專(zhuān)利名稱(chēng)：一種經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的一種經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫檢測(cè)方法，具體地說(shuō)本發(fā)明是 一種屬于免疫檢測(cè)領(lǐng)域的固相熒光免疫改進(jìn)檢測(cè)方法。屬于熒光免疫分析領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
時(shí)間分辨熒光分析法(TRIFA)是一種新的非放射性微量分析技術(shù)。"時(shí) 間分辨熒光免疫分析"理論是芬蘭人Soini和Hemmia在1979年提出的。其特點(diǎn) 在于利用三價(jià)稀土離子及其螯合物是一種熒光發(fā)射時(shí)間較長(zhǎng)的示蹤物，采用 測(cè)定時(shí)段避開(kāi)樣品的自然熒光的手段，代替熒光物質(zhì)、同位素和酶，標(biāo)記生 物活性物質(zhì)。發(fā)出的熒光因其靈敏度很高可達(dá)到(10pmol/L)以上，操作簡(jiǎn)便，示蹤物穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍寬，不受樣品的自然熒光干擾，無(wú)放射性污染等 許多優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)今方法學(xué)研究和臨床應(yīng)用的最主要的發(fā)展方向之一。在生物 醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量免疫檢驗(yàn)中已成為一項(xiàng)最有發(fā)展前景的分析手段。而 已有報(bào)道的技術(shù)尚存在以下幾個(gè)方面的問(wèn)題(1)熒光增強(qiáng)液三辛基氧化膦協(xié)同法(李振甲；時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)與應(yīng) 用[M];第一版.北京；科學(xué)出版社，1996年)。此法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，缺 點(diǎn)是在免疫反應(yīng)完成后，檢測(cè)熒光信號(hào)值之前需先將熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物中 的鑭系元素先解離下來(lái)形成游離的鑭系元素，然后加入增強(qiáng)液與游離的鑭系 元素螯合才能測(cè)量熒光，這一過(guò)程很容易受到外源性游離鑭系元素等金屬離 子的污染，干擾測(cè)量結(jié)果。
(2)Cyber Fluor時(shí)間分辨熒光免疫分析法(焦奎；酶聯(lián)免疫技術(shù)與應(yīng)用[M]; 第一版.北京；化學(xué)工業(yè)出版社，2004)。此法采用雙功能鰲合劑BCPDA (4， 7-雙(氯磺酰基苯基)-1， 10-菲啰啉-2， 9-二羧酸)鰲合三價(jià)稀土離子作為 標(biāo)記物，在免疫反應(yīng)完成后，檢測(cè)熒光信號(hào)值之前無(wú)需將熒光標(biāo)記免疫復(fù)合 物中的鑭系元素解離，可直接測(cè)量熒光，避免了因外源性鑭系元素等金屬離 子的污染而干擾測(cè)量結(jié)果。但是在測(cè)量熒光信號(hào)值之前需使用強(qiáng)制通風(fēng)板式 干燥器千燥被測(cè)載體2小時(shí)。而被測(cè)載體受測(cè)量環(huán)境空氣的濕度影響較大， 易引起被測(cè)載體干燥度不穩(wěn)定，影響測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性。且激發(fā)光只對(duì)待測(cè) 載體微孔底部熒光發(fā)生作用而對(duì)孔壁不起作用，因此靈敏度較低。