下： 2.1、把抗人TSH的亞單元單克隆抗體包被磁珠上(按1.1操作）。
[0048] 2.2、把二齒0-二酮類化合物(8〇?〇44113+)標記鏈親和素上 BCPDA-Eu 3+的結構式如下：
首先把lmg鏈親和素用pH9.2的0.05M碳酸緩沖溶液，2~8°C透析四次。加入0.2~0.5mg 的二齒二酮類Eu3+螯合物(BCPDA-Eu3+)低溫反應1~4小時。
[0049] 用Sephadex G-50柱層析分離標記了BCPDA-Eu3+的單抗和沒在標記的單抗，用蛋白 儀區(qū)分不同分子量的蛋白，同時檢定標記到單抗的BCPDA-Eu 3+的比例。
[0050] 2.3、把長臂生物素標記在抗人-TSH的a-亞單元單克隆抗體 首先把11^的抗人4511的€ [-亞單元單克隆抗體在4-8°(：0.謂的？85溶液(？11約8.3，含 0.9%NaCl，不含NaN3)透析四次，取樣抗體濃度不低于0.5 mg/ml。
[00511用N，N-二甲基甲酰胺溶解活化的長臂生物素（Sigma)成10mg/ml;該溶液在使用前 半小時內配制，取一定量的生物素溶液(使生物素與抗體的質量比為1:2)，在磁攪拌下逐滴 加入抗人-TSH的a-亞單元單克隆抗體溶液中，攪拌反應5min后于4~8°C靜置60min。
[0052] 將反應混合溶液對4~8°C 0.1M的PBS(PH約7.4，含0.9%NaCl，含有NaN3)透析6 次，取出生物素標記抗體，加入BSA(進口）使BSA含量為0.1%(W/W)，于2-8 °C或-20 °C保存。 [0053] 2.4、配制共熒光增強液 配制HT5摩爾濃度的三正辛基氧膦(T0P0)、1(T5摩爾濃度的二酮類化合物如萘甲 酰三氟丙酮(P-NTA)(或噻吩甲酰三氟丙酮（TTA))、表面活性劑Triton X-100(或Tween 20)、10%的乙醇和25mM磷酸(pH7.2)緩沖液、10_5摩爾濃度釔(Y)離子組成。
[0054] 2.5、促甲狀腺素試劑盒的制備 配制TSH標準品：配制TSH標準溶液，具體濃度分別是0、0.09、0.84、4.4、22.5、115 mlU/ L〇
[0055] 把2.1制備的抗人TSH 亞單元單克隆抗體標記的磁珠、2.2標記BCPDA-Eu3+的鏈 親和素和2.3標記長臂生物素的抗人-TSH的a-亞單元單克隆抗體分濃度調試，確定最合適 的配比，然后與TSH標準品組合在一起，反應過程如下，取一定量的2.1制備的抗人TSH的0-亞單元單克隆抗體標記的磁珠放入管式反應器中加入標準品反應，旋轉磁場反應1小時后， 用電磁場分離磁珠，上清液取走，清洗，再加入2.3標記長臂生物素的抗人-TSH的a-亞單元 單克隆抗體，旋轉磁場反應1小時后，用電磁場分離磁珠，上清液取走，清洗，加入2.2標記 BCPDA-Eu 3+的鏈親和素反應10分鐘，用電磁場分離磁珠，上清液取走，清洗，最后加入2.4制 備的共熒光增強液，旋轉磁場振蕩5分鐘檢測。依次把剩下的五個標準品反應，檢測，測定條 件為：激發(fā)波長340nm;接收波長615nm;遲延時間0.2ms;窗口時間0.4ms;循環(huán)時間 1.0ms。結果如下:促甲狀腺素的工作曲線見圖2,該工作曲線具有較好的線性，結合表2數值 和圖2可知，該檢測方法具有較好的靈敏度，且實現了熒光檢測的自動化。
[0056]表2時間分辨熒光免疫檢測法測定促甲狀腺素
本發(fā)明的時間分辨熒光檢測實現了熒光檢測的自動化，該自動化檢測方法如下： 待檢測樣本溶液中含包被了時間分辨熒光標記物的磁微球，將待檢測樣本溶液分成等 量的若干份，分批次匯聚磁微球并進行熒光標記物時間分辨熒光的檢測，得到多次檢測的 統(tǒng)計結果，從而完成對整個樣本溶液中熒光標記物的含量檢測；單次時間分辨熒光檢測的 步驟如下： 1) 在兩端開口的石英管中持續(xù)通入樣本溶液，同時啟動激發(fā)光光源，石英管的一側設 置電磁鐵，在電磁鐵的磁場作用下，使流動溶液中的磁微球駐留在電磁鐵的前端，隨著液體 的流動，石英管內的磁微球匯集數量不斷增加，形成匯集點； 2) 停止通入樣本溶液，光線通過激發(fā)光路聚焦在匯集點的磁微球上，經至少10微秒后 關閉激發(fā)光光源;再經10-2000微秒的設定時間后，收集磁微球結合的焚光標記物的時間分 辨熒光信號，并轉換為電信號，進行時間分辨熒光標記物的含量檢測。
