本發(fā)明涉及一種時間分辨熒光定量檢測尿微量白蛋白的試劑盒及檢測方法。

(二)

背景技術：

尿微量白蛋白是指在尿液中出現(xiàn)微量白蛋白。白蛋白是一種血液中正常蛋白質(zhì)，人體代謝正常情況下，尿液中白蛋白極少，每升尿液白蛋白不超過20mg(<20mg/L)，所以叫微量白蛋白。但糖尿病腎病、高血壓腎病等早期腎臟受損和心血管疾病并發(fā)癥等發(fā)生時會造成腎臟固有細胞損傷，使腎臟固有細胞結(jié)構及功能發(fā)生變化而導致白蛋白含量在尿液中升高。尿液中微量白蛋白在20～200mg/L范圍內(nèi)，就屬于微量白蛋白尿，當尿液中微量白蛋白超過200mg/L時，證明患者有大量白蛋白漏出，可能出現(xiàn)低蛋白血癥，可發(fā)展為腎病，若不及時治療會進入尿毒癥期。尿微量白蛋白見于糖尿病腎病、高血壓、妊娠子癇前期，是腎損傷的早期敏感指標。

現(xiàn)有技術中測定尿微量白蛋白的方法主要有免疫比濁法、熒光免疫層析法、酶聯(lián)免疫法、化學發(fā)光法、膠體金法等。其中膠體金法具有操作簡單快速的優(yōu)點，但靈敏度低且定量不準確；酶聯(lián)免疫法靈敏度高，樣品量大可定量檢測，但操作時間長且自動化低；免疫比濁法和化學發(fā)光法較為敏感、準確，可應用于全自動生化儀，但需要儀器且耗時較長，適合處理大量樣本，無法滿足快速檢測的目的；免疫熒光法是將尿微量白蛋白抗體共價結(jié)合于熒光微球表面活性基團上，通過激發(fā)后檢測線是否產(chǎn)生熒光來判斷結(jié)果，快速便捷可準確定量同時具有高靈敏度、標記物穩(wěn)定等優(yōu)點，在醫(yī)學免疫檢測領域廣泛應用。

然而在生物流體和血清中的許多復合物和蛋白本身就可以發(fā)熒光，因此使用傳統(tǒng)的熒光素等發(fā)色團進行熒光檢測時靈敏度就會嚴重下降，但大部分背景熒光信號是短時存在的，可利用稀土熒光微球(鑭系元素螯合物)作為標記物來標記抗體或抗原。因鑭系元素螯合物stoke位移大很容易分辨激發(fā)光和發(fā)射光，從而排除激發(fā)光干擾，且衰變時間長可通過時間分辨消除本底熒光干擾，另外鑭系元素螯合物激發(fā)光譜寬而發(fā)射光譜窄可進一步提高靈敏度和降低本底熒光。因此采用時間分辨熒光免疫技術，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。

(三)

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術的不足和缺陷提供一種利用時間分辨熒光免疫層析技術的靈敏性，結(jié)合干式免疫熒光分析儀實現(xiàn)高靈敏度、可準確定量、簡便快捷的時間分辨熒光定量檢測尿微量白蛋白的試劑盒及檢測方法。

本發(fā)明采用的技術方案是：

一種時間分辨熒光定量檢測尿微量白蛋白的試劑盒，包括時間分辨熒光試紙卡、樣本稀釋液和含有定標曲線的SD卡；

所述時間分辨熒光試紙卡包括檢測試紙條，所述試紙條由底襯以及粘貼在底襯上的樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙組成，所述樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙順次搭接粘貼在底襯上；

所述硝酸纖維素膜上依次設置有微球線、檢測線和質(zhì)控線，微球線、檢測線和質(zhì)控線相互平行，間隔距離為3～5mm，其中微球線靠近加樣孔，質(zhì)控線遠離加樣孔，所述微球線由標記有人白蛋白單克隆抗體的時間分辨熒光微球組成，檢測線包被有人白蛋白重組抗原，質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG抗體。

所述時間分辨熒光微球摻雜有固含量1％(w/w)的稀土銪元素，且微球粒徑為100nm～300nm，在基態(tài)下穩(wěn)定，在350～380nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長范圍在600～620nm的熒光。

微球線中人白蛋白單克隆抗體的含量為50～200μg抗體/200μl熒光微球，檢測線中人白蛋白重組抗原包被濃度為0.5～2mg/ml、用量為0.5～1.5μl包被液量/cm膜，質(zhì)控線中羊抗鼠IgG抗體包被濃度為0.5～2mg/ml、用量為0.5～1.5μl包被液量/cm膜。

