一種基于高效液相色譜法檢測卷煙煙氣所含角鯊烯的樣品液凈化處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及卷煙煙氣中成分的檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種高效液相色譜 法檢測卷煙煙氣所含角鯊烯的樣品液凈化處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 角鯊烯最初是從鯊魚的肝油中發(fā)現(xiàn)的，1914年被命名為Squalene，其化學(xué)名稱為 2,6，10，15，19,23-六甲基一2,6，10，14，18,22-二十四碳六烯，屬開鏈三萜類化合物。
[0003] 角鯊烯具有提高人體內(nèi)超氧化物歧化酶(S0D)活性、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化性和免疫能 力、改善性功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能，是一種無毒性的具有防病治病作 用的生物活性物質(zhì)。最近研究發(fā)現(xiàn)角鯊烯對(duì)人體還具有解毒作用，可移除組織中的脂溶性 毒素。已有研究表明：在煙絲中添加一定量的角鯊烯，可降低煙氣中幾種有害物質(zhì)和自由基 含量，表明角鯊烯具有獨(dú)特降害作用，目前開發(fā)利用角鯊烯已成為科技界和煙草業(yè)研究的 熱點(diǎn)。
[0004] 2014年4月，國家煙草專賣局下發(fā)關(guān)于加快卷煙降焦減害技術(shù)成果推廣應(yīng)用的通 知（國煙辦綜[2014]218號(hào)），提出要加大卷煙減害技術(shù)重大專項(xiàng)研究成果的應(yīng)用推廣力度， 要采取針對(duì)性技術(shù)措施加快卷煙降焦減害步伐。為了配合國家局加快卷煙降焦減害步伐的 重大決策，本申請(qǐng)人在完成中國煙草總公司2013年度科技面上項(xiàng)目《廣西主流煙氣天然抗 氧化劑角鯊烯的生態(tài)累積與減害研究》（中煙辦[2013] 149號(hào))研究基礎(chǔ)上，迫切需要建立一 種可行的適于標(biāo)準(zhǔn)的主流煙氣角鯊烯含量的檢測方法。
[0005] 但是，目前國內(nèi)外還沒有可參考的煙氣中尤其是主流煙氣中角鯊烯定性和定量的 檢測方法，因此，在煙草行業(yè)建立烤煙中角鯊烯定性和定量的檢測方法具有前瞻性，也是十 分必要的。而在煙氣中角鯊烯的檢測中，良好的樣品前處理方法對(duì)獲得準(zhǔn)確科學(xué)的檢測結(jié) 果起到關(guān)鍵性作用。在確定的檢測條件下，采用不同提取劑提取樣品中角鯊烯，其提取效 率、提取操作用時(shí)等因素都是必須考慮的重要因素，各個(gè)因素之間又是相互影響的關(guān)系，目 前未見基于高效液相色譜法檢測煙葉中角鯊烯的樣品前處理研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是填補(bǔ)現(xiàn)有煙氣中角鯊烯的檢測技術(shù)不足，尤其是適于 高效液相色譜法檢測煙氣中角鯊烯的樣品前處理方法的不足，提供一種基于高效液相色譜 法檢測卷煙煙氣所含角鯊烯的樣品液凈化處理方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0008] 提供一種基于高效液相色譜法檢測卷煙煙氣所含角鯊烯的樣品液凈化處理方法， 包括以下步驟：
[0009] S11.收集煙氣固粒相物并提取:抽吸卷煙，采用濾片收集煙氣固粒相物；
[0010] S12.提取:將收集了煙氣固粒相物劍橋?yàn)V片放入錐形瓶中，加入提取劑，常溫下振 蕩提取，得提取液；
[0011] S13.凈化:取步驟S12所得提取液，經(jīng)過再處理后得到的溶液再經(jīng)過柱，氯仿洗脫， 收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用色譜乙腈定容，過〇. 22μπι濾膜即得待測樣品液；
[0012] 其中，步驟S12所述提取劑為氯仿；
[0013]步驟S13所述再處理指的是將步驟S12所得提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用正己烷溶解， 再用正己烷洗滌；
[0014]步驟S13所述過柱是采用硅膠和Ν-丙基乙二胺復(fù)合固相萃取柱。
[0015] 優(yōu)選地，步驟S11所述抽吸卷煙是按照GB/T 16450標(biāo)準(zhǔn)。步驟S11所述濾片為Φ 92mm的劍橋?yàn)V片。
[0016] 優(yōu)選地，步驟S12所述振蕩提取是用搖床以130轉(zhuǎn)/min振蕩20min。
[0017] 優(yōu)選地，步驟S13所述洗滌的次數(shù)為3次。
[0018]優(yōu)選地，步驟S13所述硅膠和N-丙基乙二胺復(fù)合固相萃取柱的裝柱方法為稱取 0. lgPSA和0. lg硅膠裝柱，上方加1.0g無水硫酸鈉。
