本發(fā)明屬于藥物分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，本發(fā)明涉及一種利用hplc(高效液相色譜法)測(cè)定曲格列汀原料藥及其制劑中對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：琥珀酸曲格列汀(trelagliptinsμccinate，式1所示化合物)化學(xué)名為2-((6-((3r)-3-氨基-1-哌啶基)-3,4-二氫-3-甲基-2,4-二氧代-1(2h)-嘧啶基)甲基)-4-氟-苯甲腈琥珀酸鹽，是由日本武田(takeda)公司原研的首個(gè)可以實(shí)現(xiàn)每周一次給藥的小分子糖尿病藥物，它是一種新型的治療2型糖尿病的口服型二肽基肽酶iv(dpp-4)抑制劑，通過選擇性、持續(xù)性抑制dpp-4，控制血糖水平。dpp-4是一種細(xì)胞表面的絲氨酸蛋白酶，能夠引發(fā)腸促胰島素(胰高血糖素樣肽-1(glp-1)和葡萄糖依賴性促胰島素多肽(gip))的失活，而這兩種腸降胰島素在血糖調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。通過抑制dpp-4，能夠增加血糖水平依賴性胰島素分泌，從而控制血糖水平。dpp-4抑制劑具有葡萄糖依賴性的刺激胰島素分泌作用，其在有效控制血糖過程中不易引起低血糖事件，同時(shí)還保留胰島β細(xì)胞功能等特點(diǎn)。與每日口服一次的傳統(tǒng)降血糖藥相比，琥珀酸曲格列汀只需每周口服一次，通過減少用藥次數(shù)能夠改善2型糖尿病患者對(duì)琥珀酸曲格列汀的用藥依從性，從而使患者在長(zhǎng)期治療期間能夠維持良好的血糖控制，預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生和加重。琥珀酸曲格列汀片于2015年3月獲得日本厚生勞動(dòng)省(mhlw)的批準(zhǔn)，用于2型糖尿病的治療。原研的琥珀酸曲格列汀片(zafatek)為薄膜包衣片，分別有50mg/片和100mg/片兩種規(guī)格，用法用量為每周服藥一次，每次100mg)。琥珀酸曲格列汀的對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)(s型)結(jié)構(gòu)式為：琥珀酸曲格列汀作為近年上市的新藥，其異構(gòu)體雜質(zhì)的檢測(cè)方法尚未見專利和文獻(xiàn)報(bào)道。現(xiàn)有專利cn104237421a提出了一種琥珀酸曲格列汀及其制劑的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法，其中所述有關(guān)物質(zhì)是指琥珀酸曲格列汀合成過程中帶有的雜質(zhì)成分如溶劑、中間體、副產(chǎn)物等，并不能實(shí)現(xiàn)琥珀酸曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的分離，因此，創(chuàng)建一種分離分析琥珀酸曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的方法對(duì)于琥珀酸曲格列汀的原料藥和制劑的質(zhì)量控制具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種快速分離分析曲格列汀原料藥及其制劑中對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的方法，從而實(shí)現(xiàn)主藥曲格列汀及其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的有效分離與測(cè)定，保證曲格列汀原料藥及其制劑的質(zhì)量控制。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種利用hplc測(cè)定曲格列汀原料藥及其制劑中對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的方法。所述方法的分析條件包括：采用硅膠表面涂敷有直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)為固定相的手性色譜柱；采用含有正己烷和堿性添加劑的混合溶液為流動(dòng)相a，采用含有乙醇和堿性添加劑的混合溶液作為流動(dòng)相b進(jìn)行等度洗脫。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的利用hplc測(cè)定曲格列汀原料藥及其制劑中對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的方法可以將曲格列汀或其鹽與曲格列汀的對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行有效分離，從而可以有效控制曲格列汀原料藥及其制劑的質(zhì)量，并且該檢測(cè)方法專屬性強(qiáng)、精密度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、耐受性好，操作方便，可有效控制藥品質(zhì)量。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的利用hplc測(cè)定曲格列汀原料藥及其制劑中對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的方法，還可以具有以下附加技術(shù)特征：在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述色譜柱的柱溫20℃～30℃，優(yōu)選25℃。由此，可以顯著提高曲格列汀或其鹽與曲格列汀的對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的分離效率。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，流動(dòng)相流速為0.5～1.0ml/min，優(yōu)選0.8ml/min。由此，可以進(jìn)一步提高曲格列汀或其鹽與曲格列汀的對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的分離效率。