檢測新霉素的時間分辨熒光免疫試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體的說，涉及一種檢測新霉素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]新霉素是一種廣譜抗生素，常用于動物各種傳染病的治療，對于多種病原菌有較強的抑制作用，對革蘭氏陽性和陰性菌皆有效。新霉素存在嚴(yán)重的副作用，具有腎毒性和內(nèi)耳毒性，它對內(nèi)耳的傷害，往往是不可逆轉(zhuǎn)的，因此動物食品中的新霉素殘留對人類的健康構(gòu)成巨大威脅。近年來已在家禽養(yǎng)殖中禁止使用。但在實際養(yǎng)殖中仍存在獸藥亂用、濫用的現(xiàn)象。
[0003]新霉素殘留分析一般使用氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)，這些方法靈敏、準(zhǔn)確，可以同時測定多種藥物，但需要昂貴的儀器，樣品前處理復(fù)雜、繁瑣費時、檢測成本較高，而且需專業(yè)人員操作，很難滿足對樣品進(jìn)行現(xiàn)場、批量、快速檢測的需要。因此，開發(fā)一種簡單快速、適用于獸藥殘留現(xiàn)場監(jiān)控的分析方法具有重要的現(xiàn)實意義。
[0004]而時間分辨熒光免疫分析法(TR-FIA)由于其特異性強、靈敏度高、操作簡單、廉價，且特別適于大批量樣品的檢測等優(yōu)點而越來越被人們所重視和采用。目前還沒有針對新霉素檢測的時間熒光免疫分析法的專利和文獻(xiàn)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種動物組織中新霉素殘留的檢測時間分辨熒光免疫分析試劑盒。
[0006]本發(fā)明的目的之二在于提供一種快速簡便地檢測蔬菜水果中新霉素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，用于定量或定性地檢測蔬菜水果中新霉素殘留量。
[0007]本發(fā)明目的之一是這樣實現(xiàn)的:檢測新霉素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其關(guān)鍵在于由多孔包被板、緩沖液、新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、抗新霉素的抗體凍干品、銪標(biāo)記的兔抗鼠抗體、洗滌液和增強液體所組成。
[0008]本發(fā)明目的之二是這樣實現(xiàn)的:檢測新霉素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，包括免疫原、包被原和單克隆抗體的制備以及樣品前處理及檢測，其關(guān)鍵在于:
(1)免疫原的制備:將半抗原新霉素與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，得到免疫原(新霉素-BSA)；
(2)包被原的制備:將半抗原新霉素與卵血清白蛋白(OVA)偶聯(lián)，得到包被原(新霉素-OVA)；
(3)單克隆抗體的制備:
a.用步驟(I)的免疫原(新霉素-BSA)免疫小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，得到分泌抗新霉素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株； b.以體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗體，使用ProteinG柱進(jìn)行純化，獲得抗新霉素的單克隆抗體IgG ；
c.用步驟(2)的包被原包被96孔包被板；
(4)樣品的前處理及檢測:
取包被有包被原(新霉素-0VA)的多孔包被板，加入50 μ?的新霉素到各自的微孔中，加50 μ?以緩沖液稀釋的抗新霉素抗體，25°C?37°C振蕩0.5~1小時，洗滌液洗3次，加以緩沖液稀釋的100 μ? Eu3+ -兔抗鼠抗體，25°C?37°C振蕩0.5~1小時，洗滌液洗6次，力口200 PL增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的新霉素含量。
[0009]上述的固相載體是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作為固相載體。
[0010]本發(fā)明主要采用時間分辨熒光免疫分析方法來檢測新霉素。采用時間分辨熒光免疫分析法的技術(shù)主要有兩個方面:第一，特異性單克隆抗體制備，用偶聯(lián)的免疫原免疫小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，得到分泌抗新霉素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；以體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進(jìn)行純化，獲得抗新霉素的單克隆抗體IgG。第二，Eu3+標(biāo)記抗體的制備。
[0011]本發(fā)明測定方法:測定的基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。包被有新霉素-OVA的多孔包被板，加入測試樣品到各自的微孔中，再加入抗新霉素抗體，振蕩反應(yīng)，游離的新霉素與微孔板上的新霉素-OVA競爭抗新霉素抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的新霉素抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu3+-兔抗鼠抗體，進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)，再用洗滌液洗滌，反應(yīng)后沒有連接的Eu3+-兔抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，在紫外燈的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的濃度成反比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定樣品中新霉素的量。
[0012]本發(fā)明檢測方法不需要昂貴的儀器，樣品前處理簡單、能現(xiàn)場操作檢測，應(yīng)用廣泛，該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。
【具體實施方式】
實施例
[0013]1、免疫原與包被原制備
本發(fā)明免疫原(新霉素-BSA)的合成:準(zhǔn)確稱取新霉素324mg溶解在2mL N, N- 二甲基甲酰胺中，攪拌下逐滴加入Y-氨基丁酸溶液，攪拌反應(yīng)3小時，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH 10左右。離心除掉沉淀物。將上述反應(yīng)逐滴加入BSA溶液中(320mg BSA溶解于5mL生理鹽水)，再加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 23mg, N, N- 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 45.4mg，4°C反應(yīng)過夜，離心除去沉淀，取上清液用磷酸緩沖液(PBS)透析3天，每6小時更換透析液，將所得產(chǎn)物低壓凍干，于-20°C保存?zhèn)溆茫?br> 包被原(新霉素-OVA)的合成:在上述反應(yīng)中，將BSA換成OVA后，得到反應(yīng)偶聯(lián)物新霉素-0VA，該偶聯(lián)物作為TR-FIA檢測時作為包被原使用。