[0019] 基于所述樣品前處理方法，本發(fā)明同時(shí)提供一種高效液相色譜法檢測主流煙氣中 所含角鯊烯的方法，以甲醇和乙腈為流動(dòng)相，采用填有粒徑5μπι的高效固定相的柱色譜分離 技術(shù)，精確吸取lOyL待測樣品液注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分離，用紫外吸收檢測器，于 210nm波長處檢測角鯊烯的吸收值，采用外標(biāo)法，根據(jù)吸收峰面積計(jì)算其含量。
[0020] 所述高效液相色譜法檢測主流煙氣中所含角鯊烯的方法包括以下步驟：
[0021] S1.樣品經(jīng)前處理得到樣品液；
[0022] S2.配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0023] S3.檢測:取樣品液液注入高效液相色譜儀檢測；
[0024] S4.采用外標(biāo)法，根據(jù)吸收峰面積計(jì)算角鯊烯含量。
[0025] 所述檢測的檢測條件為：
[0026] (1)高效液相色譜儀HPLC(AgilentllOO)配紫外檢測器；
[0027] (2)色譜柱：C18 柱，5ym，4.6X25〇mm;
[0028] ⑶柱溫：20°C;
[0029] (4)流動(dòng)相類型：甲醇：乙腈(V:V = 70:30);
[0030] (5)流動(dòng)相流速:0.8mL/min;
[0031] (6)檢測波長為：210nm;
[0032] (7)進(jìn)樣量：10yL。
[0033] 步驟S2所述配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法是準(zhǔn)確稱取0. lg角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，精確至O.OOOlg， 用乙腈(色譜純)溶解后定容至100mL配制成1000mg/L的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分振蕩搖勻。所 配標(biāo)準(zhǔn)溶液置于4°C保存，待用。
[0034] 步驟S2所述角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立的方法是:采用系列稀釋法，分別配制成濃度 為0.002，0.01，0.05，0.2，0.5mg/mL的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液于高效液相色譜進(jìn)樣檢測；以進(jìn)樣濃 度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出角鯊烯濃度與相應(yīng)峰面積的線性回歸方 程。
[0035] 本發(fā)明適用于卷煙主流煙氣中角鯊烯的檢測。
[0036]本發(fā)明具有以下有益效果：
[0037]本發(fā)明針對(duì)卷煙煙氣建立了一種適于高效液相色譜法檢測煙葉中角鯊烯的樣品 前處理方法，采用氯仿作為提取溶劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后用正己烷溶解和洗滌，保障了較高的 提取效率。再經(jīng)硅膠和N-丙基乙二胺復(fù)合固相萃取柱科學(xué)凈化，很好地去除雜質(zhì)?；谒?樣品前處理方法，可建立煙氣中角鯊烯的高效液相色譜檢測方法，色譜峰分離較好，具有準(zhǔn) 確、快速、高靈敏、重現(xiàn)性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0038] 圖1角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0039]圖2角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖（lmg/L角鯊烯標(biāo)樣，峰面積= 41.9)。
[0040] 圖3角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖（5mg/L角鯊烯標(biāo)樣，峰面積= 213.3)。
[0041] 圖4氯仿提取液未添加角鯊烯空白樣品色譜圖。
[0042]圖5氯仿提取液添加40mg/kg(換算為煙絲含量)角鯊烯樣品色譜圖。
[0043]圖6未經(jīng)凈化處理效果色譜圖（空白對(duì)照）。
[0044]圖7未經(jīng)凈化處理效果色譜圖（添加40mg/kg角鯊烯樣品）。
[0045] 圖8用PSA和硅膠復(fù)合柱凈化后樣品的色譜圖（空白對(duì)照）。
[0046] 圖9用PSA和硅膠復(fù)合柱凈化后樣品的色譜圖（添加40mg/kg角鯊烯樣品）。
[0047]圖10氯仿提取液直接過柱處理后色譜圖。
[0048]圖11氯仿提取液再經(jīng)正己烷溶解后過柱處理后色譜圖。
[0049]圖12 C8柱檢測樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，5mg/kg角鯊烯標(biāo)樣）。
[0050] 圖13 C8柱檢測樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，空白對(duì)照）。
