一種白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法
【專利摘要】一種白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法，采用高效液相色譜?熒光檢測器(HPLC?FLD)法對白酒中的吡嗪類化合物進(jìn)行定性和定量分析，能夠同時測定白酒中的2?甲基吡嗪、2,3?二甲基吡嗪、2,5?二甲基吡嗪、2,6?二甲基吡嗪、2,3,5?三甲基吡嗪、2?乙基?6?甲基吡嗪、2,3,5,6?四甲基吡嗪、2,3?二甲基?5?乙基吡嗪8種吡嗪類化合物。該方法不需要經(jīng)過化學(xué)衍生，也不需手性柱或添加手性試劑就可分離吡嗪3種同分異構(gòu)體，方法靈敏度高，準(zhǔn)確度和重復(fù)性好，操作簡單，成本低廉。
【專利說明】
一種白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法，屬于白酒檢測技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 吡嗪是一種1，4位含氮類的六元雜環(huán)化合物，它的衍生物廣泛存在于天然和發(fā)酵 食品中。近年來對白酒中風(fēng)味物質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)雖然吡嗪類化合物在白酒中的含量甚微，但 其具有風(fēng)味閾值低，香氣透散性好，并對其它香味物質(zhì)有明顯的烘托疊加作用等特點(diǎn)，對白 酒的風(fēng)味起著重要的作用。白酒中的四甲基吡嗪（川芎嗪）由美拉德反應(yīng)生成，在制曲和堆 積發(fā)酵的過程中產(chǎn)生，經(jīng)蒸餾帶入酒中，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)及抑制雪小板集聚等作 用，賦予中國白酒健康功能。所以對白酒中吡嗪類化合物的分析檢測顯得尤為重要。
[0003] 目前國內(nèi)外對吡嗪類化合物的分離方法主要有液液萃取，真空濃縮后液液萃取， 固相萃取，離子交換和超臨界萃取等。研究結(jié)果主要有王莉等人建立了一種利用氣相色譜-質(zhì)譜-離子掃描聯(lián)用(GC/MS-SHO技術(shù)，該方法只定量分析了白酒中4種重要化合物;張艷紅 等人采用SPME與GC/FTD相結(jié)合的方法，定量了8種吡嗪類化合物;李建飛等人建立了 SPME-GC-MS-SIM聯(lián)用檢測白酒中含氮類化合物。然而，以上方法需要大量的有機(jī)試劑，樣品用量 大，且步驟過于繁瑣，預(yù)處理過程中被分析物損失較大，對于白酒中吡嗪的高效液相色譜-熒光檢測器的檢測方法，未見報(bào)道。
[0004] 因此，建立一種操作簡單，準(zhǔn)確性高和重復(fù)性能夠得到保證的檢測白酒中8種吡嗪 類化合物的方法，有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于，提供一種白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法，即 建立高效液相色譜-熒光檢測器分析中國白酒中吡嗪類化合物的方法，用于我國白酒中吡 嗪類化合物的分析，本發(fā)明方法能夠同時測定白酒中8種吡嗪類化合物，不需要衍生化、對 吡嗪同分異構(gòu)體的分離不需要使用手性柱或手性添加劑，方法前處理簡單，靈敏度高，重復(fù) 性好。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法，包括下述步驟：
[0008] 色譜條件:色譜柱：苯基柱Gemini 5μ〇6 - Phenyl IlOA 250mmX4.6mm;流動相由 流動相A和流動相B組合進(jìn)行梯度洗脫，流動相A: pH= 1.8~2.3的含磷酸水溶液;流動相B: 乙腈;流速：1.0 mL/min;柱溫：30°C ;進(jìn)樣量：IOyL;
[0009] 焚光檢測器條件：Ex = 280nm，Em = 348nm;
[0010] 對照溶液的配制：分別精確稱取2-甲基吡嗪、2,5_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡嗪、 2,3_二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2,3,5，6_四甲基吡嗪、2,3_二甲 基-5-乙基吡嗪對照品，用乙醇溶解定容，得標(biāo)準(zhǔn)儲備液；
[0011] 供試品溶液的制備：取酒樣于具塞離心管中，調(diào)pH為14,加 NaCl將其飽和，乙醚振 蕩萃取，收集乙醚層，水浴揮至適量，水定容，過〇. 45μπι濾膜，HPLC-FLD進(jìn)樣分析；
[0012] 用外標(biāo)法定量計(jì)算2-甲基啦嗪、2,3_二甲基吡嗪、2,5_二甲基啦嗪、2,6_二甲基吡 嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5，6_四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡 嗪8種吡嗪化合物的濃度。
[0013] 具體地說，前述的白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法，包括下述步驟：
[0014] 色譜條件:色譜柱：苯基柱Gemini 5yC6 - Phenyl IlOA 250mmX4.6mm;流動相由 流動相A和流動相B組成，流動相A: pH= 1.8~2.3的含磷酸水溶液;流動相B:乙腈;梯度洗脫 流動相設(shè)置:按體積計(jì)算，Omin:含流動相A 95%，流動相B 5 % ; 6min:流動相A 95%，流動 相B 5% ;6. Imin:流動相A 1%，流動相B 99%; 12min:流動相A 1%，流動相B 99%; 12. Imin:流動相A 83%，流動B 17%; 12. Imin:流動相A 83%，流動B 17%; 12. Imin:流動 相A 83%，流動B 17%; 16min:流動相A 83%，流動B 17%; 16. Imin:流動相A 95%，流動B 5%;25min:流動相A 95%，流動B 5%;流速：1.0mL/min;柱溫:30°C;進(jìn)樣量：10yL;
[0015] 焚光檢測器條件：Ex = 280nm，Em = 348nm;
[0016] 對照溶液的配制：分別精確稱取2-甲基吡嗪、2,5_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡嗪、 2,3_二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2,3,5，6_四甲基吡嗪、2,3_二甲 基-5-乙基吡嗪對照品各100± 10mg，用乙醇溶解定容，得10mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4°C冰 箱中；