[0014]2、單克隆抗體制備
2.1動物免疫
用步驟I制備的免疫原分別免疫6周齡雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫劑量為100μ8/0.2mL。首次免疫，用無菌0.0lmol/L pH7.4 PBS溶解免疫原(新霉素-BSA)，再與等量弗氏完全佐劑混合，完全乳化，勁背部皮下分2?3點注射；加強免疫，用0.0lmol/LpH7.4 PBS溶解免疫原與等量弗氏完全佐劑混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次間隔14?21天，第3次免疫后7?10天開始對免疫小鼠尾靜脈采血，收集血清，用ELISA檢測小鼠血清效價。末次免疫后間隔4周以上，在細(xì)胞融合前3?4天，腹腔注射新霉素-BSA抗原100μδ/0.2mL/只，注射后每天注意觀察，保證融合前小鼠狀態(tài)良好。
[0015]2.2單克隆抗體制備
分離免疫小鼠的脾細(xì)胞，并進(jìn)行勻漿制備免疫脾細(xì)胞。取I只免疫的Balb/c小鼠，從眼眶放血分離血清作為陰性血清，處死。小鼠用75%酒精浸泡5min，進(jìn)行整體消毒。將小鼠四肢固定，然后用鑷子夾住小鼠下腹部皮膚，剪開一小口，再用鑷子撕開皮膚，露出腹膜，換一套鑷子和剪刀，在腹部中央腹膜上用剪刀剪開一小口。換一套鑷子和剪刀，用剪刀剪開腹膜，露出脾臟，再換一套器械用鑷子夾住脾臟，用剪刀將脾臟外膜剪破，然后放入事先滅菌的勻漿器中。加適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基(RPM1-1640)于勻漿器中，進(jìn)行研磨，擠壓出脾細(xì)胞，取出勻漿器的勻漿棒，再補加適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基(RPM1-1640)，靜置2min，將上層細(xì)胞液吸取后，放入腹腔巨噬細(xì)胞離心管中，重復(fù)上述操作I次。1200r/min離心lOmin，除去上清。將18個免疫脾細(xì)胞與I?2X107個SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按照1:10或1:5的比例加入離心管中，進(jìn)行混勻，然后于1500r/min水平離心lOmin，棄去上清。將離心管倒扣在滅菌的吸水紙上，把管中液體吸干。用手指或桌面輕輕敲擊管底，讓沉淀的細(xì)胞松動，再把離心管置于37°C水浴鍋中。在Imin內(nèi)緩慢將50% PEG 0.8mL滴入離心管中，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌沉淀細(xì)胞。再繼續(xù)攪拌30s后，靜置lmin，然后慢慢加入事先進(jìn)行37°C預(yù)溫的40mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基(RPM1-1640)ο加基礎(chǔ)培養(yǎng)基方法為:第Imin內(nèi)逐滴滴入ImL,第2min內(nèi)逐滴滴入2mL，第3min內(nèi)逐滴滴入3mL,第4min內(nèi)逐滴滴入4mL,在每次加培養(yǎng)基時需緩慢加入,并輕輕地攪拌培養(yǎng)基，最后將剩余的RPM1-1640培養(yǎng)基慢慢加入。1000r/min離心5min，除去上清。然后用HAT培養(yǎng)基懸浮混合的細(xì)胞，再加入飼養(yǎng)脾細(xì)胞。根據(jù)需要補加適量的HAT培養(yǎng)基，混合均勻，再將含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞融合液滴加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，滴加量約為150?/孔。將培養(yǎng)板置于37 °C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，進(jìn)行培養(yǎng)。用建立的間接ELISA篩選陽性細(xì)胞克隆。選擇強陽性集落生長的孔，用有限稀釋法進(jìn)行克隆。并對其他陽性孔，進(jìn)行24孔擴大培養(yǎng)，用間接ELISA和間接競爭ELISA對擴大培養(yǎng)孔的上清液進(jìn)行檢測，對間接ELISA和間接競爭ELISA均為陽性孔的細(xì)胞進(jìn)行液氮冷凍保存。通過融合檢測，并進(jìn)行3次亞克隆后獲得雜交瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)過多次傳代、凍存、復(fù)蘇，雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定。進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞染色體的計數(shù)，將每株雜交瘤細(xì)胞隨機選擇20個細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞染色體條數(shù)的計數(shù)，再計算細(xì)胞染色體條數(shù)的平均值。小鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)為40條，SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)目平均數(shù)為62~68條，而本試驗獲得的20株雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目都在92~103條之間，平均為96.8條。本雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目高于兩親本細(xì)胞的染色體數(shù)目，說明是兩種細(xì)胞的雜交產(chǎn)物。取細(xì)胞株細(xì)胞分泌的培養(yǎng)上清液，進(jìn)行1:10稀釋后，用夾心ELISA方法測定抗體亞型，該細(xì)胞株分泌的抗體亞型為IgGl。采用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進(jìn)行純化。該單克隆抗體可用于制備時間分辨熒光檢測試劑盒。
[0016]2.3單克隆抗體的純化
采用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進(jìn)行純化:取小鼠腹水10mL，加入等體積的巴比妥緩沖液，適量的二氧化硅混合，室溫振蕩30min。室溫靜置15min后，取上清于潔凈離心管中，4°C, 1800r/min離心20min ;取上清液18m