所述檢測試紙條由如下方法制備：

(1)時間分辨熒光微球的活化

超聲波處理熒光微球2min后，取200μl熒光微球以14000rpm高速離心5～15min后，沉淀物用10～100mM，pH為5.0～7.0的MES溶液洗滌至1ml，超聲波處理2min；加入10～100μl的20～100mg/ml碳二亞胺，混勻5～10min，再加入50～200μl的20～100mg/ml N-羥基硫代琥珀酰亞胺，混勻10～20min后14000rpm高速離心5～15min，沉淀用pH為5.0～7.0的MES溶液洗滌至1ml；

(2)時間分辨熒光微球標記人白蛋白單克隆抗體的制備

在上述活化后的熒光微球超聲波處理2min后按照50～200μg/200μl加入人白蛋白單克隆抗體，混勻1～3小時，用含0.5％BSA的10～50mM、pH 7.5～8.5Tris-HCl封閉液封閉0.5～1小時后14000rpm高速離心5～15min，用含1％Nacl、0.5％BSA、0.1％Tween20的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-Hcl保存液洗滌并重懸至200μl于4℃避光保存。

(3)包被膜的制備

分別用包被緩沖液(含2.5％蔗糖的10mM PBS緩沖液)將人白蛋白重組抗原和羊抗鼠IgG抗體調(diào)整濃度到0.5～2mg/ml，用量為0.5～1.5μl包被液量/cm膜，分別作為檢測線和質(zhì)控線平行劃于硝酸纖維素膜上進行包被，用微球稀釋液將標記人白蛋白單克隆抗體的時間分辨熒光微球3～6倍稀釋，用量為0.5～1.5μl包被液量/cm膜，作為微球線劃于硝酸纖維素膜上靠近樣品墊方向進行包被，質(zhì)控線、檢測線和微球線間隔3～7mm，置于烘箱中，45℃烘干過夜。

(4)在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、包被膜和吸水紙得到試紙板，切割得到所述試紙條。

所述時間分辨熒光試紙卡由檢測試紙條固定在塑料底卡上，試紙表面用卡面壓緊，且卡面在對應樣品墊和硝酸纖維素膜的部分分別預留加樣孔和觀察窗。

所述樣本稀釋液組成如下：NaCl 0.5％，BSA 0.5％，Tween 1％，溶劑為10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl緩沖液，以270μl/管分裝于離心管中。樣本緩沖液用于層析樣品。

所述含有標準曲線的SD卡，是通過時間分辨熒光試紙條測定不同濃度的校準品，以校準品濃度為橫坐標，以熒光信號比值作為縱坐標，繪制成標準曲線，寫入并生成相應二維碼信息存儲在SD卡中獲得。通過干式熒光免疫分析儀可讀取試劑卡上對應的二維碼信息并測得相應濃度。

本發(fā)明還涉及利用所述試劑盒的定量檢測尿微量白蛋白的方法，所述方法包括：

(1)將檢測試劑盒和樣品置于室溫下，待恢復至室溫后使用；

(2)開啟干式熒光免疫分析儀，預熱5min后插入對應SD卡；

(3)精確吸取30μL待測尿液加入樣本稀釋液中，混勻；

(4)吸取混合后樣本80μL，加入到檢測卡加樣孔中；

(5)將檢測卡插入檢測槽，10min后檢測并讀取和打印檢測結(jié)果。檢測范圍2～300mg/L。

本發(fā)明所述時間分辨熒光定量檢測尿微量白蛋白的試劑盒的檢測原理是競爭法，檢測人尿液中微量白蛋白的含量。含尿微量白蛋白的尿液樣本稀釋液滴加在樣本加樣區(qū)，通過毛細作用層析至硝酸纖維素膜微球線，與時間分辨熒光微球標記的人白蛋白單克隆抗體結(jié)合，形成微球抗體-抗原復合物，層析至檢測區(qū)，因檢測線固定的人白蛋白重組抗原和樣本中微量白蛋白與微球標記的人白蛋白單克隆抗體競爭結(jié)合，因此樣本中白蛋白越多，檢測線處結(jié)合的微球抗體越少，而多余的熒光微球標記物繼續(xù)向前層析，與固定在質(zhì)控線羊抗鼠結(jié)合。反應結(jié)束后，用紫外光源(365nm)對檢測區(qū)掃描檢測，檢測線和質(zhì)控線上時間分辨熒光微球發(fā)出熒光(615nm)，其衰變時間也較長。利用延緩測量時間，待樣品基質(zhì)中自然發(fā)生的短壽命熒光(1～10ns)全部衰變后，再測量稀土元素的特異性熒光，這樣就可以完全排除特異本底熒光的干擾。通過檢測線和質(zhì)控線熒光強度的強弱及其比值，即可分析出樣品中待測物的濃度。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明試劑盒能夠準確定量檢測人尿液中微量白蛋白的含量，利用時間分辨熒光微球檢測技術，可避免樣本本身熒光干擾，標記通過共價鍵將微球與抗體連接，標記產(chǎn)物穩(wěn)定，具有檢測范圍寬(2～300mg/L)、靈敏度高(檢出限2mg/L)、準確度高、檢測快速簡便等特點。

