本發(fā)明涉及農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是立達(dá)霉有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,hplc)是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱中，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。高效液相色譜法已在化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢、法檢等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)cn105223278a公開(kāi)了一種固相萃取液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定葡萄酒中甲霜靈、多菌靈的方法，包括先調(diào)節(jié)待測(cè)葡萄酒的ph值，用乙腈對(duì)酒樣進(jìn)行液液萃取，加入氯化鈉待溶液鹽析后用固相萃取柱萃取乙腈層，通過(guò)固相萃取柱洗脫，收集凈化后的洗脫液，繼而轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用氮?dú)獯蹈蓾饪s液，通過(guò)乙腈水溶液回溶后，注入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析，獲得葡萄酒中甲霜靈、多菌靈的含量的步驟。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)cn104535671a公開(kāi)了一種茄子中甲霜靈殘留的檢測(cè)方法，包括以下幾個(gè)步驟：(1)樣品處理：將采摘后的茄子置于破碎機(jī)中破碎，得到茄子漿；(2)提?。悍Q(chēng)取茄子漿20g于錐形瓶中，加入100ml的乙酸乙酯和丙酮混合液，在溫度為35-40℃的條件下振蕩提取60-70min，抽濾得清液，濃縮至近干，氮吹至干，用2ml乙腈復(fù)溶備用；(3)小柱分離：用5ml乙酸乙酯洗滌hlb小柱，再用5ml丙酮洗滌小柱，上樣，用10ml體積比為1:2的乙腈和水混合液淋洗小柱，最后用10ml的乙腈洗脫，收集洗脫液，旋蒸至1ml，氮?dú)獯蹈?，采用乙腈定容?ml，待檢測(cè)；(4)檢測(cè)：采用hplc進(jìn)行檢測(cè)。但是關(guān)于本發(fā)明的立達(dá)霉有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法目前還未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種立達(dá)霉有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種立達(dá)霉有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，所述的測(cè)定方法包括：

(1)專(zhuān)屬性試驗(yàn)，

(2)穩(wěn)定性試驗(yàn)，

(3)最大的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定。

一種立達(dá)霉專(zhuān)屬性試驗(yàn)方法，所述的試驗(yàn)方法包括：

(1)酸破壞試驗(yàn)：取樣品加鹽酸溶液，置熱水浴中加熱，取出后放冷，用氫氧化鈉中和，加流動(dòng)相稀釋?zhuān)缓筮M(jìn)行hplc分析；

(2)堿破壞試驗(yàn)：取樣品加氫氧化鈉，置熱水浴中加熱，取出后放冷，用鹽酸中和，加流動(dòng)相稀釋?zhuān)缓筮M(jìn)行hplc分析；

(3)氧化破壞試驗(yàn)：取樣品加過(guò)氧化氫，放置一段時(shí)間后取出，加流動(dòng)相稀釋?zhuān)缓筮M(jìn)行hplc分析；

(4)加熱破壞試驗(yàn)：取樣品加流動(dòng)相稀釋?zhuān)?00℃水浴中加熱，取出后放至室溫，然后進(jìn)行hplc分析；

(5)光破壞試驗(yàn)：取樣品置于紫外燈下照射，加流動(dòng)相稀釋?zhuān)缓筮M(jìn)行hplc分析。

所述的試驗(yàn)方法包括：

(1)酸破壞試驗(yàn)：取樣品20mg加1mol/l鹽酸溶液5ml，置熱水浴中加熱30min，取出后放冷，用1mol/l氫氧化鈉溶液中和，加流動(dòng)相稀釋制成每1ml中含2mg樣品的溶液，然后進(jìn)行hplc分析；

(2)堿破壞試驗(yàn)：取樣品20mg加1mol/l氫氧化鈉溶液5ml，置熱水浴中加熱30min，取出后放冷，用鹽酸中和，加流動(dòng)相稀釋制成每1ml中含2mg樣品的溶液，然后進(jìn)行hplc分析；

(3)氧化破壞試驗(yàn)：取樣品20mg加30％過(guò)氧化氫5ml，放置1小時(shí)后取出，加流動(dòng)相稀釋制成每1ml中含2mg樣品的溶液，然后進(jìn)行hplc分析；

(4)加熱破壞試驗(yàn)：取樣品加流動(dòng)相稀釋制成每1ml中含2mg樣品的溶液，置100℃水浴中加熱2小時(shí)，取出后放至室溫，然后進(jìn)行hplc分析；

