(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)谷胱甘肽的熒光生物傳感方法，屬于生物分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

(二)

背景技術(shù)：

谷胱甘肽(gsh)是由谷氨酸、半胱氨酸以及甘氨酸組成的三肽，是活細(xì)胞中含量最多的非蛋白硫醇，是抵抗毒素的第一道防線。它在保持細(xì)胞平衡、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控、解毒等方面具有重要作用。通常，gsh的失衡會(huì)引起多種疾病發(fā)生，如肝病、艾滋病、糖尿病、癌癥等。所以，發(fā)展靈敏高效的gsh檢測(cè)方法具有重要意義。

目前，對(duì)于gsh的檢測(cè)有電化學(xué)法、高效液相色譜法、比色法、熒光法等。其中，熒光法具有高靈敏度、非破壞性、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。近來(lái)，有多種有機(jī)探針被開(kāi)發(fā)用于gsh檢測(cè)，如利用邁克爾加成反應(yīng)，二硫鍵斷裂、巰基親核取代反應(yīng)等。盡管取得良好效果，但是大部分有機(jī)探針合成及純化步驟較多，成本較高，限制了其應(yīng)用。也有一些熒光納米材料如量子點(diǎn)、金納米簇、熒光碳納米材料、上轉(zhuǎn)換納米顆粒被開(kāi)發(fā)用于gsh檢測(cè)，但是有一些不足存在，如量子點(diǎn)合成時(shí)用到重金屬鎘，金簇或熒光碳納米材料用到汞離子來(lái)淬滅熒光、上轉(zhuǎn)換納米顆粒合成復(fù)雜及成本高。所以，開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)單、高靈敏度、高選擇性的熒光檢測(cè)gsh方法仍具有較高科學(xué)價(jià)值和實(shí)用價(jià)值。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于改善現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡(jiǎn)單、靈敏高、選擇性高的gsh熒光檢測(cè)方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種檢測(cè)谷胱甘肽的熒光生物傳感方法，所述方法包括：

(1)化學(xué)還原法合成二氧化錳納米材料，配制鄰苯二胺溶液；

(2)將二氧化錳納米材料與鄰苯二胺溶液混合反應(yīng)，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光光譜測(cè)定，獲得熒光參照值f0；反應(yīng)溫度為20～90℃，反應(yīng)時(shí)間為1分鐘～1小時(shí)，二氧化錳納米材料濃度為1μg/ml～500μg/ml，鄰苯二胺濃度為0.1mm～100mm，二氧化錳納米材料：鄰苯二胺質(zhì)量用量之比為1：1～50；

(3)將梯度濃度谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液與二氧化錳納米材料進(jìn)行反應(yīng)，將反應(yīng)后溶液與鄰苯二胺溶液混合共反應(yīng)，二氧化錳納米材料與鄰苯二胺溶液用量同步驟(2)，測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物熒光值f，以谷胱甘肽濃度為橫坐標(biāo)，以f0-f值為縱坐標(biāo)，得到不同濃度谷胱甘肽響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)待測(cè)含谷胱甘肽樣品溶液與二氧化錳納米材料反應(yīng)，將反應(yīng)后溶液與鄰苯二胺溶液混合共反應(yīng)，二氧化錳納米材料與鄰苯二胺溶液用量同步驟(2)，測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物熒光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得樣品中谷胱甘肽濃度值。

本發(fā)明以二氧化錳納米材料為氧化劑和識(shí)別元件，在無(wú)gsh時(shí)，二氧化錳納米材料催化氧化鄰苯二胺產(chǎn)生氧化鄰苯二胺產(chǎn)物用于熒光檢測(cè)，在gsh存在下，gsh降解二氧化錳納米材料，抑制二氧化錳對(duì)鄰苯二胺的氧化能力，減弱熒光信號(hào)。通過(guò)比較熒光值的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)gsh的檢測(cè)。該發(fā)明原理示意圖如圖1所示。

