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一種貼壁細(xì)胞中游離氨基酸和脂肪酸的提取及分析方法

文檔序號(hào):10487190閱讀:1540來源:國知局
一種貼壁細(xì)胞中游離氨基酸和脂肪酸的提取及分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種貼壁細(xì)胞中游離氨基酸和脂肪酸組分的提取和分析方法,主要包括以下步驟,貼壁細(xì)胞于培養(yǎng)盤貼壁培養(yǎng)后,樣品經(jīng)快速水洗后液氮淬滅,加入少量水超聲破碎,凍干后加入MTBE提取,然后加水離心取上清,氮?dú)獯蹈珊笥靡译娑ㄈ萑缓髮χ舅峤M分進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)分析。提取剩余部分繼續(xù)加入MTBE和甲醇提取,離心后取下層對氨基酸組分直接進(jìn)行LC-MS分析。本發(fā)明采用LC-MS對游離氨基酸和脂肪酸組分進(jìn)行分析,利用較少的樣本量實(shí)現(xiàn)了氨基酸和脂肪酸組分的同時(shí)提取。與常規(guī)脂肪酸GC-MS分析方法比較,該方法不需衍生,極大簡化樣品前處理過程,同時(shí)為貼壁細(xì)胞內(nèi)代謝物的提取提供了一種參考方法,該分析方法能夠應(yīng)用于其他介質(zhì)中游離氨基酸和脂肪酸的分析。
【專利說明】
一種貼壁細(xì)胞中游離氨基酸和脂肪酸的提取及分析方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物分析化學(xué)領(lǐng)域,涉及一種貼壁細(xì)胞內(nèi)代謝物的提取方法和基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的氨基酸和脂肪酸分析方法
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞內(nèi)氨基酸和脂肪酸組分能夠參與細(xì)胞能量代謝通路,是維持細(xì)胞碳代謝和氮代謝的基本單元。細(xì)胞受到外界環(huán)境刺激,污染物以及藥物暴露后其體內(nèi)氨基酸和脂肪酸組分都會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化,在生物學(xué)領(lǐng)域,部分氨基酸已經(jīng)成為腫瘤發(fā)生的標(biāo)志物,而游離脂肪酸參與的代謝失調(diào)也會(huì)引起機(jī)體發(fā)生的病變。因此對細(xì)胞內(nèi)氨基酸以及脂肪酸組分的分析具有重要意義
[0003]氨基酸的分析常用專門的氨基酸分析儀,原理是采用柱后衍生、用茚三酮作為衍生試劑的離子交換色譜法,分析時(shí)間較長,需要在一個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。隨著HPLC技術(shù)的發(fā)展,用反相柱(Cs、C18)柱前衍生,熒光或紫外檢測法測定氨基酸取得了很大發(fā)展。但是這兩種氨基酸分析方法都需要衍生,且氨基酸分析儀用時(shí)較長,液相色譜檢測法檢出限較高,用于少量生物樣品測定嚴(yán)重受限于檢測的特異性和靈敏度,無法在分子水平上實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。游離脂肪酸的分析常采用甲酯化衍生后利用氣相色譜法(GC),或者采用熒光衍生后用液相色譜檢測(LC)。脂肪酸的提取溶劑常用非極性溶劑如:石油醚,正己烷,氯仿/甲醇混合溶液等,另外,在萃取時(shí)加入一些水,可以提高萃取效率。但是衍生化過程中會(huì)出現(xiàn)很多問題。如衍生不完全,衍生后脂肪酸的組成發(fā)生了變化,另外多不飽和脂肪酸在分析過程中有可能會(huì)因氧化降解。針對游離氨基酸和脂肪酸提取及分析過程中存在的問題,本發(fā)明發(fā)展了一種從貼壁細(xì)胞中提取多種氨基酸和脂肪酸的方法,并建立了基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的分析方法,采用少量細(xì)胞樣品即可實(shí)現(xiàn)氨基酸于脂肪酸類物質(zhì)的同時(shí)提取和分析。