(四)附圖說明

圖1為本發(fā)明的時間分辨熒光定量檢測尿微量白蛋白的試劑盒中檢測試紙條的結(jié)構示意圖；

其中：1、樣品墊；2、包被膜；3、吸水紙；4、微球線；5、檢測線；6、質(zhì)控線；7、底襯。

圖2為本發(fā)明實施例1所制備的試劑盒標準曲線。

圖3為本發(fā)明實施例1所制備的試劑盒與西門子免疫比濁法檢測尿微量白蛋白試劑盒檢測結(jié)果相關性比較。

(五)具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：

實施例1：時間分辨熒光定量檢測尿微量白蛋白試劑盒的制備

時間分辨熒光定量檢測尿微量白蛋白試劑盒，采用競爭法免疫層析原理，檢測人尿液中微量白蛋白。由時間分辨熒光試紙卡、樣本稀釋液和含有定標曲線的SD卡組成。

如圖1所示，在該實施例中，底襯7上順次搭接樣品墊1、包被膜2以及吸水紙3，樣品墊1是加樣區(qū)，用于吸取待測尿液檢測樣本，包被膜2上設有微球線、檢測線和質(zhì)控線。

包被膜2上微球線上使用特定的激發(fā)光(365nm)/發(fā)射光(615nm)波長的稀土銪熒光微球(直徑約200nm，銪固含量1％)標記人白蛋白單克隆抗體(100μg抗體/200μl熒光微球)，檢測線包被人白蛋白重組抗原(1mg/ml)，質(zhì)控線包被濃度為1mg/ml的羊抗鼠IgG抗體(其中時間分辨熒光微球采購自美國Bangs Lab公司，人白蛋白單克隆抗體采購自重慶探生科技有限公司，人白蛋白重組抗原采購自洛陽佰泰科生物技術有限公司，羊抗鼠IgG抗體來自長沙博優(yōu)生物科技有限公司)。微球線、檢測線和質(zhì)控線用量為1μl包被液量/cm膜。

在該實施例中，時間分辨熒光定量檢測尿微量白蛋白的試劑盒的制備包括以下步驟：

1.時間分辨熒光微球的活化

超聲波處理熒光微球2min后，取200μl熒光微球以14000rpm高速離心15min后，沉淀物用100mM，pH為6.0的MES溶液洗滌至1ml，超聲波處理2min；加入50μl的100mg/ml碳二亞胺，混勻5min，再加入100μl的100mg/ml N-羥基硫代琥珀酰亞胺，混勻15min后14000rpm高速離心15min，沉淀用pH為6.0的MES溶液洗滌至1ml。

2.時間分辨熒光微球標記人白蛋白單克隆抗體的制備

在上述活化后的熒光微球超聲波處理2min后按照100μg/200μl加入人白蛋白單克隆抗體，混勻2小時，用含0.5％BSA的50mM、pH8.0Tris-Hcl封閉液封閉1小時后14000rpm高速離心15min，用含1％Nacl、0.5％BSA、0.1％Tween20的50mM、pH8.0的Tris-HCl保存液中緩沖液洗滌兩次并超聲處理重懸至200μl于4℃避光保存。

3.包被膜的制備

分別用包被緩沖液(含2.5％蔗糖的10mM PBS緩沖液)將人白蛋白重組抗原和羊抗鼠IgG抗體調(diào)整濃度到1mg/ml，用量為1μl包被液量/cm膜，分別作為檢測線和質(zhì)控線平行劃于硝酸纖維素膜上進行包被，用微球稀釋液(含0.5％BSA和20％蔗糖的10mM PBS緩沖液)將標記人白蛋白單克隆抗體的時間分辨熒光微球5倍稀釋，用量為1μl包被液量/cm膜，作為微球線劃于硝酸纖維素膜上靠近樣品墊方向進行包被，質(zhì)控線、檢測線和微球線間隔4mm，在濕度<30％，溫度45℃烘箱中晾干10小時，封袋，備用；

4.在底襯(尺寸為80*300mm)上順次相互搭接地粘貼樣品墊(尺寸為30*300mm，玻璃纖維棉材質(zhì))、包被膜(尺寸為25*300mm，硝酸纖維素材質(zhì))和吸水紙(尺寸為28*300mm)得到試紙板，按照要求切割成4mm寬度的試紙條。