[0057]磁微球的自動化檢測具有以下優(yōu)點： 1、通過電磁鐵將磁微球聚集在檢測區(qū)域，使磁微球在檢測區(qū)域的濃度提高了成千倍， 熒光標記物的熒光強度則可提高上萬倍，而溶液中的雜質所產生的背景干擾信號不會被增 強，有效消減由于清洗不徹底對檢測結果帶來的干擾。
[0058] 2、常規(guī)反應試驗清洗的目的是減少雜質，提高熒光標記物與背景信號占比；自動 化檢測通過提高磁微球密度，提高熒光標記物與背景信號占比，來提高實驗精度，特別適用 于免清洗的反應體系檢測熒光標記物含量。
[0059] 3、將反應池的液體樣本分成若干份，分別依次進行熒光標記物檢測，用多次的檢 測結果的統(tǒng)計值，代替對反應池中熒光標記物進行一次檢測的常規(guī)方法，提高了反應池的 檢測準確性，減少系統(tǒng)檢測波動。
【主權項】
1. 一種時間分辨熒光檢測方法，其特征在于:包括以下步驟： 1) 把特異性生物原料包被在磁珠上； 2) 用β-二酮類稀土配合物作為熒光示蹤物，標記到另一特異性生物原料上，備用； 3) 將1)所得包被特異性生物原料的磁珠與被測樣本反應，清洗磁珠，加入2)所得被標 記的另一特異性生物原料，反應后，清洗磁珠； 4) 向反應體系中加入熒光增強物，用時間分辨熒光儀檢測反應體系中標記物的熒光， 獲得被測樣本信息。2. 根據權利要求1所述的一種時間分辨熒光檢測方法，其特征在于:所述的β-二酮類 稀土配合物為Eu3+與β-二酮類化合物的配合物。3. 根據權利要求2所述的一種時間分辨熒光檢測方法，其特征在于:所述的β-二酮類 化合物為四齒β-二酮類化合物。4. 根據權利要求3所述的一種時間分辨熒光檢測方法，其特征在于:所述的四齒β-二 酬類化合物為4，4'-雙（1 '，1'，1'，2'，2'，3'，3'h氣_4'，6'-己二酬基)氣橫基-鄰-二聯(lián) 苯、I，10-雙-(8 ' -氯磺基噻吩基-4，4-5，5，-6，6-7，7-全氟-1，3，8，10)-葵四酮或者1，10_ 雙 _(8 ' -氣橫基二聯(lián)苯基 _4，4，_5，5，_6，6-7，7_全氣-1，3，8，10)-奏四酬。5. 根據權利要求3所述的一種時間分辨熒光檢測方法，其特征在于:步驟4)中的熒光增 強物為含三正辛基氧膦、鄰菲羅啉和表面活性劑的熒光增強體系。6. 根據權利要求5所述的一種時間分辨熒光檢測方法，其特征在于:所述的表面活性劑 為Triton X IOCKTween 20或者Tween 40〇7. 根據權利要求5所述的一種時間分辨熒光檢測方法，其特征在于:所述的熒光增強體 系為25mM的磷酸緩沖液，其中含三正辛基氧膦5-10mol/L、鄰菲羅啉5-10mol/L、Triton X 100 0·15%，ρΗ為7.0~8.0。8. 根據權利要求2所述的一種時間分辨熒光檢測方法，其特征在于:所述的β-二酮類 化合物為二齒二酮類化合物。9. 根據權利要求8所述的一種時間分辨熒光檢測方法，其特征在于:所述的二齒β-二酮 類化合物為4，7-雙氯磺酸基苯基-1，10-菲咯啉-2，9-二羧酸。10. 根據權利要求9所述的一種時間分辨熒光檢測方法，其特征在于：步驟4)中的熒光 增強物為含釔的熒光增加體系；所述的熒光增強體系為25mM的磷酸緩沖液，其中含釔Y 3+ 10-5mol/L、三正辛基氧膦5-10mol/L、i3-噻吩甲酰三氟丙酮(或β-萘甲酰三氟丙酮）10- 5mol/ UTriton X 100(或Tween 20、Tween 40)0.15%，2~20%的乙醇，25禮的磷酸緩沖液。!1為7.0 ~8 · 0〇
【文檔編號】G01N21/64GK105911041SQ201610379774
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】吳俊清, 章健, 吳冠英
【申請人】章健, 吳俊清, 吳冠英