是目前理想的分析的手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種貼壁細(xì)胞中游離氨基酸和脂肪酸組分的提取和分析方法,這種方法利用較少的細(xì)胞樣本量實(shí)現(xiàn)了氨基酸和脂肪酸組分的同時(shí)提取。與常規(guī)的GC和LC分析方法比較,該方法不需要衍生,極大簡化樣品前處理過程,同時(shí)為貼壁細(xì)胞內(nèi)代謝物的提取提供了一種參考方法,而且該分析方法還能夠應(yīng)用于其他介質(zhì)中游離氨基酸和脂肪酸的分析。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]基于構(gòu)建的貼壁細(xì)胞中游離氨基酸和脂肪酸組分的提取方法,以HepG2為模式細(xì)胞,對其胞內(nèi)氨基酸和脂肪酸組分進(jìn)行提取,并利用基于LC-MS的質(zhì)譜方法對細(xì)胞內(nèi)22種氨基酸組分和20種脂肪酸組分進(jìn)行定量測定。
[0007]細(xì)胞內(nèi)氨基酸和脂肪酸組分的提取與檢測過程具體步驟如下:
[0008](a)細(xì)胞于孔板中培養(yǎng)24?48h,待細(xì)胞鋪滿孔板被培養(yǎng)液覆蓋面積的60?80%,移棄培養(yǎng)液,每孔加入I?2mL水快速清洗并吸棄,然后加入液氮淬滅;
[0009](b)液氮揮發(fā)完后超聲破碎,冷凍干燥,每孔的凍干樣品中加入10?20 μ L內(nèi)標(biāo)混合液,渦旋混勻;
[0010](C)加入甲基叔丁基醚(MTBE)渦旋提取,加入水渦旋混勻,離心,取上清氮?dú)獯蹈桑缓笠译娑ㄈ?,LC-MS分析游離脂肪酸;
[0011](d)取上清后的提取剩余部分加入MTBE和甲醇,渦旋提取,離心后取下層對游離氨基酸組分進(jìn)行LC-MS分析。
[0012]上述步驟a中所述孔板為六孔板,六孔板每孔內(nèi)培養(yǎng)液體積為2?3mL,細(xì)胞的接種密度為I?3 X 15個(gè)/mL,在培養(yǎng)箱內(nèi)的培養(yǎng)條件為37 °C,空氣中含體積分?jǐn)?shù)為5 %的
0)2;培養(yǎng)液為GIBCO的DMEM (高糖)液體培養(yǎng)基,含4500mg/l葡萄糖,含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)為I %的青霉素-鏈霉素;液氮用量為填滿六孔板的每一個(gè)孔。
[0013]上述步驟b每孔加入0.5?ImL水超聲破碎,超聲破碎時(shí)間為3?5min,移出置于離心管中(每孔分別置于一個(gè)離心管中)于-10?-40°C冷凍干燥,加入的內(nèi)標(biāo)混合液中,正亮氨酸濃度為200?400nmol/L,^ 酸濃度為10?20mg/L,十九酸濃度為10?20mg/L,溶劑為乙腈。
[0014]上述步驟c中每孔樣品MTBE用量為400?800 μ L,渦旋提取時(shí)間為15?20min,加入水的體積為每孔樣品200?400 μ L,渦旋混勻時(shí)間為2?5min,提取過程中離心操作為4?8°C下離心20?30min,轉(zhuǎn)速為12000?15000rpm,取上清氮?dú)獯蹈珊竺靠讟悠酚靡译娑ㄈ莸?00?400 μ L用于游離脂肪酸的分析。
[0015]上述步驟d中加入MTBE量為每孔樣品100?200 μ L,甲醇量為每孔樣品200?400 μ L,渦旋提取時(shí)間為15?20min,離心條件為4?8°C下,20?30min,轉(zhuǎn)速為12000?15000rpmo
[0016]游離脂肪酸組分的分析采用的色譜柱為Ufavour (:8柱(I50mmX 2.1mm,3.0 μ m);流動(dòng)相A為H2O,流動(dòng)相B為含I?5mM乙酸銨的乙腈,流動(dòng)相C為乙腈;流動(dòng)相梯度為(時(shí)間,流動(dòng)相體積百分?jǐn)?shù),流動(dòng)相總流速):0-5min,流動(dòng)相A10%,流動(dòng)相B20%,流動(dòng)相C70 % , 250 μ L/min ;第6min,在I分鐘內(nèi)流動(dòng)相A由10 %線性減少為O %,流動(dòng)相C由70 %線性增加為 80%,250 μ L/min ;7-15min,流動(dòng)相 B 20% ,流動(dòng)相 C 80%,250 μ L/min ;第16min,在I分鐘內(nèi)流動(dòng)相A由0%線性增加為10%,流動(dòng)相C由80%線性減少為70%,流量由250 μ L/min線性增加到300 μ L/min ;17-20min,流動(dòng)相A10%,流動(dòng)相B 20%,流動(dòng)相C 70% , 300 μ L/min ;進(jìn)樣量為5?10 μ L ;質(zhì)譜掃描模式為ESI (-)MRM。
