一種沼液中游離氨基酸的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及沼液的綜合開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，涉及對(duì)樣品進(jìn)行前處理所需的技術(shù)，以及 所開發(fā)的適應(yīng)現(xiàn)代檢測(cè)儀器一次性分析沼液中24種游離氨基酸的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，剩余污泥的產(chǎn)生量隨著城鎮(zhèn)污水處理能力的高速發(fā)展而迅速增加。截止至 2013年，我國(guó)剩余污泥的年產(chǎn)生量就已經(jīng)達(dá)到625萬(wàn)t (以干基計(jì)）。其中的大部分并未得到 合理、安全的處理和處置。剩余污泥中富含氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)元素，有機(jī)質(zhì)含量可達(dá)50%_60%。 厭氧消化是一種在實(shí)現(xiàn)污泥的穩(wěn)定化同時(shí)產(chǎn)生作為能源的沼氣的技術(shù)，可以作為污泥處理 處置的合適選擇。在污泥厭氧消化過(guò)程中，除碳源以外的大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都保留在沼液和 沼渣中，尤其是氮、磷和鉀等在沼液中的含量很高。并且經(jīng)厭氧消化后，有機(jī)物大部分以簡(jiǎn) 單的、易于被動(dòng)植物吸收的小分子或離子狀態(tài)存在。這使得沼液和沼渣農(nóng)用資源化開發(fā)成 為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外污泥處理處置技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。
[0003] 在厭氧消化過(guò)程中，有機(jī)氮中一部分被轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮，另一部分則參與代謝或分 解為氨基氮如游離氨基酸等的形式。氨基酸對(duì)植物生長(zhǎng)特別是光合作用具有獨(dú)特的促進(jìn)作 用，尤其是甘氨酸，它可以增加植物葉綠素含量，提高酶的活性，促進(jìn)二氧化碳的滲透，使光 合作用更加旺盛，對(duì)提高作物品質(zhì)，增加維生素 C和糖類的含量都有著重要作用。因此為了 解沼液中氮組分組成和存在形態(tài)以指導(dǎo)污泥綜合利用，建立快速、有效的氨基酸測(cè)試方法 顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種沼液中24種游離氨基酸的檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)pH調(diào)節(jié)和旋蒸去除沼液氨氮和揮發(fā)性生物胺，使用Mill ipore新型超 濾離心管去除大分子物質(zhì)，然后聯(lián)合柱前衍生-反向-高效液相的方法對(duì)沼液游離氨基酸做 了分析，為厭氧消化過(guò)程中蛋白質(zhì)降解機(jī)理研究提供基礎(chǔ)，并且為沼液和沼渣農(nóng)用資源化 開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，采用如下技術(shù)方案：一種沼液中24種游離氨基酸的 檢測(cè)方法，包括調(diào)節(jié)沼液pH至10.2后旋蒸去掉沼液內(nèi)高濃度的氨氮和揮發(fā)性生物胺，運(yùn)用 0.5ML 3K Millipore超濾離心管去除大分子干擾物，運(yùn)用鄰苯二甲醛(0ΡΑ)及氯甲酸9-芴 基甲酯(FM0C)兩種衍生化試劑對(duì)氨基酸進(jìn)行柱前衍生化使得氨基酸具有熒光發(fā)射特征來(lái) 提高檢測(cè)靈敏度和分離選擇特性，然后運(yùn)用反向-高效液相對(duì)24種氨基酸進(jìn)行定性定量分 析;具體步驟如下： (1)、儀器和試劑的選擇 所用儀器為Agilent-1260液相色譜儀，配有在線脫氣機(jī)、四元梯度栗、標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣 器、熒光檢測(cè)器（FLD)及Agilent化學(xué)工作站；17種氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)：天冬氨酸、絲氨 酸、色氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、纈 氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸及苯丙氨酸，補(bǔ)充氨基酸(天門冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸、 正纈氨酸、賴氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸）以及衍生化試劑鄰苯二甲醛(〇PA，HPLC)、3-巰基丙酸 (3-MPA，HPLC)和氯甲酸9-芴基甲酯(FMOC，HPLC)均為Sigma( St Louis，MO，USA)產(chǎn)品。