(5)光破壞試驗(yàn)：取樣品置于紫外燈下照射24小時(shí)，稱(chēng)取20mg加流動(dòng)相稀釋制成每1ml中含2mg的溶液，然后進(jìn)行hplc分析。

hplc分析的條件為：c18柱，柱溫是30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)225nm，流速1.5ml/min，流動(dòng)相為甲醇：水＝5:95。

一種立達(dá)霉穩(wěn)定性試驗(yàn)方法，所述的穩(wěn)定性試驗(yàn)方法包括以下步驟：稱(chēng)取樣品并用流動(dòng)相溶解，在0-24h內(nèi)在hplc進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以主峰峰面積考察溶液的穩(wěn)定性。

一種立達(dá)霉最大的有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，所述的測(cè)定方法為運(yùn)用hplc測(cè)定2,6-二甲苯胺，色譜柱為c18柱，流動(dòng)相為乙腈：磷酸水＝40：60，檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm，檢測(cè)溫度為30℃，流速為1.25ml/min，進(jìn)樣量為10μl。

2,6-二甲苯胺的檢出限為0.02μg/ml。

2,6-二甲苯胺的定量限為0.1μg/ml。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本發(fā)明采用hplc對(duì)立達(dá)霉有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，具有高效、分離效能高，靈敏度高，分析速度快，準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。

2、本發(fā)明提供了立達(dá)霉的專(zhuān)屬性試驗(yàn)方法、穩(wěn)定性試驗(yàn)方法和最大的有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法。

附圖說(shuō)明

附圖1：未破壞的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液色譜圖。

附圖2：光破壞立達(dá)霉的色譜圖。

附圖3：酸破壞立達(dá)霉的色譜圖。

附圖4：堿破壞立達(dá)霉的色譜圖。

附圖5：氧化破壞立達(dá)霉的色譜圖。

附圖6：2,6-二甲苯胺的色譜圖。

附圖7。2,6-二甲苯胺和立達(dá)霉的色譜圖。

附圖8：0.1μg/ml的2,6-二甲苯胺的色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。

對(duì)照品：

立達(dá)霉(甲霜靈)對(duì)照品：購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，德國(guó)dr.ehrenstorfer，cas編號(hào)57837-19-1(watercontent0.1％,det.purity99.0％,tolerance/uncertainty+/-0.5％,determinedbykarl-fischertitration)。

供試品：

“復(fù)方立達(dá)霉粉”(美婷)，長(zhǎng)沙拜特生物科技研究所有限公司提供，樣品編號(hào)分別為20111101、20111201、20120101、20120508、20120708、20120722、20120811、20120813、20120830、20121101、20121201和20130101。

溶液制備

供試品溶液取本品適量，加流動(dòng)相稀釋至每1ml中約含立達(dá)霉0.1mg的溶液，作供試品溶液。

對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取立達(dá)霉對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋為每1ml中約含0.1mg立達(dá)霉的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1、專(zhuān)屬性試驗(yàn)

酸破壞試驗(yàn)：取立達(dá)霉20mg，加1mol/l鹽酸溶液5ml，置熱水浴中，加熱30min取出，放冷，用1mol/l氫氧化鈉溶液中和，加流動(dòng)相稀釋制成每1ml中含2mg的溶液，上hplc。

堿破壞試驗(yàn)：取立達(dá)霉20mg，加1mol/l氫氧化鈉5ml，置熱水浴中，加熱30min取出，放冷，用1mol/l鹽酸溶液中和，加流動(dòng)相稀釋制成每1ml中含2mg的溶液，上hplc。

氧化破壞試驗(yàn)：取立達(dá)霉20mg，加30％過(guò)氧化氫5ml，放置1h，取出，加流動(dòng)相稀釋制成每1ml中含2mg的溶液，上hplc。

加熱破壞試驗(yàn)：取立達(dá)霉適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每1ml中含有2mg的溶液，置100℃水浴中，加熱2h，取出，放至室溫。上hplc。

光破壞試驗(yàn)：取立達(dá)霉適量，置紫外燈下，照射24h，稱(chēng)取20mg，精密測(cè)定，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每1ml中含有2mg的溶液，上hplc。