[0017]游離氨基酸組分的分析采用Atlantis C18高效液相色譜柱(waters, 150mmX 2.lmm, 3.0 μ m);流動(dòng)相A為含0.1?0.5% (體積百分比)甲酸的H2O,流動(dòng)相B為甲醇;流動(dòng)相梯度為(按體積百分比計(jì)):0-2min,流動(dòng)相A 95%,流動(dòng)相B5%;然后在3min之內(nèi)流動(dòng)相A線性減少為40%,流動(dòng)相B線性增加為60%,維持4min ;在I分鐘內(nèi)流動(dòng)相A線性增加到95%,流動(dòng)相B線性減少為5%,維持8min ;上述過程中流動(dòng)相A與流動(dòng)相B總流速始終為200 μ L/min,進(jìn)樣量為2?5 μ L ;質(zhì)譜掃描模式為ESI⑴MRM。
[0018]本發(fā)明中的技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0019](I)本發(fā)明所需樣本量小,氨基酸和脂肪酸的提取來自同一細(xì)胞樣本,兩者之間的相對重復(fù)性和平行性好于分別提取,便于對相關(guān)代謝途徑進(jìn)行研究時(shí)的數(shù)據(jù)整合。
[0020](2)根據(jù)短鏈,中鏈及長鏈脂肪酸組分在極性與非極性溶劑兩相分配的不同分別采用十一酸和十九酸作為短中鏈和長鏈脂肪酸的內(nèi)標(biāo),能夠有效地提高提取效率。
[0021](3)本發(fā)明使用溶劑毒性較小,與其他溶劑相比,MTBE提取時(shí)蛋白和不溶物沉積在離心管底部,提取過程中不會(huì)引入蛋白干擾,重復(fù)性好。后續(xù)LC-MS檢測可以快速實(shí)現(xiàn)對多種氨基酸和脂肪酸組分的特異性檢測,具有簡單快速、靈敏度高、特異性好、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0022]圖1為細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組分總離子流色譜圖及提取離子色譜圖。
[0023]圖2為細(xì)胞內(nèi)氨基酸組分總離子流色譜圖及提取離子色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0025](I)以IfepG2為模式細(xì)胞,接種于六孔板內(nèi),細(xì)胞接種密度為1.2X 15個(gè)/mL,六孔板每孔培養(yǎng)液用量為2.5mL,培養(yǎng)液為DMEM(高糖)液體培養(yǎng)基,含4500mg/l葡萄糖,含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)為I %的青霉素-鏈霉素。在培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后(370C ,5% CO2),移棄培養(yǎng)液,每孔加入ImL水快速清洗并吸棄,然后加入液氮淬滅,液氮用量為填?兩八孔板的每孔。液氣揮發(fā)完后每孔加入0.5mL超純水超聲破碎5min,移出八孔板,每孔分別置于一個(gè)離心管,-20°C冷凍干燥;凍干后每個(gè)離心管加入1yL內(nèi)標(biāo)混合液即包括正亮氨酸(200nmol/L),十一酸和十九酸(分別10mg/L)的乙腈溶液。脂肪酸的提取采用MTBE法,每個(gè)離心管加入MTBE量為400 μ L,渦旋振蕩時(shí)間為20min,然后每個(gè)離心管加入超純水260 μ L,禍旋振蕩5min,8°C下離心12000rpmX 20min,每個(gè)離心管取上清氮?dú)獯蹈珊笥靡译娑ㄈ莸?00 μ L用于游離脂肪酸的分析,提取脂肪酸后剩余部分每個(gè)離心管再依次加入100 μ L MTBE和130 yL甲醇,渦旋提取20min, 8°C下離心12000rpmX 20min,取下層直接用于游離氨基酸分析。