[0051] 圖14 C8柱檢測樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，添加40mg/kg角鯊烯的樣品）。 [0052]圖15 C8柱檢測樣品的色譜圖（流動(dòng)相乙腈:水，5mg/kg角鯊烯標(biāo)樣）。
[0053]圖16 C8柱檢測樣品的色譜圖（流動(dòng)相乙腈:水，空白對(duì)照）。
[0054]圖17 C8柱檢測樣品的色譜圖（流動(dòng)相乙腈:水，添加40mg/kg角鯊烯的樣品）。
[0055]圖18 C18柱檢測樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，75:25，流速1. OmL/min，柱溫30 °C，波長210nm，5mg/kg角藍(lán)稀標(biāo)樣）。
[0056] 圖19 C18柱檢測樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，75:25，流速1. OmL/min，柱溫30 。(：，波長210nm，空白對(duì)照）。
[0057]圖20 C18柱檢測樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，75:25，流速1. OmL/min，柱溫30 °C，波長210nm，添加40mg/kg角藍(lán)稀的樣品）。
[0058] 圖21 C18柱檢測樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，70:30，流速0.8mL/min，柱溫20 。(：，波長210nm，空白對(duì)照）。
[0059]圖22 C18柱檢測樣品的色譜圖（流動(dòng)相流動(dòng)相甲醇：乙腈，70:30，流速0.8mL/min， 柱溫20°C，波長210nm，添加40mg/kg角藍(lán)稀的樣品）。
【具體實(shí)施方式】
[0060]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明方法。下述實(shí)施例和附圖僅用于示 例性說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。除非特別說明，下述實(shí)施例中使用的試劑原料為常 規(guī)市購或商業(yè)途徑獲得的試劑原料，除非特別說明，下述實(shí)施例中使用的方法和設(shè)備為本 領(lǐng)域常規(guī)使用的方法和設(shè)備。為方便說明，本發(fā)明實(shí)施例中使用的儀器和試劑說明如下，但 并不因此限定本發(fā)明。
[0061]儀器：
[0062] (1)高效液相色譜儀HPLC(AgilentllOO)，配備:脫氣栗、四元栗、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫 箱和紫外檢測器(美國Agilent公司）
[0063] (2)全溫控?fù)u床(江蘇金壇市榮華儀器有限公司）
[0064] (3)電子天平(BSA2245，d = 0.1mg，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）
[0065] (4)旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器:ZFQ-3型(上海亞榮生化儀器廠）
[0066] (5)真空抽濾栗:SHZ-Dm型(鞏義市予華儀器廠）
[0067] (6)IICA?：MS3basic渦旋儀(MS：3BS25，IKA)
[0068] (7)RM2〇OA 吸煙機(jī)（德國）
[0069] (8)固相萃取柱(varian)
[0070] (9)各種實(shí)驗(yàn)室通用玻璃器皿
[0071] 試劑：
[0072] (1)99.8%角鯊烯對(duì)照品（中國藥檢所）
[0073] (2)甲醇(色譜純）
[0074] (3)乙腈(色譜純）
[0075] (4)正己烷(分析純）
[0076] (5)三氯甲烷(氯仿，分析純）
[0077] (6)石油醚(分析純）
[0078] (7)0·22μπι 有機(jī)濾膜
[0079] (8)凈化劑:PSA(Welchrom)，硅膠(200-300目，青島海洋化工廠）
[0080] (9)商品煙(從廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品中隨機(jī)性抽取）
[0081 ] 實(shí)施例1
[0082] 1.角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
[0083] 準(zhǔn)確稱取O.lg角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，精確至O.OOOlg，用乙腈（色譜純）溶解后定容至 100mL配制成1000mg/L角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分振蕩搖勻。所配標(biāo)準(zhǔn)溶液置于4°C保存。
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