本發(fā)明檢測尿微量白蛋白的時間分辨熒光試紙卡包括檢測試紙條，在使用時，試紙條組裝在由塑料上殼和塑料下殼扣合而成的塑料外殼中，塑料上殼設有兩個開孔，加樣孔和觀察窗，加樣孔對應于所述的檢測尿微量白蛋白的試紙條樣品墊1，結(jié)果觀察窗對應于所述檢測尿微量白蛋白的試紙條的檢測線5和質(zhì)控線6，該檢測檢測尿微量白蛋白的試紙條可以從該塑料外殼中取出。

本發(fā)明試劑盒中，還包括樣本稀釋液，為含0.5％Nacl、0.5％BSA和1％Tween的50mM、pH8.0Tris-Hcl緩沖液，以270μl/管分裝于離心管中。樣本緩沖液用于層析樣品。

本發(fā)明試劑盒中，每盒均含有標準曲線的SD卡(同批次標準曲線相同)，通過時間分辨熒光試紙條測定不同濃度的校準品，以校準品濃度為橫坐標，以熒光信號比值作為縱坐標，繪制成標準曲線，寫入SD卡并生成二維碼，通過干式熒光免疫分析儀可讀取試劑卡上對應的二維碼信息并測得相應濃度。

實施例2：時間分辨熒光定量檢測尿微量白蛋白試劑盒的定量檢測

1.標準曲線的繪制

按實施例1制備好的時間分辨熒光試紙卡加入不同濃度白蛋白抗原質(zhì)控品(302.5mg/L、247.5mg/L、192.5mg/L、137.5mg/L、82.5mg/L、38.5mg/L、11.0mg/L、2.0mg/L共八個濃度，每個濃度設三個重復，均由10mg/ml人白蛋白重組抗原用0.85％生理鹽水稀釋得到)，加入樣本稀釋液，層析10min后，通過廣州藍勃生物科技有限公司生產(chǎn)的AFS-1000型干式熒光免疫分析儀讀取C、T線熒光信號及C/T值，實驗結(jié)果及分析見表1：

以微量白蛋白質(zhì)控品濃度取LOG值和樣本信號T/C平均值取LOG值繪制標準曲線，曲線數(shù)據(jù)見表1，標準曲線如圖2所示。其中R值為0.9943，通過該標線對樣品中所含微量白蛋白濃度進行濃度定量測定。

2.時間分辨熒光試紙卡性能測試。

最低檢出限：用零值樣本進行重復測定20次，計算20次結(jié)果的均值M與標準差SD，以空白均值加兩倍標準差報告方法的檢測限(M+2SD)，結(jié)果為1.63mg/L，符合靈敏度2mg/L。

線性范圍：取2～300mg/L之間八個濃度值，每個濃度重復測量三次，將測定濃度平均值于理論濃度進行線性分析，得到線性方程y＝1.0199x+0.2911，r＝0.9965，表明本發(fā)明試劑盒在2～300mg/L線性范圍內(nèi)相關性很好。

精密度：取三批實施例1中所制時間分辨熒光定量檢測尿微量白蛋白試劑盒，分別檢測247.5、38.5mg/L重復性質(zhì)控品，每批試劑盒用重復性質(zhì)控品平行檢測10次，247.5mg/L濃度三批批內(nèi)CV分別為5.25％、7.05％、5.33％，三批批間CV為6.17％，38.5mg/L濃度三批批內(nèi)CV分別為8.31％、9.55％、9.71％，三批批間CV為9.97％，均在10％以內(nèi)。

準確度:選擇濃度為22mg/L的質(zhì)控物為檢測樣本，分為體積相同3份，在其中2份樣本中分別加入220mg/L和38.5mg/L的準確度質(zhì)控品，制成2個不同加入濃度的回收樣本，計算加入的待測物的濃度。在另一份樣本中加入同樣量的無被測物的溶液，制成基礎樣本。對樣本進行3次重復分析，取其均值進行計算。計算回收率＝(分析樣品濃度-基礎樣品濃度)/加入濃度×100％?；厥諛颖?20mg/L的回收率為106.03％，28.5mg/L的回收率為97.58％，平均回收率為90.92％。偏差在10％以內(nèi)。

3.臨床樣本檢測

采集醫(yī)院檢測尿微量白蛋白的尿液樣本200份，用本發(fā)明的試劑盒和西門子免疫比濁法檢測尿微量白蛋白試劑盒兩種方法進行檢測比較。本發(fā)明試劑盒中，取尿液30μl加入樣本稀釋液，混勻后取80μl加入到檢測卡加樣孔中，層析10min后通過廣州藍勃生物科技有限公司生產(chǎn)的AFS-1000型干式熒光免疫分析儀讀取濃度，同一尿液采用對比系統(tǒng)西門子免疫比濁法檢測尿微量白蛋白試劑盒進行濃度檢測。兩種方法檢測結(jié)果進行線性分析，如圖3所示，其相關性很好r＝0.9893，P>0.05,平均相對偏差小于10％，結(jié)果符合臨床分析要求，適合用于臨床檢測。