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm～280nm，優(yōu)選278nm。由此，可以進(jìn)一 步提高曲格列汀或其鹽與曲格列汀的對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的分離效率。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，樣品溶液的進(jìn)樣體積為5～20μl。由此，可以進(jìn)一步提高曲格列汀或其鹽與曲格列汀的對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的分離效率。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述樣品溶液是將所述曲格列汀原料藥及其制劑的樣品用乙醇溶解配制而成的。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述曲格列汀為2-((6-((3r)-3-氨基-1-哌啶基)-3,4-二氫-3-甲基-2,4-二氧代-1(2h)-嘧啶基)甲基)-4-氟-苯甲腈及其藥學(xué)上可接受的鹽，如琥珀酸鹽，鹽酸鹽，優(yōu)選為琥珀酸鹽。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)為2-((6-((3s)-3-氨基-1-哌啶基)-3,4-二氫-3-甲基-2,4-二氧代-1(2h)-嘧啶基)甲基)-4-氟-苯甲腈及其藥學(xué)上可接受的鹽，如琥珀酸鹽，鹽酸鹽，優(yōu)選為琥珀酸鹽。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述手性色譜柱選自chiralpakad或chiralpakad-h，優(yōu)選為chiralpakad-h。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的體積比為(60：40)～(45：55)，優(yōu)選為55：45。由此，可以進(jìn)一步提高r和s兩種構(gòu)型化合物的分離度。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述堿性添加劑為二乙胺或丁胺，優(yōu)選為二乙胺。由此，可以有效改善色譜峰的峰形。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述流動(dòng)相a中堿性添加劑的含量為0.1體積％～0.4體積％，優(yōu)選為0.3體積％。由此，可以進(jìn)一步提高r和s兩種構(gòu)型化合物的分離度。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述流動(dòng)相b中堿性添加劑的含量為0.1體積％～0.4體積％，優(yōu)選為0.3體積％。由此，可以進(jìn)一步提高r和s兩種構(gòu)型化合物的分離度。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述曲格列汀制劑包括藥學(xué)上可接受的給藥劑型，優(yōu)選為片劑、膠囊劑、顆粒劑等。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，利用hplc測(cè)定曲格列汀原料藥及其制劑中對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的方法，可以依照以下步驟實(shí)現(xiàn)：(1)取待檢測(cè)樣品適量，用乙醇溶解，配制成每1ml約含0.5mg的樣品溶液。(2)采用硅膠表面涂敷有直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)為固定相的手性色譜柱，以含有正己烷和二乙胺的混合溶液為流動(dòng)相a(其中，流動(dòng)相a中含有0.3體積％的二乙胺)，含有乙醇和二乙胺的混合溶液為流動(dòng)相b(其中，流動(dòng)相b含有0.3體積％的二乙胺)，并且流動(dòng)相a與流動(dòng)相b的比例為體積比55％：45％進(jìn)行等度洗脫，其中，設(shè)置色譜柱柱溫為20℃～30℃，優(yōu)選為25℃。流動(dòng)相的流速為0.5～1.0ml/min，優(yōu)選為0.8ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm～280nm，優(yōu)選為278nm。(3)取(1)的樣品溶液進(jìn)樣量5～20μl，優(yōu)選為10μl，注入高效液相色譜儀，完成曲格列汀原料藥及制劑中對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的測(cè)定。附圖說明圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1，方法學(xué)驗(yàn)證中專屬性項(xiàng)下空白溶液的hplc圖；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1，方法學(xué)驗(yàn)證中專屬性項(xiàng)下分離度溶液的hplc圖；圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1，方法學(xué)驗(yàn)證中定量限和檢測(cè)限項(xiàng)下定量限(loq)溶液的hplc圖；圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1，方法學(xué)驗(yàn)證中定量限和檢測(cè)限項(xiàng)下檢測(cè)限(lod)溶液的hplc圖；圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1，方法學(xué)驗(yàn)證中線性項(xiàng)下琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的線性回歸圖；圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2，分離度測(cè)試液檢測(cè)的hplc圖；圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2，琥珀酸曲格列汀樣品溶液檢測(cè)的hplc圖；圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2，琥珀酸曲格列汀片樣品溶液檢測(cè)的hplc圖；圖9顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3，分離度測(cè)試液檢測(cè)的hplc圖；圖10顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例4，分離度測(cè)試液檢測(cè)的hplc圖；圖11顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例5，分離度測(cè)試液檢測(cè)的hplc圖；圖12顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例7，分離度測(cè)試液檢測(cè)的hplc圖。