[0017] 供試品溶液的制備:取酒樣于具塞離心管中，用NaOH溶液調(diào)pH為12，再用NaOH溶液 調(diào)pH為14，加 NaCl將其飽和，乙醚振蕩萃取，收集乙醚層，水浴揮至適量，水定容，過0.45μπι 濾膜-HPLC-FLD進(jìn)樣分析；
[0018] 用外標(biāo)法定量計(jì)算2-甲基吡嗪、2,3_二甲基吡嗪、2,5_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡 嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5，6_四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡 嗪8種吡嗪化合物的濃度。
[0019] 更具體地說，前述的白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法，包括下述步 驟：
[0020] 色譜條件：色譜柱：苯基柱Gemini 5yC6 - Phenyl IlOA 250mmX4.6mm;流動相由 流動相A和流動相B組成，流動相A: pH= 1.9~2.2的含磷酸水溶液;流動相B:乙腈;梯度洗脫 流動相設(shè)置:按體積計(jì)算，Omin:含流動相A 95%，流動相B 5 % ; 6min:流動相A 95%，流動 相B 5% ;6. Imin:流動相A 1%，流動相B 99%; 12min:流動相A 1%，流動相B 99%; 12. Imin:流動相A 83%，流動B 17%; 12. Imin:流動相A 83%，流動B 17%; 12. Imin:流動 相A 83%，流動B 17%; 16min:流動相A 83%，流動B 17%; 16. Imin:流動相A 95%，流動B 5%;25min:流動相A 95%，流動B 5%;流速：1.0mL/min;柱溫:30°C;進(jìn)樣量：10yL;
[0021 ]焚光檢測器條件：Ex = 280nm，Em = 348nm;
[0022] 對照溶液的配制：分別精確稱取2-甲基吡嗪、2,5_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡嗪、 2,3_二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2,3,5，6_四甲基吡嗪、2,3_二甲 基-5-乙基吡嗪對照品各100± 10mg，用乙醇溶解定容，得10mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4°C冰 箱中；
[0023] 供試品溶液的制備：取酒樣IOmL于具塞50mL離心管中，用12moI/LNaOH調(diào)pH為12， 再用lmol/L NaOH調(diào)pH為14，加 NaCl將其飽和，15mL乙醚振蕩萃取15min，重復(fù)提取2次，收集 乙醚層，70 °C水浴揮至約0.5ml，水定容ImL，過0.45μπι濾膜-HPLC-FLD進(jìn)樣分析；
[0024]用外標(biāo)法定量計(jì)算2-甲基吡嗪、2,3_二甲基吡嗪、2,5_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡 嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5，6_四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡 嗪8種吡嗪化合物的濃度。
[0025]前述的白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法中，所述的流動相A的含磷 酸水溶液的PH=2.1。
[0026] 前述的白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法中，所述對照溶液這樣配 制：分別精確稱取2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2，6_二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙 基-6-甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪對照品 各IOOmg，用乙醇溶解定容，得10mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4°C冰箱中，用純水稀釋為質(zhì)量濃 度從低到高依次為0 · lyg/mL、0 · 2yg/mL、0 · 5yg/mL、1 · Oyg/mL、2 · Oyg/mL、5 · Oyg/mL的吡嗪類 混合對照品溶液，測定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液的工 作曲線；
[0027] 前述的白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法中，所述檢測方法按下式用 外標(biāo)法定量計(jì)算8種啦嗪化合物的濃度。
[0028]
[0029]式中：
[0030] X--試樣中吡嗪的含量，單位為mg/L
[0031 ] c--由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得試樣進(jìn)樣液中吡嗪的濃度，單位為微克每毫升(yg/mL); [0032] Co--由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得空白試樣進(jìn)樣液中吡嗪的濃度，單位為微克每毫升(yg/ mL)；
[0033] Vi--試樣定容體積，單位為毫升(mL);
[0034] V--取樣量，單位為_升(mL)
[0035]結(jié)果保留2為有效數(shù)字。
[0036] 前述的白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法中，所述的白酒的酒精濃度 為38~53度。
[0037] 前述的白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法中，所述的白酒為：以曲類、 酒母為糖化發(fā)酵劑，利用淀粉質(zhì)原料，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、陳釀和勾兌而釀制而成的 各類酒。