稀土熒光化合物所產(chǎn)生的熒光具有非常特殊的性質(zhì)，其最大特征是(1) 鑭系離子的熒光衰變時(shí)間極長(zhǎng)，是傳統(tǒng)熒光的103—106倍。(2) 激發(fā)光與發(fā)射光之間的Stokes位移大，可達(dá)290nm，而普通熒光素的 Stokes位移僅為28nm。這樣就幾乎完全消除了背景熒光的干擾，繼而通過(guò)時(shí) 間延遲和波長(zhǎng)分辨使特異性熒光和背景熒光得以分辨(故稱(chēng)為時(shí)間分辨)，使 測(cè)量干擾幾乎為零?；谏鲜鎏卣?，時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是可完全消除各 種散亂雜光和短壽命熒光對(duì)測(cè)定的影響，從而極大地提高測(cè)定靈敏度和特異 性。但是大多數(shù)稀土熒光化合物的熒光量子產(chǎn)率較小，需把稀土離子從化合 物上解離下來(lái)，再用增強(qiáng)液來(lái)提高熒光量子的產(chǎn)率，但這也使得外源性稀土 離子污染的概率大為增加。而以BCPDA和納米熒光微粒制備的熒光發(fā)光體可 直接作為示蹤物使用，完全消除了外源性稀土離子污染的問(wèn)題，如加拿大的 Cyber Fluor固相時(shí)間分辨熒光免疫分析法。但該法采用載體干式測(cè)量，需 強(qiáng)力干燥設(shè)備，測(cè)量環(huán)境空氣濕度對(duì)載體干燥度影響較大，影響測(cè)量結(jié)果的 重復(fù)性。而且激光激發(fā)的熒光只局限于載體微孔底部某點(diǎn)，使載體微孔壁表 面結(jié)合的熒光標(biāo)記物不能利用，造成測(cè)量熒光值較低，影響測(cè)量結(jié)果的靈敏 度，使推廣受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫 的檢測(cè)方法。本發(fā)明是要提供一種無(wú)污染影響，高靈敏度、高穩(wěn)定性、檢測(cè) 程序簡(jiǎn)便的固相時(shí)間分辨熒光免疫分析法。 本發(fā)明的經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫檢測(cè)步驟為
(1) 在載體上預(yù)先固定生物活性物質(zhì)(如抗體或抗原等)，形成固相生物活 性物質(zhì)。
(2) 加入待測(cè)的樣品，樣品中的待測(cè)物與固相生物活性物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)， 形成固相免疫復(fù)合物。除去樣品中未反應(yīng)的物質(zhì)。
(3) 加入熒光標(biāo)記物加入標(biāo)記有熒光發(fā)光體的生物活性物質(zhì)，與固相免疫 復(fù)合物進(jìn)行免疫反應(yīng)，形成固相熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物。除去多余的熒光標(biāo)記 物。
(4) 用洗脫液使固相熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物形成游離熒光標(biāo)記物質(zhì)。用熒光 儀檢測(cè)游離熒光標(biāo)記物質(zhì)的熒光信號(hào)值。
本發(fā)明的檢測(cè)步驟(1) - (3)上與熒光增強(qiáng)液三辛基氧化膦協(xié)同法和
Cyber Fluor熒光免疫分析法基本相同，但本發(fā)明吸取了 Cyber Fluor熒光 免疫分析法中熒光發(fā)光體一次鰲合的特點(diǎn)，又在步驟(4)上改進(jìn)了 Cyber Fluor法，采用一種專(zhuān)用的洗脫液把熒光發(fā)光體全部釋放，在匯集熒光增強(qiáng) 液三辛基氧化膦協(xié)同法和Cyber Fluor熒光免疫分析法的優(yōu)點(diǎn)時(shí)，摒棄了他 們的缺陷。
綜上所述，本發(fā)明的具體技術(shù)方案為