[0026](2)游離脂肪酸組分的分析采用的色譜柱為Ufavour (:8柱(150mmX2.lmm, 3.0 μm);流動(dòng)相A為H2O,流動(dòng)相B為含5mM乙酸錢的乙腈,流動(dòng)相C為乙腈;流動(dòng)相梯度為(時(shí)間,流動(dòng)相體積百分?jǐn)?shù),流動(dòng)相總流速;):0-5min,流動(dòng)相A10%,流動(dòng)相B20% ,流動(dòng)相C70% , 250 μ L/min ;第6min,在I分鐘內(nèi)流動(dòng)相A由10%線性減少為0%,流動(dòng)相C由70%線性增加為80%,250 yL/min ;7-15min,流動(dòng)相B 20% ,流動(dòng)相C 80% , 250 μ L/min ;第16min,在I分鐘內(nèi)流動(dòng)相A由0%線性增加為10%,流動(dòng)相C由80%線性減少為70%,流量由250 μ L/min線性增加到300 μ L/min ;17-20min,流動(dòng)相A10%,流動(dòng)相B 20%,流動(dòng)相C 70%,300 μ L/min ;柱溫箱溫度為40°C,進(jìn)樣量為10 μ Lo質(zhì)譜掃描模式為ESI (-)MRM。噴霧電壓為2500V ;輔助氣為5psi ;鞘氣為30psi ;整個(gè)分析過程在20min內(nèi)完成。游離氨基酸組分的分析采用Atlantis C18高效液相色譜柱(waters, 150mmX2.lmm, 3.0 μm);流動(dòng)相A為含0.1% (體積百分比)甲酸的H2O,流動(dòng)相B為甲醇;流動(dòng)相梯度為(按體積百分比計(jì)):0-2min,流動(dòng)相A 95%,流動(dòng)相B5% ;然后在3min之內(nèi)流動(dòng)相A線性減少為40%,流動(dòng)相B線性增加為60%,維持4min ;在I分鐘內(nèi)流動(dòng)相A線性增加到95%,流動(dòng)相B線性減少為5%,維持8min ;上述過程中流動(dòng)相A與流動(dòng)相B總流速始終為200 μ L/min,進(jìn)樣量為2 μ L。質(zhì)譜掃描模式為ESI (+) MRM。噴霧電壓為3000V ;輔助氣為5psi ;鞘氣為30psi ;整個(gè)分析過程18min內(nèi)完成。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種貼壁細(xì)胞中游離氨基酸和脂肪酸的提取及分析方法,其特征在于: (a)細(xì)胞于孔板中培養(yǎng)24?48h,待細(xì)胞鋪滿孔板被培養(yǎng)液覆蓋面積的60?80%,移棄培養(yǎng)液,每孔加入I?2mL水快速清洗并吸棄,然后加入液氮淬滅; (b)液氮揮發(fā)完后超聲破碎,得到破碎懸液,冷凍干燥,得到凍干樣品,每孔破碎懸液的凍干樣品中加入10?20 μ L內(nèi)標(biāo)混合液,渦旋混勻; (c)加入甲基叔丁基醚(MTBE)渦旋提取,加入水渦旋混勻,離心,取上清氮?dú)獯蹈?,然后乙腈定容,LC-MS分析游離脂肪酸; (d)取上清后的提取剩余部分加入MTBE和甲醇,渦旋提取,離心后取下層對游離氨基酸組分進(jìn)行LC-MS分析。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取及分析方法,其特征在于:步驟a中所述孔板為六孔板,六孔板每孔內(nèi)培養(yǎng)液體積為2?3mL,細(xì)胞的接種密度為I?3 X 15個(gè)/mL,在培養(yǎng)箱內(nèi)的培養(yǎng)條件為37°C,空氣中含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2;培養(yǎng)液為DMEM(高糖)液體培養(yǎng)基,含4500mg/l葡萄糖,含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)為I %的青霉素-鏈霉素;液氮用量為填滿六孔板的每一個(gè)孔。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取及分析方法,其特征在于:步驟b每孔加入0.5?ImL水超聲破碎,超聲破碎時(shí)間為3?5min,得到破碎懸液,移出每孔內(nèi)的破碎懸液分別置于單獨(dú)的離心管中,于-10?