[0038] 前述的白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法，所述的白酒中8種吡嗪類 化合物為:2_甲基吡嗪、2,3_二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基 吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5,6_四甲基吡嗪和2,3_二甲基-5-乙基吡嗪。
[0039] 前述的白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法，所述的白酒為：中國特有 的一種蒸餾酒，以曲類、酒母為糖化發(fā)酵劑，利用淀粉質(zhì)原料，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、陳 釀和勾兌而釀制而成的各類酒。
[0040] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0041] (1)方法靈敏度高，準(zhǔn)確度和重復(fù)性好，操作簡單，成本低廉。
[0042] (2)能夠同時測定白酒中8種吡嗪類化合物，不需要衍生化、對吡嗪同分異構(gòu)體的 分離不需要使用手性柱或手性添加劑。
[0043] 發(fā)明人采用高效液相色譜檢測方法-熒光檢測器(HPLC-FLD)法對白酒中吡嗪類物 質(zhì)的測定，進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，具體如下：
[0044] 1.1儀器與試劑
[0045]高效液相色譜儀(Aglient-1260,美國安捷倫公司），配有DAD光電二極管陣列檢測 器和FLD熒光檢測器;超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司）；氮吹儀(TurboVap LV);旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELANYC-2100) ;Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)(密理博中國有限公司）；恒溫水 浴鍋:振蕩混勾器(Multi Reax，德國Heidolph公司）。
[0046] 吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品：2-甲基吡嗪U 99 % )、2，5-二甲基吡嗪U 98 % )、2，6-二甲基吡嗪 (98%)、2,3-二甲基吡嗪（99%)、2-乙基-6-甲基吡嗪（95%)、2,3,5-三甲基吡嗪（2 99%)、 2,3,5,6_四甲基吡嗪98%)，均購于上海安譜科學(xué)儀器有限公司；2,3_二甲基-5-乙基吡 嗪，購于山東省滕州市華東生物科技有限公司。
[0047]甲醇(分析純及色譜純）；乙腈(分析純及色譜純）；甲酸(色譜純），以上試劑均購置 MERCK公司；磷酸（色譜級、純度2 99.9% )，購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;無水乙醇、乙 醚(色譜級、純度2 99.5 % )，購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；
[0048] 1.2實(shí)驗(yàn)操作
[0049] 1.2.1前處理方法
[0050] 取IOmL白酒，加入 12mol/L NaOH調(diào)pH為 12,再用lmol/L NaOH調(diào)pH為 14。加 NaCl將 其飽和，用15mL乙醚振蕩萃取15min，重復(fù)提取2次，收集乙醚層，無水硫酸鈉干燥;置70°C水 浴揮至約0.5ml，水定容ImL，過0.45μηι濾膜，供高效液相色譜分析。
[0051 ] 1 · 2 · 2HPLC 色譜條件
[0052]流動相Α:含磷酸水溶液(ρΗ = 2.1);流動相Β:乙腈;梯度洗脫流動相設(shè)置:按體積 計(jì)算，Omin:含流動相A 95%，流動相B 5% ;6min:流動相A 95%，流動相B 5%;6. Imin:流 動相A 1%，流動相B 99%; 12min:流動相A 1%，流動相B 99%; 12. Imin:流動相A 83%，流 動B 17%; 12. Imin:流動相A 83%，流動B 17%; 12. Imin:流動相A 83%，流動B 17%; 16min:流動相A 83%，流動B 17%; 16 .Imin:流動相A 95%，流動B 5%; 25min:流動相A 95%，流動 B 5%;色譜柱：苯基柱 Gemini 5yC6 -Phenyl 110A，250mmX4.6mm;柱流速： I .OmL/min;柱溫：30°C ;進(jìn)樣量：IOyL;焚光檢測器條件:Ex = 280nm，Em = 348nm。
[0053]用8種吡嗪類化合物標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，建立濃度范圍為0.5~5yg/mL的8種吡嗪類 化合物標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和高效液相色譜峰峰面積的校正曲線，與HPLC所測的樣品中8中吡嗪 的峰面積進(jìn)行比較，用外標(biāo)法定量計(jì)算出對應(yīng)的8種吡嗪的濃度，再換算成原取酒樣中8種 吡嗪的濃度。
[0054] 2結(jié)果與討論
[0055] 2.1吡嗪類物質(zhì)的選擇
[0056] 本研究選用典型的白酒的代表酒樣8個，采用酸化液液萃取、調(diào)堿、再萃取，最后真 空濃縮的樣品前處理方法，對8個酒樣中的吡嗪類化合物進(jìn)行的提取，采用GC-MS全掃描的 方式進(jìn)行吡嗪類化合物的粗篩，以確定白酒中含量高的吡嗪化合物。通過對峰面積大小的 比較，發(fā)現(xiàn)8個典型酒樣有吡嗪類物質(zhì)的含量具有一定的共性，其中每種酒樣檢測到的吡嗪 類化合物種類不等，約有19-25種，但是含量高的前五種吡嗪化合物均是2，3，5-三甲基吡 嗪、2，3,5，6_四甲基吡嗪、2,3_二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪和2,6_二甲基吡嗪， 雖然這五種吡嗪在8個酒樣中含量高低排列順序不完全一致，但是他們都排在前五位，且按 峰面積計(jì)算含量約占總量的73.97 %~90.0 O %之間。同時還發(fā)現(xiàn)8個酒樣中含量較高的前 九種吡嗪也基本相似，且按面積計(jì)算含量約占總量的86.61 %~95.50%之間。