在關(guān)鍵的步驟(4)中，使用洗脫液使固相熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物形成游離 熒光標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定的概念及技術(shù)。而洗脫液的組成特征是以陰離子型表 面活性劑十二垸基硫酸鈉(SDS)為溶質(zhì)，去離子水、蒸餾水或三羥甲基氨基 甲烷(Tris)水溶液為溶劑。洗脫液的作用原理是使以化學(xué)交聯(lián)或以物理形
式吸附于載體(如聚苯乙烯或聚氯乙烯微孔板)或聚苯乙烯或聚氯乙烯的微 粒(球)上的含有熒光發(fā)光體的熒光標(biāo)記復(fù)合物在洗脫液的作用下形成游離 熒光標(biāo)記物質(zhì)，從而不僅提高了測(cè)定的靈敏度，同時(shí)又避免了操作過(guò)程中外 源性稀土離子的污染，保證了測(cè)定結(jié)果的可靠性。洗脫液具有抵御水分子對(duì) 熒光淬滅作用，同時(shí)能以最佳條件降低表面活性劑對(duì)熒光的干擾，提高穩(wěn)定 性。所提供的洗脫液具體配方是以蒸餾水、去離子水或三羥甲基氨基甲烷(Tris)為溶劑，以〈1.5%質(zhì) 量百分比的十二烷基硫酸鈉(SDS)為溶質(zhì)的溶液，優(yōu)先推薦的SDS的質(zhì)量 百分比為0.3%。在免疫反應(yīng)結(jié)束后，用所述的洗滌液清洗載體除去多余的 未反應(yīng)物，加入含有陰離子型表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)的洗脫液， 通過(guò)振蕩器振蕩或手工震搖30分鐘，或通過(guò)超聲波洗滌10-30分鐘，使熒 光發(fā)光體或熒光標(biāo)記物從載體表面洗脫下來(lái)并測(cè)定熒光值，其洗脫液中的 熒光含量與待測(cè)物質(zhì)的含量存在著良好的線(xiàn)性關(guān)系。所述的洗脫液的解離形式為以下三種中的任一種(A)解離熒光標(biāo)記 免疫復(fù)合物對(duì)載體的吸附；(B)解離熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物之間的結(jié)合；(C) 解離熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物中的熒光發(fā)光體或包裹、吸附、聯(lián)結(jié)有熒光發(fā)光 體的發(fā)光微粒(球)與生物活性物質(zhì)的結(jié)合。所述的熒光標(biāo)記生物活性物質(zhì)的制備制備可在三種狀態(tài)下進(jìn)行(A) 雙功能螯合劑螯合稀土離子形成熒光發(fā)光體標(biāo)記生物活性物質(zhì)；(B)雙功 能螯合劑標(biāo)記生物活性物質(zhì)后再螯合稀土離子形成熒光發(fā)光體；(C)標(biāo)記 有雙功能螯合劑的生物活性物質(zhì)參與免疫反應(yīng)，待免疫反應(yīng)完成后，在進(jìn) 行洗脫前、洗脫過(guò)程中以及洗脫后加入稀土離子與標(biāo)記在生物活性物質(zhì)上 的雙功能螯合劑螯合形成熒光發(fā)光體。
所述的固相生物物質(zhì)的形成是將經(jīng)過(guò)修飾或未經(jīng)過(guò)修飾的生物活性物質(zhì) 與經(jīng)過(guò)修飾處理或未經(jīng)過(guò)修飾處理的各種載體通過(guò)物理吸附、化學(xué)交聯(lián)的方 法結(jié)合。所述的稀土熒光發(fā)光體的制備是以4, 7-雙(氯磺?；交?-1， 10-菲啰啉-2， 9-二羧酸(BCPDA)或具有其基本結(jié)構(gòu)的螯合劑和稀土離子形成的 螯合物為熒光發(fā)光體或吸附、內(nèi)含熒光發(fā)光體的各類(lèi)納米尺度級(jí)磁性熒光微 粒、納米尺度級(jí)高分子塑料熒光微粒、納米尺度級(jí)硅膠微粒為熒光發(fā)光 體的技術(shù)。螯合劑與稀土離子具有一次性鰲合形成熒光發(fā)光體，熒光發(fā)光體標(biāo)記生 物活性物質(zhì)后，稀土離子Eu3+無(wú)需再與其它的螯合劑或配位體結(jié)合就具有較 強(qiáng)的發(fā)射熒光能力。