具體實(shí)施方式提供以下實(shí)施例以進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明及其實(shí)施方式。在實(shí)施例中給出的具體詳細(xì)內(nèi)容僅是出于舉例說明的目的，而不是應(yīng)將其解釋為限制本發(fā)明。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。琥珀酸曲格列汀對(duì)照品(自制，批號(hào)：tre-rs20140901)；琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品(自制，批號(hào)：ws1002-048-05)；琥珀酸曲格列汀原料藥(自制，批號(hào)：tre-20140801)；琥珀酸曲格列汀片劑(自制，規(guī)格：50mg，批號(hào)：14092501)。實(shí)施例1：儀器：agilent1100高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器色譜柱：chiralpakad-h(4.6*250mm，5μm)流動(dòng)相a：含有正己烷和二乙胺的混合溶液(含0.3體積％的二乙胺)流動(dòng)相b：含有乙醇和二乙胺的混合溶液(含0.3體積％的二乙胺)等度洗脫：流動(dòng)相a(％)：流動(dòng)相b(％)＝55:45流動(dòng)相流速：0.8ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm柱溫：25℃樣品溶液進(jìn)樣體積：10μl溶劑：乙醇對(duì)映異構(gòu)體的方法學(xué)驗(yàn)證：1、系統(tǒng)適用性琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照溶液：精密稱取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品適量，加乙醇溶解并定量稀釋制成每1ml含2.5μg的溶液。取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照溶液，按上述條件連續(xù)進(jìn)樣6針，按上述色譜條件進(jìn)入色譜系統(tǒng)，結(jié)果如下：結(jié)論：0.5％對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照溶液連續(xù)進(jìn)樣6針峰面積的rsd為0.9％(2015版中國(guó)藥典要求不大于10％)，符合要求。2、專屬性空白溶液：乙醇分離度溶液：分別精密稱取琥珀酸曲格列汀對(duì)照品和琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品適量，用乙醇溶解并稀釋制成每1ml含琥珀酸曲格列汀0.5mg和琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體2.5μg的混合溶液，作為分離度溶液。取空白溶液、分離度溶液分別按上述色譜條件進(jìn)入色譜系統(tǒng)，結(jié)果見附圖1和附圖2，結(jié)果如下：組分名稱保留時(shí)間(分鐘)相對(duì)保留時(shí)間分離度曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體(s型)16.10.86---曲格列汀(r型)18.81.003.8結(jié)論：空白溶液對(duì)各峰檢測(cè)無干擾，曲格列汀和對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)間的分離度為3.8(2015 版中國(guó)藥典要求不小于1.5)，方法專屬性符合要求。3、定量限和檢測(cè)限空白溶液：乙醇定量限溶液：精密量取系統(tǒng)適用性項(xiàng)下的琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照溶液適量，用乙醇進(jìn)行逐步稀釋，選取主峰的信噪比約為10的溶液為定量限溶液。檢測(cè)限溶液：精密量取定量限溶液3ml于10ml量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。取定量限溶液和檢測(cè)限溶液，分別按上述色譜條件進(jìn)入色譜系統(tǒng)，結(jié)果見附圖3和附圖4，結(jié)果如下：溶液名稱濃度(μg/ml)限度(％)信噪比定量限溶液0.10000.0211檢測(cè)限溶液0.03000.0063結(jié)論：該分析方法定量限為0.1000μg/ml(0.02％)，檢測(cè)限為0.0300μg/ml(0.006％)，該分析方法的檢測(cè)靈敏度高。4、線性精密稱取琥珀酸曲格列汀對(duì)照品適量，加乙醇超聲使溶解并制成一定濃度的線性儲(chǔ)備液，用乙醇將線性儲(chǔ)備液稀釋制成不同濃度水平的線性溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)入色譜系統(tǒng)，以峰面積a對(duì)琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體濃度c(μg/ml)進(jìn)行線性回歸，所得線性回歸圖見附圖5，結(jié)果如下：結(jié)論：線性回歸方程為：a＝18.43766c+0.10296，相關(guān)系數(shù)r＝0.99998，表明對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)在0.1000～5.002μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。