含量高的前 9種吡嗪化合物為：2，3，5-三甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪和2，3， 5-三甲基-6-乙基吡嗪。能買到標(biāo)準(zhǔn)品的有2，3，5-三甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2，3_二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡 嗪和2-甲基吡嗪這8種物質(zhì)。2,3,5_三甲基-6-乙基吡嗪無法購買到標(biāo)準(zhǔn)品，且考慮該物質(zhì) 在這8種酒樣中的含量排序都不在前五位，因此以能買到標(biāo)準(zhǔn)品的8種吡嗪化合物作為測定 白酒中吡嗪類化合物的目標(biāo)物質(zhì)。即2,3,5_三甲基吡嗪、2,3,5,6_四甲基吡嗪、2,3_二甲 基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2，6_二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪。8種酒樣的全掃描峰面積初步定量結(jié)果見表1，按峰面積計(jì)算含量大概在83.2% ~93.9%左右。
[0057] 表1 8種酒樣氣質(zhì)全掃描含量
[0059] 2.2液相色譜柱的選擇
[0060] 首先選擇了常用的C18色譜柱為分析柱，使用了菲羅門、安捷倫、熱電等不同型號的 C18、C8柱，因?yàn)榉治龅?種吡嗪類化合物均為烷基取代化合物，其中2，3-二甲基吡嗪，2，5-二 甲基吡嗪，2,6_二甲基吡嗪為同分異構(gòu)體，在C 18柱上的保留時間非常接近，如圖1;考慮到吡 嗪類化合物屬于芳雜環(huán)，烷基吡嗪的極性降低，親脂性增強(qiáng)<X 18、C8柱常因硅醇基效應(yīng)而保 留時間延長以及產(chǎn)生包裹及峰拖尾現(xiàn)象，研究者嘗試了在流動相中添加手性添加劑、調(diào)節(jié) 流動相PH值、改變流動相極性等方法均不能分離以上3種同分異構(gòu)體，而若采用手性柱則過 于昂貴(約4萬RMB每根），不利于方法的推廣。在咨詢了其他色譜柱生產(chǎn)廠商，最終采用菲羅 門苯基柱Gemini 5yC6 -Phenyl IlOA 250mmX4.6mm，在甲醇：水(5:95)等度條件下得到 的分離效果圖說明8種吡嗪均有保留，但分離效果需進(jìn)一步改進(jìn)，如圖2。
[0061] 2.3液相檢測器的選擇
[0062] 本研究首先采用DAD檢測器，在波長275nm處測試8種吡嗪類化合物的對照品溶液 均能得到較好的響應(yīng)和較低的檢出限，但在測試樣品過程中，發(fā)現(xiàn)在2,3,5_三甲基吡嗪和 2，3-二甲基吡嗪的中間有一個很大的干擾峰，且這個干擾峰能覆蓋掉2，3，5-三甲基吡嗪， 如圖3。分析這主要是由于紫外檢測器選擇性較差，且白酒中含有大量的醇類、酯類、酚類等 物質(zhì)，這些物質(zhì)大多都有紫外吸收，因此干擾了 2，3，5-三甲基吡嗪和2，3-二甲基吡嗪的出 峰。本研究嘗試了更換流動相條件和改變前處理方法均等手段均無法有效去除這個干擾 峰。在更換FLD檢測器測試樣品后，發(fā)現(xiàn)在2,3,5_三甲基吡嗪和2,3_二甲基吡嗪的峰中間干 擾峰依然存在，但其響應(yīng)比DAD檢測器的信號降低了幾個數(shù)量級，且能與2,3,5_三甲基吡嗪 和2，3-二甲基吡嗪完全分離，如圖4;對比DAD檢測器和FLD檢測器，在分離吡嗪標(biāo)液的時候 均性能良好，在測試相同濃度的對照品溶液時，F(xiàn)LD檢測器和DAD檢測器的響應(yīng)并無優(yōu)劣之 分。但在分析樣品的時候，DAD檢測器在2，3，5-三甲基吡嗪和2，3-二甲基吡嗪的峰中間有很 大的干擾峰，通過前處理無法去掉，在改用FLD檢測器后該干擾峰變低且能與2，3，5-三甲基 吡嗪和2,3-二甲基吡嗪完全分離。所以最終確定采用FLD檢測器，激發(fā)波長Ex: 280nm，發(fā)射 波長 Em: 348nm。
[0063] 2.4液相流動相的選擇
[0064] 為得到簡單易得，分離度高，分析時間短的流動相系統(tǒng)，本發(fā)明方法分別對甲醇+ 水、甲醇+緩沖鹽（乙酸銨）、乙腈+水、乙腈+緩沖鹽（乙酸銨）、甲醇+手性添加劑W環(huán)糊精）、 乙腈+手性添加劑ω環(huán)糊精)等不同的流動相系統(tǒng)進(jìn)行了多次摸索，發(fā)現(xiàn)吡嗪類物質(zhì)在甲醇 +水和甲醇+緩沖鹽系統(tǒng)中的出峰時間較晚，且結(jié)構(gòu)相似的吡嗪類化合物不能分離，在加入 緩沖鹽后分離度不但沒有改善，峰之間會形成包裹，峰形也會拖尾;如圖5。乙腈+水系統(tǒng)的 出峰時間較甲醇系統(tǒng)的提前，峰形也較好，但單純的乙腈水系統(tǒng)并不能使8種吡嗪完全分 離，需進(jìn)一步完善分離效果。如圖6。乙腈+緩沖鹽系統(tǒng)也沒能有效改善分離度，反而使峰形 變差。甲醇祁環(huán)糊精系統(tǒng)、乙腈+β環(huán)糊精系統(tǒng)雖然都能部分吡嗪類物質(zhì)能得到良好的峰形 和分離效果，但卻不能使2,3-二甲基吡嗪、2，5_二甲基吡嗪2，6_二甲基吡嗪三種吡嗪同分 異構(gòu)體完全分離，如圖7為8種吡嗪在乙腈祁環(huán)糊精系統(tǒng)中的分離圖?？紤]到在以上的流動 相系統(tǒng)中，只有乙腈+水系統(tǒng)最接近完全分離，因此決定采用乙腈+水系統(tǒng)作為流動相，在此 基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化分離條件。
[0065] 2.5流動相pH值得確定
[0066]本發(fā)明方法發(fā)現(xiàn)在用液相色譜柱進(jìn)行吡嗪類化合物的分離時，發(fā)現(xiàn)吡嗪類化合物 對流動相的pH值很敏感，pH值有細(xì)微差異，分離效果就會有明顯差異。在乙腈+水的流動相 系統(tǒng)中，加入磷酸調(diào)流動相pH值，不同的pH值條件下，吡嗪類物質(zhì)的出峰時間會出現(xiàn)變化， 出峰時間會隨著流動相pH值的降低而提前。在流動相pH= 1.9時，8種吡嗪類物質(zhì)整體出峰 時間提前，2-甲基吡嗪與2，3,5_三甲基吡嗪、2，3_二甲基吡嗪與2,6_二甲基吡嗪不能分離， 如圖8;在流動相pH= 2.0時，2，3，5-三甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪和2，6-二甲基吡嗪和三種 物質(zhì)不能分離，如圖9。在流動相pH = 2.1時，8種吡嗪類物質(zhì)均能得到良好的分離度，如圖 10。在流動相PH= 2.2時，出現(xiàn)2，3，5-三甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪和2，5-二甲基吡嗪和三 種物質(zhì)不能分離，且2,5_二甲基吡嗪和2,6_二甲基吡嗪兩種物質(zhì)的出峰時間完全重合，各 種物質(zhì)出峰時間都相應(yīng)推遲，不僅沒有改善分離度，反而增加了分析時間，如圖11。因此，本 發(fā)明方法采用pH=2.1時流動相系統(tǒng)，能得到相對較好的分離條件；