所述的熒光發(fā)光體或雙功能螯合劑標(biāo)記生物活性物質(zhì)，其特征在于標(biāo)記 方式可以是熒光發(fā)光體或雙功能螯合劑直接與各種生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、 鏈霉親和素、生物素、多糖物質(zhì)、多肽、激素、抗體等結(jié)合，也可以將熒光 發(fā)光體包裹在微粒(球)中再以化學(xué)交聯(lián)形式或以物理吸附的形式與各種生 物活性物質(zhì)結(jié)合，或?qū)晒獍l(fā)光體(或雙功能螯合劑)和各種生物活性物質(zhì) 以化學(xué)鍵形式或以物理吸附的形式分別與微粒(球)表面結(jié)合。雙功能螯合劑的結(jié)構(gòu)式為(1) 4， 7-雙(氯璜?；交?-1， 10-菲啰啉-2， 9- 二羧酸4， 7-bis(chlorosulf-phenyl)-l, 10-phenanthrolinc-2， 9-diearboxylic acid (BCPDA)，結(jié)構(gòu)式如圖6 (a)所示，(2)及其包裹在微粒(球)內(nèi)或 吸附、聯(lián)接在微粒(球)上具有圖6 (b)所示的分子基本結(jié)構(gòu)式的鰲合劑。 其中，各種包裹在微粒(球)內(nèi)或吸附、聯(lián)接在微粒(球)上的芳香羧 酸類(lèi)鰲合劑水楊酸、苯甲酸。e-二酮體類(lèi)鰲合劑乙酰丙酮(AA)、苯甲 酰丙酮(BA)、 二苯甲酰甲垸(DBM)、苯甲酰三氟丙酮(BTA)、 P-萘酰三氟 丙酮(P-NTA)、噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)、三甲基乙酰三氟丙酮(PTA)。
所述的微粒(球)的直徑尺度范圍是35nm-100nm。 由此可見(jiàn)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、 基本解決了固相時(shí)間分辨熒光免疫中使用熒光增強(qiáng)液三辛基氧化膦協(xié) 同法檢測(cè)存在的稀土元素離子污染問(wèn)題，使用本發(fā)明所采用的"一次鰲合" 形成的熒光發(fā)光體即使受到大量稀土離子的污染，其熒光強(qiáng)度依然保持原樣， 從而極大提高了測(cè)定的重復(fù)性與穩(wěn)定性。2、 摒棄了 Cyber Fluor時(shí)間分辨熒光免疫分析法操作程序中特殊烘干 的步驟，避免了空氣濕度變化導(dǎo)致的不穩(wěn)定性，同時(shí)縮短了檢測(cè)時(shí)間。3、 本發(fā)明使載體微孔內(nèi)壁及底部結(jié)合的熒光標(biāo)記物得到充分洗脫利用， 使測(cè)量熒光值增強(qiáng)了5-10倍，提高了檢測(cè)的靈敏度和精確性。克服了 Cyber Fluor時(shí)間分辨熒光免疫分析法只能測(cè)量利用載體微孔底部面積所結(jié)合的熒 光標(biāo)記物，而造成的測(cè)量熒光值低，靈敏度和精確性差的缺陷。4、 結(jié)合磁微粒技術(shù)，本發(fā)明便于固相時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)全自動(dòng)化設(shè) 備的應(yīng)用。5、 適用的免疫檢測(cè)方法，包括雙抗原夾心法、雙抗體夾心法、間接法、 競(jìng)爭(zhēng)法、抗酶抗體法或競(jìng)爭(zhēng)性抑制法。


圖l.銪螯合物激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。圖2.銪螯合物消除樣品熒光干擾原理示意圖。圖中，短壽命熒光通常的熒 光體發(fā)光和檢測(cè)樣品中的干擾熒光都是短壽命熒光易重迭。長(zhǎng)壽命熒光稀 土元素如銪發(fā)出的光才是長(zhǎng)壽命熒光，利用避開(kāi)延緩時(shí)間僅用計(jì)數(shù)時(shí)間作熒 光測(cè)定即為時(shí)間分辨熒光技術(shù)。圖3.用銪螯合物(BCPDA-Eu3+)標(biāo)記抗體的雙抗體夾心法測(cè)定血清中甲種胎 兒球蛋白(AFP)的工作曲線(xiàn)。