優(yōu)選的，所述步驟(1)二氧化錳納米材料合成方法如下：高錳酸鉀溶液加入2-(n-嗎啉)乙磺酸緩沖液中，超聲反應(yīng)得到棕色產(chǎn)物，離心洗滌3～5次，重新分散于二次水中使得濃度為1mg/ml；其中，高錳酸鉀濃度為0.1～100mm，2-(n-嗎啉)乙磺酸緩沖液濃度為1mm～1m、ph值為5.0～7.4，超聲時(shí)間為10分鐘～2小時(shí)。

所述步驟(1)鄰苯二胺溶液配制方法如下：稱取108mg鄰苯二胺固體，加入0.5ml乙醇溶解后再加入9.5ml二次水配制成100mm鄰苯二胺溶液。

步驟(3)谷胱甘肽溶液濃度為0～100μm，反應(yīng)時(shí)間為1分鐘～1小時(shí)。

步驟(4)中谷胱甘肽樣品溶液可為水溶液、緩沖溶液、血清樣品或細(xì)胞裂解液樣品等。待測(cè)樣品若濃度較高，可稀釋之后再進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明操作更為簡(jiǎn)便，靈敏度高、簡(jiǎn)單、成本低廉，可特異性檢測(cè)gsh；本發(fā)明的檢測(cè)方法可有效應(yīng)用于生物液體樣品中g(shù)sh的檢測(cè)。

(四)附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的檢測(cè)谷胱甘肽的原理示意圖。

圖2為本發(fā)明制備的二氧化錳納米片表征圖；(a)高錳酸鉀溶液及生成二氧化錳的吸收?qǐng)D；(b)二氧化錳納米片的透射電鏡圖；(c)二氧化錳納米片的拉曼光譜圖；(d)二氧化錳納米片的x射線光電子能譜圖(mn2p)。

圖3為二氧化錳納米片用于檢測(cè)不同濃度的谷胱甘肽熒光光譜圖及線性圖，(a)熒光響應(yīng)圖；(b)相應(yīng)的熒光與濃度響應(yīng)線性相關(guān)圖。其中，f0為未加入谷胱甘肽時(shí)的熒光值，f為加入不同濃度谷胱甘肽后熒光值。

圖4為二氧化錳納米片檢測(cè)谷胱甘肽的選擇性實(shí)驗(yàn)圖，所選擇干擾物分別為：磷酸鹽緩沖液(pbs)、氯化鉀溶液(kcl)、氯化鈉(nacl)、氯化鎂(mgcl2)，以上濃度為100mm；葡萄糖(glucose)、甘氨酸(gly)、絲氨酸(ser)、賴氨酸(lys)、天冬氨酸(asp)，以上濃度為10mm；牛血清白蛋白(bsa)、人血清白蛋白(hsa)、葡萄糖氧化酶(gox)，以上濃度為10mg/ml。

圖5為二氧化錳納米片檢測(cè)細(xì)胞裂解液中谷胱甘肽的熒光光譜圖。(a)檢測(cè)不同數(shù)目細(xì)胞裂解液中的谷胱甘肽；(b)細(xì)胞裂解液經(jīng)nem預(yù)處理后，熒光響應(yīng)變化。

圖6為二氧化錳納米片檢測(cè)血清中谷胱甘肽的熒光光譜圖。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：

二氧化錳納米材料的合成：1ml高錳酸鉀溶液(10mm)與2.5mlmes緩沖液(0.1m,ph6.0)混勻后，再加入6.5ml二次水；之后，置于超聲清洗器中超聲反應(yīng)30分鐘，至棕色絮狀產(chǎn)物形成。將反應(yīng)后棕色產(chǎn)物8000轉(zhuǎn)每分鐘10分鐘離心及水洗3次，以除去未反應(yīng)的離子。最后，將所獲得二氧化錳納米片超聲分散于二次水中，濃度為1mg/ml。圖2證明成功合成了二氧化錳材料，其中，(a)圖為高錳酸鉀溶液及生成二氧化錳后的吸收對(duì)比圖；(b)圖為合成后的透射電鏡圖片，證明合成了納米尺寸的二氧化錳納米片；(c)圖為二氧化錳納米片的拉曼光譜圖；(d)圖為二氧化錳納米片的x射線光電子能譜圖(xps)。以上結(jié)果證明二氧化錳納米片的成功合成。