[0067]本發(fā)明方法在嘗試了多種流動相梯度后，為保證較短的分析時間的得到良好峰 形，最終確定的流動相梯度:流動相A:含磷酸水溶液(pH=2.1);流動相B:乙腈;梯度洗脫流 動相設(shè)置:按體積計(jì)算，Omin:含流動相A 95 %，流動相B 5 % ; 6min:流動相A 95 %，流動相B 5% ;6. Imin:流動相A 1%，流動相B 99%; 12min:流動相A 1%，流動相B 99%; 12. Imin:流 動相A 83%，流動B 17%; 12. Imin:流動相A 83%，流動B 17%; 12. Imin:流動相A 83%，流 動13 17%;16111；[11:流動相八83%，流動13 17%;16.1111；[11:流動相八95%，流動13 5%;25111；[11: 流動相A 95%，流動B 5%;
[0068] 2.6前處理方法的選擇
[0069]為建立回收率高，成本低，操作簡單，重現(xiàn)性好的前處理方法，本發(fā)明方法試驗(yàn)大 量的前處理方法，以下為其中幾種。
[0070] 方法一：取酒樣IOOmL于旋蒸瓶中-50°C旋轉(zhuǎn)至40mL左右-加水定容到50ml-取 lmL-過0 · 45μπι濾膜-HPLC-FLD進(jìn)樣分析。
[0071]該方法前處理簡單，不用消耗試劑，樣品和消耗量大，回收率低且不穩(wěn)定，且2,3_ 二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪不能被有效提取。如圖12為采用方法一分析某白酒 樣品中8種吡嗪分離色譜圖。
[0072] 方法二：取酒樣IOmL于三角燒瓶中-用12mol/L HCl調(diào)pH為1-50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至 2mL左右-用5mL重蒸乙醚分別萃取3次，收集水層-用12mol/L NaOH調(diào)pH為7,再用lmol/L NaOH緩調(diào)pH為10-加 NaCl將其飽和-用5mL重蒸乙醚分別萃取3次，收集乙醚層-加2g無水 硫酸鈉干燥-過濾-旋蒸濃縮至lmL-水定容至2mL-過0.45μπι濾膜-HPLC-FLD進(jìn)樣分析。
[0073] 該方法能去除掉樣品中的酯、醇類雜質(zhì)，能得到比較干凈的色譜圖，各物質(zhì)峰型良 好，但該方法過程復(fù)雜，耗時長，回收率不高，如圖13為采用方法二分析某白酒樣品中8種吡 嗪分離色譜圖。
[0074] 方法三：取酒樣IOmL于具塞50mL離心管中-用12mol/LNa0H調(diào)pH為12,再用I mol/ LNaOH調(diào)pH為14-加NaCl將其飽和-15mL乙醚振蕩萃取15min，重復(fù)提取2次，收集乙醚層- 70°C水浴揮至約0.5ml-水定容lmL-過0.45μπι濾膜-HPLC-FLD進(jìn)樣分析。
[0075]該方法前處理較為簡單，且方法穩(wěn)定性好，回收率高，8種吡嗪類物質(zhì)分離度高，峰 型和信號響應(yīng)良好，但該法樣品揮干耗時較長，且要留意樣品不能揮干，約剩〇.5ml左右即 可。如圖14為采用方法三分析某白酒樣品中8種吡嗪分離色譜圖。
[0076]表2不同前處理方法優(yōu)缺點(diǎn)的比較
[0078]由表2不同前處理方法優(yōu)缺點(diǎn)的比較，選擇方法三作為酒樣前處理方法。
[0079] 2.6柱溫和流速的選擇
[0080] 以0.1%磷酸溶液-乙腈為流動相，固定流速l.OmL/min不變，在30、40、45、50、60°C 這5個柱溫條件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)柱溫對各種吡嗪類化合物的影響并不明顯，所以采用30°C柱 溫。設(shè)置柱溫30°C，以0.1 %磷酸溶液-乙腈為流動相，考察流速分別為0.5、0.8、1.0、1.2、 1.5mL/min時的分離情況，發(fā)現(xiàn)流速越低，分析時間延長，峰形變差;隨著流速的升高，分析 時間明顯縮短，但影響分離度，綜合分離度和分析時間，因此，選擇1.0mL/min的流速作為分 析流速。
[0081 ] 2.7影響HPLC分析的外界因素
[0082]用HPLC同時分離白酒中的8中吡嗪化合物時，需嚴(yán)格控制流動相得pH值，pH值得細(xì) 微變化會對分離效果造成顯著影響；在對乙醚進(jìn)行揮干濃縮的過程中，應(yīng)嚴(yán)格控制水浴的 溫度為70°C，超過70°C回收率明顯降低。濃縮過程不能將乙醚揮干，應(yīng)嚴(yán)格控制所剩體積在 0.5ml左右，揮干后回收率也會明顯降低。
[0083] 2.8工作曲線和檢測限
[0084] 將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述條件進(jìn)樣分析，得到8種吡嗪的線性方程見表3。在0.5 ~5yg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，可滿足準(zhǔn)確定量 的要求。以S/N = 3確定檢出限，其中2,3,5,6_四甲基吡嗪為0.10yg/mL、2-甲基吡嗪為0.05 yg/mL、2，3，5-三甲基吡嗪為O · 10yg/mL、2，3-二甲基吡嗪為O · 15yg/mL、2，5-二甲基吡嗪為 0.2448/1111^、2,6-二甲基吡嗪為0.1348/1]11^、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪為0.1348/1]11^、2-乙基-6 甲基吡嗪為0.10yg/mL。圖15為對照品含量為最低限0.5yg/mL時8種吡嗪類物質(zhì)的色譜圖， 表3為8種吡嗪的線性關(guān)系。
[0085] 表3 8種吡嗪化合物的線性方程
[0087] 2.9精密度考察
[0088]將2ug/ml的混標(biāo)連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)所得峰面積分別計(jì)算精密度，2，3，5-三甲基吡 嗪、2,3，5，6_四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、 2,3_二甲吡嗪、2，5_二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪的RSD范圍均在1.04%~2.49%之間，表明該 方法的精密度良好，結(jié)果見表4。