圖4.用銪螯合物(BCPDA-Eu3+)-生物素-親和素標(biāo)記抗體的雙抗體夾心法測(cè) 定血清中前列腺特異性抗原的(PSA)的工作曲線(xiàn)。 圖5.用50Mm-Tris和蒸餾水為溶劑的不同SDS。/。濃度洗脫液的洗脫效果。 圖6.BCPDA的結(jié)構(gòu)式(a)和包裹在微粒(球)內(nèi)螯合劑的基本結(jié)構(gòu)(b)。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)實(shí)施舉例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。 實(shí)施例1.用銪螯合物(BCPDA-Eu3+)標(biāo)記抗體，用雙抗體夾心法測(cè)定血清中甲種胎 兒球蛋白(AFP)為例，具體步驟如下 A. Eu3+-BCPDA-羊抗人AFP-IgG抗體的標(biāo)記1) BCPDA標(biāo)記羊抗人AFP-IgG抗體取羊抗人AFP-IgG抗體(l.Omg/ml Medix Biochemica) 100" 1,加入到 pH9. l的碳酸鹽緩沖液900u l中，配成O. lmg/ml羊抗人AFP-IgG抗體碳酸鹽溶 液。同時(shí)將lmg BCPDA溶于50ul二甲基甲酰胺(DMF)即為BCPDA溶液，將該 BCPDA溶液平均分成4份。每隔2min將l份BCPDA溶液攪拌加入到上述O. lmg/ml 羊抗人AFP-IgG抗體碳酸鹽溶液中，在8min內(nèi)加完。攪拌反應(yīng)30min，取G-50葡 萄糖作為凝膠及l(fā)cmX 15cm的層吸柱，用pH8. 0的朋4^03為洗脫液，洗脫流速 為6滴/min，分離羊抗人AFP-IgG抗體-BCPDA和過(guò)量的BCPDA。收集洗脫液在 0. lmol/L， pH值9.6的NaHC03緩沖溶液3升透析2次后，力tlNaN3到0. 1%濃度4°。 保存。產(chǎn)物即為羊抗人AFP-IgG抗體-(BCPDA) n。2) 羊抗人AFP-IgG抗體-(BCPDA- EiT)n的制備用含Eu3+Tris-^1緩沖液(含￡113+ 10—6mol I/1)稀釋羊抗人AFP-IgG抗體-(BCPDA)n溶液，將上述稀釋溶液置于25'C恒溫水浴中加熱反應(yīng)2h,制備成羊 抗人AFP-IgG抗體-(BCPDA- Eu3+)n標(biāo)記物。B.人血清中AFP的測(cè)定1) 抗體固相將含抗人AFP單克隆抗體(MedixBiochemica， 5ug/ml)的0. lmol/L pH 9. 6 NaHC03緩沖溶液100ul分注于載體各微孔中。載體置4。C， 24小時(shí)。用含O. 05 % Tween-20的0. 05mol/L pH 7.8 Tris-HC1緩沖溶液的洗滌液洗滌4次。2) AFP的時(shí)間分辨熒光免疫分析測(cè)定用含有5%BSA-0. 9%NaCl的pH值7. 5的0. 05mol/L Tris-HC1緩沖溶液稀 釋人AFP (DakopaUs, Denmark)制得AFP標(biāo)準(zhǔn)溶液，將此標(biāo)準(zhǔn)溶液和血清 樣品分別100ul注入上述已固相抗體的載體各微孔中，將載體置37"C， l小 時(shí)后，用上述洗滌液洗滌4次。然后加入lOOul的羊抗人AFP-IgG抗體 -(BCPDA-Eu3+)n標(biāo)記物，37°C， 1小時(shí)后，用上述洗滌液洗滌4次，拍干。 再加入0. 3%十二烷基硫酸鈉(SDS) - 50mmol/L Tris溶液的洗脫液，用振蕩 器振蕩30分鐘，然后測(cè)量熒光值。3)測(cè)量?jī)x器為新波公司的SYM-D10時(shí)間 分辨熒光儀測(cè)定，測(cè)量條件激發(fā)波長(zhǎng)，340nm;檢測(cè)波長(zhǎng)，613rnn;遲延時(shí) 間，0.2ms;窗口時(shí)間，0.4ms;循環(huán)時(shí)間，l.Oms。