_40°C冷凍干燥,加入的內(nèi)標(biāo)混合液中,內(nèi)標(biāo)混合液:正亮氨酸濃度為200?400nmol/L,^ 酸濃度為10?20mg/L,十九酸濃度為10?20mg/L,溶劑為乙腈。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取及分析方法,其特征在于:步驟c中每孔樣品MTBE用量為400?800 μ L,渦旋提取時(shí)間為15?20min,加入水的體積為每孔樣品200?400 μ L,渦旋混勻時(shí)間為2?5min,提取過程中離心操作為4?8°C下離心20?30min,轉(zhuǎn)速為12000?15000rpm,取上清氮?dú)獯蹈珊竺靠讟悠酚靡译娑ㄈ莸?00?400 μ L用于游離脂肪酸的分析。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取及分析方法,其特征在于:步驟d中加入MTBE量為每孔樣品100?200 μ L,甲醇量為每孔樣品200?400 μ L,渦旋提取時(shí)間為15?20min,離心條件為4?8°C下,20?30min,轉(zhuǎn)速為12000?15000rpm。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取及分析方法,其特征在于:游離脂肪酸組分的分析采用的色譜柱為Ufavour C8柱(150mmX 2.1mm, 3.0 μ m);流動(dòng)相A為H 20,流動(dòng)相B為含I?5mM乙酸銨的乙腈,流動(dòng)相C為乙腈;流動(dòng)相梯度為(時(shí)間,流動(dòng)相體積百分?jǐn)?shù),流動(dòng)相總流速):0-5min,流動(dòng)相A10%,流動(dòng)相B20%,流動(dòng)相C70%,250 μ L/min ;第6111;[11,在I分鐘內(nèi)流動(dòng)相A由10%線性減少為0%,流動(dòng)相C由70%線性增加為80%,250 μ L/min ;7-15min,流動(dòng)相B 20%,流動(dòng)相C 80%,250 yL/min ;第16min,在I分鐘內(nèi)流動(dòng)相A由0%線性增加為10%,流動(dòng)相C由80%線性減少為70%,流量由250 μ L/min線性增加到300 μ L/min ;17-20min,流動(dòng)相AlO %,流動(dòng)相B 20% ,流動(dòng)相C 70%,300 μ L/min ;進(jìn)樣量為5?10 μ L ;質(zhì)譜掃描模式為ESI (-)MRM。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取及分析方法,其特征在于:游離氨基酸組分的分析采用Atlantis C18高效液相色譜柱(waters, 150mmX2.lmm,3.0ym);流動(dòng)相 A為含 0.1 ?0.5%(體積百分比)甲酸的H2O,流動(dòng)相B為甲醇;流動(dòng)相梯度為(按體積百分比計(jì)):0-2min,流動(dòng)相A 95%,流動(dòng)相B5% ;然后在3min之內(nèi)流動(dòng)相A線性減少為40%,流動(dòng)相B線性增加為60 %,維持4min ;在I分鐘內(nèi)流動(dòng)相A線性增加到95 %,流動(dòng)相B線性減少為5 %,維持8min ;上述過程中流動(dòng)相A與流動(dòng)相B總流速始終為200 μ L/min,進(jìn)樣量為2?5 μ L ;質(zhì)譜掃描模式為ESI (+)MRM。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK105842364SQ201510024144
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年1月16日
【發(fā)明人】耿檸波, 陳吉平, 張保琴, 張海軍, 王菲迪
【申請人】中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
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