5、準(zhǔn)確度琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體加樣回收貯備液：精密稱取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品適量，加乙醇溶解并定量稀釋制成每1ml含25μg的溶液。100％加樣回收溶液：取琥珀酸曲格列汀樣品約25mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體加樣回收貯備液5ml置于同一量瓶中，再加乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。平行配制6份。依次取各100％加樣回收溶液進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)入色譜系統(tǒng)，按照下列公式計(jì)算回收率：式中m測(cè)得量為加樣回收樣品溶液中測(cè)得對(duì)映異構(gòu)體的質(zhì)量(由線性方程計(jì)算所得)，mg；m樣品中含有量為樣品溶液中測(cè)得對(duì)映異構(gòu)體的質(zhì)量(由線性方程計(jì)算所得)，mg；m加入量為樣品中加入的加樣回收貯備液所含的對(duì)映異構(gòu)體的質(zhì)量，mg。6份加樣回收溶液中對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)回收率結(jié)果如下：結(jié)論：6份琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)100％加樣回收溶液回收率為97.2％～98.5％(2015版中國(guó)藥典要求回收率在92％～105％之間)，回收率符合要求，準(zhǔn)確度良好。6、耐用性(柱溫、流速、流動(dòng)相比例變化對(duì)曲格列汀r型和s型分離度的影響)空白溶液：乙醇琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照溶液：同系統(tǒng)適用項(xiàng)下琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照溶液。樣品溶液：取琥珀酸曲格列汀樣品約25mg，精密稱定，置50ml量瓶中，用乙醇超聲溶解并用乙醇稀釋至刻度，搖勻。分離度溶液：同專屬性項(xiàng)下分離度溶液。取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照溶液、分離度溶液和樣品溶液分別進(jìn)入色譜系統(tǒng)，結(jié)果如下：結(jié)論：在原始條件的基礎(chǔ)上，改變色譜條件如流速變化±0.1ml/min，柱溫變化±2℃和流動(dòng)相比例變化±2％，曲格列汀和曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體峰之間的分離度均大于3.0(2015版中國(guó)藥典要求不小于1.5)，耐用性符合要求。實(shí)施例2儀器：agilent1100高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器色譜柱：chiralpakad-h(4.6*250mm，5μm)流動(dòng)相a：含有正己烷和二乙胺的混合溶液(含0.3體積％的二乙胺)流動(dòng)相b：含有乙醇和二乙胺的混合溶液(含0.3體積％的二乙胺)等度洗脫：流動(dòng)相a(％)：流動(dòng)相b(％)＝55:45流速：0.8ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm柱溫：25℃進(jìn)樣體積：10μl試驗(yàn)步驟：琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體貯備液：精密稱取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品約10mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。分離度測(cè)試液：精密稱取琥珀酸曲格列汀原料藥約10mg，置100ml量瓶中，加適量乙醇超聲溶解后，取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體貯備液5ml于同一量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。琥珀酸曲格列汀樣品溶液：精密稱取琥珀酸曲格列汀原料藥25.06mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量，超聲使溶解，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。琥珀酸曲格列汀片樣品溶液：取琥珀酸曲格列汀片1片(規(guī)格：50mg)，置100ml量瓶中，加乙醇適量超聲使溶解，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液。分別取分離度測(cè)試液、琥珀酸曲格列汀樣品溶液、琥珀酸曲格列汀片樣品溶液在上述色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結(jié)果見附圖6、附圖7、附圖8。圖6中保留時(shí)間為18.791min的峰為曲格列汀，保留時(shí)間為16.093min的峰為曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)。曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)之間的分離度為3.78(2015版中國(guó)藥典要求不小于1.5)，色譜圖表明曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)可以在同一色譜條件下達(dá)到良好的分離。圖7中保留時(shí)間為18.884min的峰為曲格列汀，對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)未檢出(低于檢測(cè)限，即面積歸一化含量小于<0.006％)。