用本發(fā)明提供的方法測(cè)定AFP的工作曲線(xiàn)(如圖3所示)用零濃度時(shí) 的熒光信號(hào)(本底)的標(biāo)準(zhǔn)差(SD) 3倍計(jì)算AFP測(cè)定的最低檢出下限，得 本法的最低檢出下限為1.23ug/L。工作曲線(xiàn)上限可達(dá)230ug/L。 實(shí)施例2用含銪螯合物-親和素-生物素標(biāo)記抗體，用雙抗體夾心法測(cè)定血清前列 腺特異性抗原(PSA)為例，具體檢測(cè)步驟是A. Eu3+-BCPDA的制備用Tris-HCl緩沖液(含￡113+ 10-6mol L—》稀釋水解的 BCPDA溶液,將上述溶液置于37"C恒溫水浴中加熱反應(yīng)2h,制得Eu、BCPDA。B. Eu3+-BCPDA螯合物標(biāo)記鏈親合素(SA)的制備
取lmg SA溶于0. 5ml 0. 05 mol/L的pH9. 6碳酸鹽緩沖液中，加入相當(dāng) 于12倍SA摩爾量的Eu3+-BCPDA螯合物，在4"C反應(yīng)過(guò)夜，產(chǎn)物經(jīng)S印hadex G-50柱層析，0.05 mol/L pH 7. 75的Tris-HC1溶液(含O.薩aCl)淋洗。 得純化的Eu3+-BCPDA-SA，標(biāo)記比值Eu37 SA為IO。 C.生物素標(biāo)記羊抗人PSA的抗體制備1. Omg的羊抗人PSA抗體(1. Omg/ml Medix Biochemica)在4°C， 24小 時(shí)對(duì)3升蒸餾水溶液兩次透析后，加入8.4mg的NaHC03和3mg的 NHS-LC-biotin(Pierce Chemical Co),室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)后，4。C繼續(xù)反應(yīng) 24小時(shí)。取反應(yīng)液于4°C ， 24小時(shí)內(nèi)對(duì)含有0. 25gNaN3的0. lmol/L NaHC03水 溶液兩次透析。于反應(yīng)液中加入5mg的BSA和5mg的NaN3。反應(yīng)液放置-20 。C備用。但用于免疫測(cè)定時(shí)，用0. 05 mol/L pH 7. 75的Tris-HC1緩沖溶液 稀釋1000倍后使用。 D.人血清中PSA的測(cè)定1) 抗體固相將含抗人PSA單克隆抗體(Medix Biochemica， 4. 5ug/ml)的0. lmol/LpH 9.6NaHC03緩沖溶液100ul分注于載體各微孔中。載體置4'C， 24小時(shí)。用含 0.05 % Tween-20的0. 05mol/L pH 7.8 Tris-HCl緩沖溶液的洗滌液洗滌4次。2) 人血清中PSA的時(shí)間分辨熒光免疫分析測(cè)定用含有5WBSA-0.9。/。NaCl的pH 值7. 5的0. 05mol/L Tris-HC1緩沖溶液稀釋人PSA (Dakopatts， Denmark)制 得PSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，將此標(biāo)準(zhǔn)溶液和血清樣品分別100ul注入上述已固相抗體的 載體各微孔中，將載體置37t， l小時(shí)后，用上述洗滌液洗滌4次。然后加入 100ul含量5ug/ml的生物素標(biāo)記的抗PSA抗體溶液，37°C， l小時(shí)，用上述洗滌 液洗滌4次，再加入100ul Eu3+-BCPDA-SA溶液，37°C， l小時(shí)，用上述洗滌液 洗滌4次，拍干。再加入O. 3%十二烷基硫酸鈉(SDS) - 50mmol/LTris溶液的 洗脫液，用振蕩器振蕩30分鐘，然后測(cè)量熒光值。