實(shí)施例2：

熒光檢測(cè)谷胱甘肽：2.5μl的二氧化錳納米片(1mg/ml)與200μl不同濃度谷胱甘肽溶液(0，10，20，30，40μm)與室溫反應(yīng)5分鐘；之后，加入5μl6.8mm的鄰苯二胺(opda)溶液混勻，于50℃烘箱或者水浴鍋中反應(yīng)10分鐘后。冷卻至室溫，420nm波長(zhǎng)激發(fā)下測(cè)試568nm的熒光發(fā)射光譜。做選擇性實(shí)驗(yàn)時(shí)，將不同干擾物與2.5μl的二氧化錳納米片(1mg/ml)室溫反應(yīng)5分鐘；之后，加入5μl6.8mm的鄰苯二胺(opda)溶液混勻，于50℃烘箱或者水浴鍋中反應(yīng)10分鐘后。冷卻至室溫后，再測(cè)試熒光光譜圖。谷胱甘肽的熒光響應(yīng)如圖3所示。該方法對(duì)谷胱甘肽檢測(cè)的選擇性，如圖4所示，除了谷胱甘肽外，其它非目標(biāo)分子無(wú)明顯抑制二氧化錳氧化鄰苯二胺的能力，證明本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)谷胱甘肽具有良好的選擇性。

實(shí)施例3：

細(xì)胞裂解溶液中谷胱甘肽的檢測(cè)：hela細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清、青霉素(100u/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的rpmi1640培養(yǎng)基中于37℃高濕度含5％二氧化碳培養(yǎng)箱中。將生長(zhǎng)好的hela細(xì)胞離心后，用冷的pbs洗滌3次后，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞的濃度。將細(xì)胞懸浮液分散至冷的pbs中，使得每100μl溶液中含有500、5000、10000、20000、30000、40000個(gè)等不同數(shù)目的細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮液置于4℃冰浴條件下超聲5分鐘，10000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分后，取上清液用于測(cè)試。上清液稀釋至200μl與2.5μl的二氧化錳納米片(1mg/ml)混合反應(yīng)5分鐘后，加入5μl6.8mm的鄰苯二胺(opda)溶液混勻，于50℃烘箱或者水浴鍋中反應(yīng)10分鐘后。冷卻至室溫后，420納米波長(zhǎng)激發(fā)下測(cè)試568納米處的熒光發(fā)射光譜。另外，有一組細(xì)胞裂解液先與0.1mm乙基馬來(lái)酰亞胺(n-ethylmaleimide，nem)反應(yīng)以封閉硫醇物質(zhì)，用于證明熒光信號(hào)變化是來(lái)自于細(xì)胞中的谷胱甘肽。結(jié)果如圖5所示。證明該方法可以用于細(xì)胞裂解液中的谷胱甘肽檢測(cè)。

實(shí)施例4：

血清中谷胱甘肽的檢測(cè)：血清樣品先于10000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘后，取上清液稀釋50倍。在血清稀釋液中添加不同濃度谷胱甘肽后，將200μl含谷胱甘肽稀釋樣品與2.5μl二氧化錳納米片(1mg/ml)混合反應(yīng)5分鐘后，加入5μl6.8mm的鄰苯二胺溶液混勻，于50℃烘箱或者水浴鍋中反應(yīng)10分鐘后。冷卻至室溫后，420nm波長(zhǎng)激發(fā)下測(cè)試568nm處的熒光發(fā)射光譜。如圖6所示，隨著谷胱甘肽濃度增大，熒光信號(hào)逐漸降低，證明該方法可用于血清中谷胱甘肽的檢測(cè)。