根據(jù)制劑處方及工藝，制備空白輔料樣品，上hplc。

取系統(tǒng)適用性溶液，上hplc。

hplc條件：色譜柱是rp-ods柱(150mm×4.6mm，5μm)，柱溫是30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)包括225nm，流速1.5ml/min，流動(dòng)相為甲醇：水＝5:95(v:v)。

未破壞的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液色譜圖見(jiàn)附圖1，光破壞立達(dá)霉的色譜圖見(jiàn)附圖2，酸破壞立達(dá)霉色譜圖見(jiàn)附圖3，堿破壞立達(dá)霉色譜圖見(jiàn)附圖4，氧化破壞立達(dá)霉色譜圖見(jiàn)附圖5。

結(jié)果顯示，立達(dá)霉經(jīng)過(guò)酸/堿水浴、光和氧化破壞能產(chǎn)生明顯的降解產(chǎn)物，立達(dá)霉在加熱破壞時(shí)未出現(xiàn)降解產(chǎn)物。建立的hplc法能有效分離立達(dá)霉及其經(jīng)酸堿、光和氧化破壞后產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，立達(dá)霉峰與其它分解產(chǎn)物峰分離良好，說(shuō)明本法專(zhuān)屬性強(qiáng)。

2、穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取“復(fù)方立達(dá)霉粉”(批號(hào)20111101)適量，加流動(dòng)相溶解，在0～24h內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖，以主峰峰面積和雜質(zhì)含量為指標(biāo)考察溶液穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表1。立達(dá)霉主峰面積的rsd＝0.25％。結(jié)果表明立達(dá)霉供試品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3、樣品測(cè)定

將不同批次的“復(fù)方立達(dá)霉粉”按照以上方法(穩(wěn)定性試驗(yàn)的操作方法)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。在有關(guān)物質(zhì)方面，“復(fù)方立達(dá)霉粉”樣品中單個(gè)最大雜質(zhì)最高為3.48％，最低為1.97％，平均為2.75％?！皬?fù)方立達(dá)霉粉”樣品中總雜質(zhì)最高為5.32％，最低為3.24％，平均為4.48％。

表2樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果，將單個(gè)雜質(zhì)限度定為4.0％，雜質(zhì)總量限度定為6.0％。

4、最大的有關(guān)物質(zhì)

最大的有關(guān)物質(zhì)為2,6-二甲苯胺。2,6-二甲苯胺是立達(dá)霉合成途徑過(guò)程的中間產(chǎn)物(詳見(jiàn)《立達(dá)霉(甲霜靈)生產(chǎn)工藝》)，有可能在生產(chǎn)立達(dá)霉原料過(guò)程中摻入到立達(dá)霉原料中。

2,6-二甲苯胺的分析方法采取高效液相色譜法，色譜條件為：c18rp-ods柱(150mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相【乙腈：磷酸水＝40：60(v/v)】；檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm；檢測(cè)溫度30℃，流速為1.25ml/min。進(jìn)樣量10μl。該檢測(cè)方法可以有效地將檢測(cè)2,6-二甲苯胺，2,6-二甲苯胺保留時(shí)間約為1.68min(附圖6)。將2,6-二甲苯胺和立達(dá)霉的混合液上hplc，2,6-二甲苯胺保留時(shí)間約為1.68min，立達(dá)霉的保留時(shí)間為4.97min(附圖7)，證明該方法特異性良好。

以信噪比s/n≥3計(jì)算，確定2,6-二甲苯胺的檢出限為0.02μg/ml，相當(dāng)于總含量的0.01％。以信噪比s/n≥10計(jì)算，確定2,6-二甲苯胺的定量限為0.1μg/ml(附圖8)，相當(dāng)于總含量的0.05％。以上比例均遠(yuǎn)低于雜質(zhì)的限度值。

將系列濃度梯度的2,6-二甲苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液上hplc。以2,6-二甲苯胺濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2,6-二甲苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.1μg/ml-1000μg/ml的線(xiàn)性范圍內(nèi)與峰面積的線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性回歸方程為y＝5.5254x+6.1058，相關(guān)系數(shù)(r²)為0.9999。

將一定量2,6-二甲苯胺添加到空白溶液中，用以上方法，測(cè)定2,6-二甲苯胺的準(zhǔn)確度和精密度。2,6-二甲苯胺的平均回收率為94.60％～99.02％，精密度為0.55％～4.45％，詳細(xì)見(jiàn)表3。

表32,6-二甲苯檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度(n＝5)

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。