3) 測(cè)定儀器為新波公司的SYM-D10時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定，測(cè)定條件激發(fā)波長(zhǎng)，340nm;檢測(cè)波長(zhǎng)，613nm;遲延時(shí)間，0. 2ms;窗口時(shí)間，0. 4ms; 循環(huán)時(shí)間，l.Oms。4) 用本發(fā)明提供的方法測(cè)定PSA的工作曲線(xiàn)(如圖4所示) 用零濃度時(shí)的熒光信號(hào)(本底)的標(biāo)準(zhǔn)差(SD) 3倍計(jì)算AFP測(cè)定的最低檢 出下限，得本法的最低檢出下限為O. 13ug/L。工作曲線(xiàn)上限可達(dá)235ug/L。
權(quán)利要求
1、一種經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫的檢測(cè)方法，其特征在于所述的檢測(cè)的步驟是a)在載體上預(yù)先固定生物活性物質(zhì)，形成固相生物活性物質(zhì)；b)加入待測(cè)的樣品，樣品中的待測(cè)物與固相生物活性物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，形成固相免疫復(fù)合物。除去樣品中未反應(yīng)的物質(zhì)；c)加入標(biāo)記有熒光發(fā)光體的生物活性物質(zhì)，與固相免疫復(fù)合物進(jìn)行免疫反應(yīng)，形成固相熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物，且除去多余的熒光標(biāo)記物；d)用洗脫液使固相熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物形成游離熒光標(biāo)記物質(zhì)，最后用熒光儀檢測(cè)游離熒光標(biāo)記物質(zhì)的熒光信號(hào)值；所述的洗脫液是以陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉為溶質(zhì)，去離子水、蒸餾水或三羥甲基氨基甲烷水溶液為溶劑。
2、 按權(quán)利要求1所述的經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫的檢測(cè)方法，其特征在于洗脫 液中十二烷基硫酸鈉的質(zhì)量百分比小于1. 5%。
3、 按權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫的檢測(cè)方法，其特征在于 洗脫液中十二垸基硫酸鈉的質(zhì)量百分比為0. 3%。
4、 按權(quán)利要求1所述的經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫的檢測(cè)方法，其特征在于所述 固相生物物質(zhì)的形成是將經(jīng)過(guò)修飾或未經(jīng)過(guò)修飾的生物活性物質(zhì)與經(jīng)過(guò)修飾 處理或未經(jīng)修飾處理的各種載體通過(guò)物理吸附、化學(xué)交聯(lián)的方法結(jié)合。
5、 按權(quán)利要求1所述的經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫的檢測(cè)方法，其特征在于所述 的熒光發(fā)光體是由螯合劑與稀土離子一次性鰲合形成，熒光發(fā)光體標(biāo)記生物 活性物質(zhì)后，稀土離子Eu3+具有強(qiáng)的發(fā)射熒光能力。
6、 按權(quán)利要求5所述經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫的檢測(cè)方法，其特征在于螯合劑 具有雙功能，以下述三種狀態(tài)中的任一種狀態(tài)與稀土離子進(jìn)行螯合(A)雙 功能螯合劑螯合稀土離子形成熒光發(fā)光體再標(biāo)記生物活性物質(zhì)；(B)雙功能 螯合劑標(biāo)記生物活性物質(zhì)后再螯合稀土離子形成熒光發(fā)光體；(C)標(biāo)記有雙 功能螯合劑的生物活性物質(zhì)在被洗脫前、洗脫過(guò)程中以及洗脫后加入稀土離 子與標(biāo)記在生物活性物質(zhì)上的雙功能螯合劑螯合形成熒光發(fā)光體。