[0089]表4 8種吡嗪化合物的精密度實(shí)驗(yàn)
[0092] 2.10重復(fù)性考察
[0093] 精密稱取同一份白酒樣品6份，按1.2.1的方法進(jìn)行前處理，按上述色譜條件進(jìn)樣 1(^1，測得2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲 基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪的平均含量在，RSD 分別為 2.54%、3.01%、4.22%、1.85%、2.13%、2.68%、3.79%、2.80%，結(jié)果表明該方法 的重復(fù)性均達(dá)到分析的要求。
[0094] 2.11回收率考察
[0095]用無水乙醇配置出53%乙醇，作為空白酒樣，加入不同濃度的吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品做加標(biāo) 回收試驗(yàn)，根據(jù)白酒中八種吡嗪化合物含量的高低，其中2-甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2， 5-二甲基吡嗪分別添加 0. lmg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg三個不同水平質(zhì)量濃度，另外五種[!比 嗪分別添加 0. 5mg/kg、lmg/kg、2mg/kg三個不同水平質(zhì)量濃度，每個添加水平做6個平行樣 品，表5數(shù)據(jù)表明該方法測定八種吡嗪化合物精密度和回收率良好。
[0096] 表5方法回收率和精密度(n = 6)
[0099] 3部分白酒中吡嗪類物質(zhì)的含量
[0100] 我們用所建立的方法對這31個具有代表性酒樣中的吡嗪化合物含量進(jìn)行了測定， 定量結(jié)果見表6。
[0101] 表6部分白酒中吡嗪化合物的含量(mg/L)

Lmu4」 對31個秤中八柙PK嗪化甘物的總重進(jìn)仃J排夕?，如表6所不。從這二卞個日酒 樣測定數(shù)據(jù)我們可以看出，其中四甲基吡嗪在21個酒中含量排在第一位，在7個酒中含量排 在第二位，在3個酒中含量排在第三位;三甲基吡嗪在18個酒中含量排在第二位，在7個酒中 含量排在第一位，在6個酒中含量排在第三位;2,6_二甲基吡嗪在31個酒樣中排在前三位的 占30個，這和我們最初用氣質(zhì)全掃描初步定量的結(jié)果是相吻合的，可以看出四甲基吡嗪和 三甲基吡嗪含量大約都在幾個毫克每升，對于白酒中的吡嗪類物質(zhì)來說含量算高的。
[0105] 4結(jié)論
[0106] 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜測定方法，利用吡嗪類 物質(zhì)的熒光特性、特定的流動相系統(tǒng)和流動相梯度洗脫程序、一定的萃取濃縮過程等關(guān)鍵 技術(shù)，建立了帶熒光檢測器的高效液相色譜儀測定白酒中8種吡嗪類化合物含量的方法，色 譜條件如下：色譜柱為苯基柱Gemini 5μ〇6 - Phenyl IlOA 250mmX4.6mm;焚光檢測器條 件:Ex = 280nm，Em = 348nm;流動相A:含磷酸水溶液(pH = 2 · I);流動相B:乙腈；采用梯度洗 脫程序。該方法對8種吡嗪類化合物的回收率為85.3%~102.2%，RSD為2.57%~4.11 %， 檢出限為0.05~0.24yg/mL。說明該方法準(zhǔn)確度、靈敏度、和重復(fù)性好，而且樣品不需要化學(xué) 衍生，也不要手性柱或添加手性試劑就可分離3種吡嗪同分異構(gòu)體，使用價格相對低廉的高 效液相色譜儀，操作簡便?？赏糜谥袊拙浦羞拎侯惢衔锏娜粘z測，如圖16。
【附圖說明】
[0107] 圖1是在普通C18柱上2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪三種同 分異構(gòu)體的分離色譜圖。
[0108] 圖2是采用菲羅門苯基柱Gemini 5yC6 -Phenyl IlOA 250mmX4.6mm，在甲醇：水 作為流動相，等度條件下得到的8種吡嗪分離效圖。
[0109] 圖3是采用DAD檢測器，在波長275nm處進(jìn)行樣品實(shí)測中，2，3，5-三甲基吡嗪和2，3-二甲基吡嗪的中間的干擾峰。
[0110] 圖4是采用FLD檢測器測試樣品，在2,3,5_三甲基吡嗪和2,3_二甲基吡嗪的峰中間 干擾峰依然存在，但其響應(yīng)比DAD檢測器的信號降低了幾個數(shù)量級，且能與2,3,5_三甲基吡 嗪和2,3-二甲基吡嗪完全分離。
[0111] 圖5是甲醇+緩沖鹽系統(tǒng)中的8種吡嗪的分離色譜圖，結(jié)構(gòu)相似的吡嗪類化合物不 能分離，峰之間會形成包裹，峰形也會拖尾。
[0112]圖6是乙腈+水系統(tǒng)中的8種吡嗪的分離色譜圖，部分吡嗪間分離度高，峰形良好， 但單純的乙腈水系統(tǒng)并不能使8種吡嗪完全分離。
[0113]圖7是為8種吡嗪在乙腈祁環(huán)糊精系統(tǒng)中的分離圖，出峰時間較乙腈+水系統(tǒng)延遲， 峰之間有包裹，分離度不高。
[0114] 圖8是采用乙腈:pH= 1.9的磷酸水溶液時的8種吡嗪分離色譜圖。
[0115] 圖9是采用乙腈:pH=2.0的磷酸水溶液時的8種吡嗪分離色譜圖。
[0116] 圖10是采用乙腈:pH=2.1的磷酸水溶液時的8種吡嗪分離色譜圖。
[0117] 圖11是采用乙腈:pH=2.2的磷酸水溶液時的8種吡嗪分離色譜圖。
[0118] 圖12是采用方法一分析某白酒樣品中8種吡嗪分離色譜圖。
[0119] 圖13是為采用方法二分析某白酒樣品中8種吡嗪分離色譜圖。
[0120] 圖14是為采用方法三分析某白酒樣品中8種吡嗪分離色譜圖。
[0121] 圖15是為對照品含量為最低限0.5yg/mL時8種吡嗪類物質(zhì)的分離色譜圖。
[0122] 圖16是采用FLD檢測器時8種吡嗪化合物標(biāo)準(zhǔn)品的最佳分離色譜圖。出峰順序分別 為2,3,5,6_四甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3,5_三甲基吡嗪、2,3_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡 嗪、2，5_二甲基吡嗪，2，3_二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪。
【具體實(shí)施方式】
[0123] 實(shí)施例1:
[0124] 白酒中吡嗪類化合物的高效液相色譜檢測方法，包括下述步驟：