曲格列汀峰的理論塔板數(shù)為9662(2015版中國(guó)藥典要求不小于3000)，拖尾因子為1.15(2015版中國(guó)藥典要求不大于2.0)，色譜圖表明曲格列汀峰形好，該檢測(cè)方法能檢測(cè)出琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的含量，有效控制藥品的質(zhì)量。圖8中保留時(shí)間為18.890min的峰為曲格列汀，對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)未檢出(低于檢測(cè)限，即面積歸一化含量小于<0.006％)。曲格列汀峰的理論塔板數(shù)為9641(2015版中國(guó)藥典要求不小于3000)，拖尾因子為1.15(2015版中國(guó)藥典要求不大于2.0)，色譜圖表明曲格列汀峰形好，該檢測(cè)方法能檢測(cè)出琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的含量，有效控制藥品的質(zhì)量。實(shí)施例3儀器：agilent1100高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器色譜柱：chiralpakad-h(4.6*250mm，5μm)流動(dòng)相a：含有正己烷和二乙胺的混合溶液(含0.2體積％的二乙胺)流動(dòng)相b：含有乙醇和二乙胺的混合溶液(含0.2體積％的二乙胺)等度洗脫：流動(dòng)相a(％)：流動(dòng)相b(％)＝60:40流速：1.0ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm柱溫：25℃進(jìn)樣體積：10μl試驗(yàn)步驟：琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體貯備液：精密稱取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品約10mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。分離度測(cè)試液：精密稱取琥珀酸曲格列汀原料藥約10mg，置100ml量瓶中，加適量乙醇超聲溶解后，取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體貯備液5ml于同一量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。取分離度測(cè)試液在上述色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結(jié)果見附圖9。圖9中保留時(shí)間為17.336min的峰為曲格列汀，保留時(shí)間為15.093min的峰為曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)。曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)之間的分離度為3.21(2015版中國(guó)藥典要求不小于1.5)，色譜圖表明曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)可以在同一色譜條件下達(dá)到良好的分離。實(shí)施例4儀器：agilent1100高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器色譜柱：chiralpakad-h(4.6*250mm，5μm)流動(dòng)相a：含有正己烷和丁胺的混合溶液(含0.4體積％的丁胺)流動(dòng)相b：含有乙醇和丁胺的混合溶液(含0.4體積％的丁胺)等度洗脫：流動(dòng)相a(％)：流動(dòng)相b(％)＝50:50流速：0.5ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm柱溫：25℃進(jìn)樣體積：10μl試驗(yàn)步驟：琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體貯備液：精密稱取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品約10mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。分離度測(cè)試液：精密稱取琥珀酸曲格列汀原料藥約10mg，置100ml量瓶中，加適量乙 醇超聲溶解后，取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體貯備液5ml于同一量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。取分離度測(cè)試液在上述色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結(jié)果見附圖10。圖10中保留時(shí)間為25.803min的峰為曲格列汀，保留時(shí)間為22.652min的峰為曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)。曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)之間的分離度為3.73(2015版中國(guó)藥典要求不小于1.5)，色譜圖表明曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)可以在同一色譜條件下達(dá)到良好的分離。實(shí)施例5儀器：agilent1100高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器色譜柱：chiralpakad-h(4.6*250mm，5μm)流動(dòng)相a：含有正己烷和二乙胺的混合溶液(含0.1體積％的二乙胺)流動(dòng)相b：含有乙醇和二乙胺的混合溶液(含0.1體積％的二乙胺)等度洗脫：流動(dòng)相a(％)：流動(dòng)相b(％)＝45:55流速：0.6ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm柱溫：25℃進(jìn)樣體積：10μl試驗(yàn)步驟：琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體貯備液：精密稱取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品約10mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。