7、 按權(quán)利要求5所述的經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫的檢測(cè)方法，其特征在于熒光發(fā)光體標(biāo)記生物活性物質(zhì)的方式為下述三種中的任一種(1)熒光發(fā)光體或 雙功能螯合劑直接與蛋白質(zhì)、鏈霉親和素、生物素、多糖物質(zhì)、多肽、激素或抗體的各種生物活性物質(zhì)結(jié)合；(2)將熒光發(fā)光體包裹在微?；蛭⑶蛑性?以化學(xué)交聯(lián)形式或以物理吸附的形式與生物活性物質(zhì)結(jié)合；(3)將熒光發(fā)光 體或雙功能螯合劑和生物活性物質(zhì)以化學(xué)鍵形式或以物理吸附的形式分別與 微?；蛭⑶虮砻娼Y(jié)合。
8、 按權(quán)利要求6或7所述的經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫的檢測(cè)方法，其特征在于 所述的雙功能螯合劑的結(jié)構(gòu)式為(1) 4,7-雙(氯璜酰基苯基)-1， lO-菲喂啉-2，9-二羧酸的結(jié)構(gòu)式為(2)包裹在微?；蛭⑶騼?nèi)或吸附、聯(lián)接在微?；蛭⑶蛏系啮椇蟿┑幕窘Y(jié)構(gòu) 式為
9、按權(quán)利要求8所述的經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫的檢測(cè)方法，其特征在于所述 的各種包裹在微粒或微球內(nèi)或吸附、聯(lián)接在微?；蛭⑶蛏系姆枷泗人犷?lèi)鰲合 劑為水楊酸或苯甲酸；0-二酮體類(lèi)鰲合劑為乙酰丙酮、苯甲酰丙酮、二苯甲 酰甲垸、苯甲酰三氟丙酮、萘酰三氟丙酮、噻吩甲酰三氟丙酮或三甲基乙 酰三氟丙酮；所述的微?；蛭⑶虻某叨确秶?5nm-100nm。
10、按權(quán)利要求1所述的經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫的檢測(cè)方法，其特征在于用洗脫液把固相熒光標(biāo)記復(fù)合物從載體上解離下來(lái)，形成游離熒光標(biāo)記復(fù)合物的解離形式為解離熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物對(duì)載體的吸附、解離熒光標(biāo)記免疫 復(fù)合物之間的結(jié)合、或解離熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物中的熒光發(fā)光體或包裹、吸 附、聯(lián)結(jié)有熒光發(fā)光體的發(fā)光微?；蛭⑶蚺c生物活性物質(zhì)的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種經(jīng)改進(jìn)的固相熒光免疫的檢測(cè)方法，其特征在于用提供的洗脫液使固相熒光標(biāo)記免疫復(fù)合物形成游離標(biāo)記物質(zhì)，再進(jìn)行測(cè)定。所述的洗脫液是由陰離子表面活性劑SDS為溶質(zhì)，以水或Tris水溶液為溶劑，通過(guò)化學(xué)交聯(lián)或物理吸附方法，形成游離熒光標(biāo)記物質(zhì)，提高了檢測(cè)的靈敏度?；窘鉀Q了固相時(shí)間分辨熒光免疫中存在的稀土元素離子污染問(wèn)題，摒棄了現(xiàn)有技術(shù)中復(fù)雜的烘干工藝，提高了檢測(cè)重復(fù)性和穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)G01N33/58GK101158688SQ20071017061
公開(kāi)日2008年4月9日 申請(qǐng)日期2007年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月19日
發(fā)明者張瑞鎬, 忻鼎廣 申請(qǐng)人:張瑞鎬;忻鼎廣