[0125] 色譜條件:色譜柱：苯基柱Gemini 5yC6 - Phenyl IlOA 250mmX4.6mm;流動相由 流動相A和流動相B組成，流動相A:pH = 2.1的含磷酸水溶液;流動相B:乙腈;梯度洗脫流動 相設(shè)置:按體積計(jì)算，Omin:含流動相A 95 %，流動相B 5 % ; 6min:流動相A 95 %，流動相B 5% ;6. Imin:流動相A 1%，流動相B 99%; 12min:流動相A 1%，流動相B 99%; 12. Imin:流 動相A 83%，流動B 17%; 12. Imin:流動相A 83%，流動B 17%; 12. Imin:流動相A 83%，流 動13 17%;16111；[11:流動相八83%，流動13 17%;16.1111；[11:流動相八95%，流動13 5%;25111；[11: 流動相A 95%，流動B 5%;流速：1.0mL/min;柱溫:30°C;進(jìn)樣量：10yL;
[0126]焚光檢測器條件：Ex = 280nm，Em = 348nm;
[0127] 對照溶液的配制：分別精確稱取2-甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、 2,3_二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2,3,5，6_四甲基吡嗪、2,3_二甲 基-5-乙基吡嗪對照品IOOmg，用乙醇溶解定容，得lOmg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4°C冰箱中， 用純水稀釋為質(zhì)量濃度從低到高依次為0 · lyg/mL、0 · 2yg/mL、0 · 5yg/mL、1.0yg/mL、2 · Oyg/ mL、5.0yg/mL的吡嗪類混合對照品溶液，測定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐 標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線；
[0128] 供試品溶液的制備：取IOml白酒，置于50ml具塞離心管中，加入12moI/LnaOH溶液 調(diào)pH為12，再用lmol/L NaOH溶液調(diào)pH為14;加 NaCl將其飽和，15mL乙醚振蕩萃取15min，重 復(fù)提取2次，收集乙醚層，無水硫酸鈉干燥;70 °C水浴揮至約0.5ml，水定容ImL，過0.45μηι濾 膜，供高效液相色譜檢測儀分析；
[0129] 用外標(biāo)法定量計(jì)算2-甲基吡嗪、2,3_二甲基吡嗪、2,5_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡 嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5，6_四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡 嗪8種吡嗪化合物的濃度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種白酒中化嗦類化合物的高效液相色譜檢測方法，其特征在于:包括下述步驟： 色譜條件:色譜柱:苯基柱Gemini扣Cs-陸en^ 110A 250mmX4.6mm;流動相由流動相 A和流動相B組合進(jìn)行梯度洗脫，流動相A:pH= 1.8~2.3的含憐酸水溶液;流動相B:乙臘;流 速：1. OmL/min;柱溫：30 °C ;進(jìn)樣量：lOyL 巧光檢測器條件:Ex = 280皿，血=348皿； 對照溶液的配制：分別精確稱取2-甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二甲基化嗦、2,3- 二甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2,3,5-S甲基化嗦、2,3,5,6-四甲基化嗦、2,3-二甲基- 5-乙基化嗦對照品，用乙醇溶解定容，得標(biāo)準(zhǔn)儲備液； 供試品溶液的制備：取酒樣于具塞離屯、管中，調(diào)pH為14,加 NaCl將其飽和，乙酸振蕩萃 取，收集乙酸層，水浴揮至適量，水定容，過0.45WI1濾膜，HPLC-FLD進(jìn)樣分析； 用外標(biāo)法定量計(jì)算2-甲基化嗦、2,3-二甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二甲基化嗦、 2.3.5- S甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2,3,5,6-四甲基化嗦、2,3-二甲基-5-乙基化嗦8 種化嗦化合物的濃度。2. 如權(quán)利要求1所述的白酒中化嗦類化合物的高效液相色譜檢測方法，其特征在于:包 括下述步驟： 色譜條件:色譜柱:苯基柱Gemini扣Cs-陸en^ 110A 250mmX4.6mm;流動相由流動相 A和流動相B組成，流動相A:抑=1.8~2.3的含憐酸水溶液;流動相B:乙臘;梯度洗脫流動相 設(shè)置：按體積計(jì)算，Omin:含流動相A 95%，流動相B 5%;6min:流動相A 95%，流動相B 5%;6.1min:流動相Al%，流動相B99%;12min:流動相Al%，流動相B99%;12.1min:流 動相A 83%，流動B 17%; 12. Imin:流動相A 83%，流動B 17%; 12. Imin:流動相A 83%，流 動B 17%;16min:流動相A 83%，流動B 17%;16.1min:流動相A 95%，流動B 5%;25min: 流動相A 95%，流動B 5%;流速:1.0mL/min;柱溫:30°C;進(jìn)樣量 巧光檢測器條件:Ex = 280皿，血=348皿； 對照溶液的配制：分別精確稱取2-甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二甲基化嗦、2,3- 二甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2,3,5-S甲基化嗦、2,3,5,6-四甲基化嗦、2,3-二甲基- 5-乙基化嗦對照品各100 ± lOmg，用乙醇溶解定容，得lOmg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4°C冰箱 中； 供試品溶液的制備:取酒樣于具塞離屯、管中，用化0田容液調(diào)抑為12，再用化0田容液調(diào)抑 為14,加化C1將其飽和，乙酸振蕩萃取，收集乙酸層，水浴揮至適量，水定容，過0.45WI1濾膜 一 HPLC-FLD進(jìn)樣分析； 用外標(biāo)法定量計(jì)算2-甲基化嗦、2,3-二甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二甲基化嗦、 2.3.5- S甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2,3,5,6-四甲基化嗦、2,3-二甲基-5-乙基化嗦8 種化嗦化合物的濃度。