分離度測(cè)試液：精密稱取琥珀酸曲格列汀原料藥約10mg，置100ml量瓶中，加適量乙醇超聲溶解后，取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體貯備液5ml于同一量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。取分離度測(cè)試液在上述色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結(jié)果見附圖11。圖11中保留時(shí)間為19.567min的峰為曲格列汀，保留時(shí)間為17.206min的峰為曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)。曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)之間的分離度為3.44(2015版中國(guó)藥典要求不小于1.5)，色譜圖表明曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)可以在同一色譜條件下達(dá)到良好的分離。實(shí)施例6儀器：agilent1100高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器色譜柱：chiralpakad-h(4.6*250mm，5μm)流動(dòng)相a：正己烷流動(dòng)相b：乙醇流速：0.8ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm柱溫：25℃進(jìn)樣體積：10μl試驗(yàn)步驟：琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體貯備液：精密稱取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品約10mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。分離度測(cè)試液：精密稱取琥珀酸曲格列汀原料藥約10mg，置100ml量瓶中，加適量乙醇超聲溶解后，取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體貯備液5ml于同一量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。取分離度測(cè)試液在上述色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖。曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)之間未分離，兩者的峰形均嚴(yán)重拖尾。結(jié)果說明流動(dòng)相中添加二乙胺或丁胺的作用不僅僅可以改善色譜峰的峰形，而且能提高曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)之間的分離度。實(shí)施例7儀器：agilent1100高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器色譜柱：chiralpakas-h(4.6*150mm，5μm)流動(dòng)相a：含有正己烷和二乙胺的混合溶液(含0.3體積％的二乙胺)流動(dòng)相b：含有乙醇和二乙胺的混合溶液(含0.3體積％的二乙胺)等度洗脫：流動(dòng)相a(％)：流動(dòng)相b(％)＝55:45流速：0.8ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm柱溫：25℃進(jìn)樣體積：10μl試驗(yàn)步驟：琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體貯備液：精密稱取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品約10 mg，置50ml量瓶中，加乙醇適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。分離度測(cè)試液：精密稱取琥珀酸曲格列汀原料藥約10mg，置100ml量瓶中，加適量乙醇超聲溶解后，取琥珀酸曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體貯備液5ml于同一量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻。取分離度測(cè)試液在上述色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結(jié)果見附圖12。圖12中保留時(shí)間為5.319min的峰為曲格列汀，保留時(shí)間為6.349min的峰為曲格列汀對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)。曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)之間的分離度為1.98，色譜圖表明采用手性色譜柱chiralpakas-h(4.6*150mm，5μm)分離曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的效果不如chiralpakad-h(4.6*250mm，5μm)。分離度較小的情況下將影響曲格列汀與對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的峰面積的積分，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。在本發(fā)明的描述中，需要理解的是，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上，除非另有明確具體的限定。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。當(dāng)前第1頁12