3. 如權(quán)利要求2所述的白酒中化嗦類化合物的高效液相色譜檢測方法，其特征在于:包 括下述步驟： 色譜條件:色譜柱:苯基柱Gemini扣Cs-陸en^ 110A 250mmX4.6mm;流動相由流動相 A和流動相B組成，流動相A:抑=1.9~2.2的含憐酸水溶液;流動相B:乙臘;梯度洗脫流動相 設(shè)置：按體積計(jì)算，Omin:含流動相A 95%，流動相B 5%;6min:流動相A 95%，流動相B 5%;6.1min:流動相Al%，流動相B99%;12min:流動相Al%，流動相B99%;12.1min:流 動相A 83%，流動B 17%; 12. Imin:流動相A 83%，流動B 17%; 12. Imin:流動相A 83%，流 動B 17%;16min:流動相A 83%，流動B 17%;16.1min:流動相A 95%，流動B 5%;25min: 流動相A 95%，流動B 5%;流速:1.0mL/min;柱溫:30°C;進(jìn)樣量 巧光檢測器條件:Ex = 280皿，血=348皿； 對照溶液的配制：分別精確稱取2-甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二甲基化嗦、2,3- 二甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2，3,5-Ξ甲基化嗦、2，3,5,6-四甲基化嗦、2,3-二甲基- 5-乙基化嗦對照品各100 ± lOmg，用乙醇溶解定容，得lOmg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4°C冰箱 中； 供試品溶液的制備：取酒樣1 OmL于具塞50mL離屯、管中，用12mo 1 /LNaOH調(diào)pH為12，再用 Imol/L化0H調(diào)抑為14,加化C1將其飽和，15mL乙酸振蕩萃取15min，重復(fù)提取2次，收集乙酸 層，70°C水浴揮至約0.5ml，水定容ImL，過0.45皿濾膜一HPLC-FLD進(jìn)樣分析； 用外標(biāo)法定量計(jì)算2-甲基化嗦、2,3-二甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二甲基化嗦、 2，3,5-Ξ甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2，3,5,6-四甲基化嗦、2,3-二甲基-5-乙基化嗦8 種化嗦化合物的濃度。4. 根據(jù)權(quán)利要求1 -3中任一項(xiàng)所述的白酒中化嗦類化合物的高效液相色譜檢測方法， 其特征在于:所述的流動相A的含憐酸水溶液的抑=2.1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1 -3中任一項(xiàng)所述的白酒中化嗦類化合物的高效液相色譜檢測方法， 其特征在于:所述對照溶液運(yùn)樣配制：分別精確稱取2-甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二 甲基化嗦、2,3-二甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2，3,5-Ξ甲基化嗦、2，3,5,6-四甲基化 嗦、2，3-二甲基-5-乙基化嗦對照品各lOOmg，用乙醇溶解定容，得lOmg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存 于4°C冰箱中，用純水稀釋為質(zhì)量濃度從低到高依次為0.化g/mL、0.化g/mL、0.化g/mL、1.化 g/血、2急旨/1111、5.〇4旨/1111的化嗦類混合對照品溶液，現(xiàn)憶峰面積，從質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰 面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線；6. 根據(jù)權(quán)利要求1 -3中任一項(xiàng)所述的白酒中化嗦類化合物的高效液相色譜檢測方法， 其特征在于:所述檢測方法按下式用外標(biāo)法定量計(jì)算8種化嗦化合物的濃度。式中： X--試樣中化嗦的含量，單位為mg/L C一一由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得試樣進(jìn)樣液中化嗦的濃度，單位為微克每毫升(yg/mL); CO一一由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得空白試樣進(jìn)樣液中化嗦的濃度，單位為微克每毫升(yg/mL); VI一一試樣定容體積，單位為毫升(mL); V--取樣量，單位為毫升(mL)7. 根據(jù)權(quán)利要求1 -3中任一項(xiàng)所述的白酒中化嗦類化合物的高效液相色譜檢測方法， 其特征在于:所述的白酒的酒精濃度為38~53度。8. 根據(jù)權(quán)利要求1 -3中任一項(xiàng)所述的白酒中化嗦類化合物的高效液相色譜檢測方法， 其特征在于，所述的白酒為：W曲類、酒母為糖化發(fā)酵劑，利用淀粉質(zhì)原料，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā) 酵、蒸饋、陳釀和勾兌而釀制而成的各類酒。9. 根據(jù)權(quán)利要求1 -3中任一項(xiàng)所述的白酒中化嗦類化合物的高效液相色譜檢測方法， 其特征在于，所述的白酒中8種化嗦類化合物為:2-甲基化嗦、2,3-二甲基化嗦、2,5-二甲基 化嗦、2,6-二甲基化嗦、2,3,5-Ξ甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2,3,5,6-四甲基化嗦和2， 3-二甲基-5-乙基化嗦。
【文檔編號】G01N30/02GK105842377SQ201610328926
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】龍四紅, 孫棣, 廖妍儼, 馮永渝, 田志強(qiáng), 尋思穎, 趙貴斌, 楊敏, 黃家?guī)X, 楊波
【申請人】貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院