甲 醇、乙腈為HPLC級(jí)試劑;實(shí)驗(yàn)用水是Milli-Q水（Millip〇re，USA);其他試劑均為優(yōu)級(jí)純， 內(nèi)標(biāo)物α-氨基丁酸； (2 )、樣品的制備 (2.1) 樣品的前處理 將沼液過(guò)0.22μπι的濾膜去掉顆粒物，用1Μ氫氧化鈉調(diào)節(jié)過(guò)濾后的濾液pH值至10.2，取 上述沼液5ml于50ml旋蒸前型瓶中于40°C下抽真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，以去掉高濃度氨氮和揮 發(fā)性生物胺，用5ml 0.1M鹽酸重新溶出，渦旋30s混勻，得到重新溶出液;取所述重新溶出 液200yL于0.5ML 3K Mliipore超濾離心管內(nèi)，13000g離心至所有液體通過(guò)，禍旋混勾置于4 °C待用； (2.2) 樣品的衍生化處理 在0.5微升的步驟(2.1)所得樣品中混合0.5微升的0PA和0.5微升的FM0C，接著用32微 升的每100ml流動(dòng)相A加400微升的磷酸的混合溶液稀釋，所得溶液用于RT-HPLC分析;混合 時(shí)間為2min，可通過(guò)安捷倫HPLC自動(dòng)進(jìn)樣程序自動(dòng)混合，來(lái)嚴(yán)格控制各反應(yīng)時(shí)間。
[0007] (3)、RT_HPLC 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbox Eclipse AAA 柱（3.5 μηι，4· 6mm X 150 mm); 流動(dòng)相A 為0· 04 mol /L NaH2P〇4( lOmol/L NaOH 調(diào)至pH = 7. 8);流動(dòng)相B 為超 純水：乙腈：甲醇為10: 45: 45( V /V /V); 焚光檢測(cè)波長(zhǎng):Ex = 340 nm，Em = 460 nm，PMT=10;15·25min換波長(zhǎng)Ex = 266 nm，Em =305 nm ,PMT=9； 流速:2ml/min〇
[0008] 柱溫:40°C; 流動(dòng)相洗脫梯度見表1.
14)忮步驟Uij所還ΚΓ-此Lunin汆懺對(duì)步驟U)處埋后的杵不上機(jī)測(cè)訊，侍到虱垂酸甘 布譜圖。采用保留時(shí)間法對(duì)樣品中氨基酸定性，即在相同的色譜分析條件下，樣品中氨基酸 的色譜峰與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)的色譜峰保留時(shí)間相同或相近，則認(rèn)為樣品中含有此氨基酸。在每 次衍生化反應(yīng)之前，將內(nèi)標(biāo)物加入到樣品中，采用內(nèi)標(biāo)工作曲線法對(duì)樣品中游離氨基酸的 濃度進(jìn)行定量分析。
[0009]本發(fā)明與現(xiàn)有前處理方法和檢測(cè)方法相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)： 1、沼液呈黃色，有許多細(xì)小固體懸浮物，成分復(fù)雜，干擾組分較多，加上濃度極高的氨 和揮發(fā)性胺會(huì)與某些待測(cè)氨基酸形成熒光副產(chǎn)物，干擾氨基酸的分析測(cè)定，對(duì)于這些干擾 物的去除，本發(fā)明創(chuàng)新性的采用了調(diào)節(jié)沼液pH至10.2后40°C下低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氨氮和揮 發(fā)性生物胺，運(yùn)用0.5ML 3K Mliipore新型超濾離心管的方式去除大分子干擾物，避免了常 規(guī)采用的（強(qiáng)）陽(yáng)離子固相萃取小柱(SCX-SPE)去除干擾物過(guò)程中干擾物與氨基酸的非選擇 性吸附的缺點(diǎn)。
[0010] 2、本發(fā)明所涉及方法與常規(guī)的（強(qiáng)）陽(yáng)離子固相萃取小柱(SCX-SPE)去除干擾物的 方式相比，避免了由于氨基酸的等電點(diǎn)不同而引起的SCX-SPE對(duì)氨基酸的選擇性，以及測(cè)定 樣品時(shí)回收率低和重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)。步驟簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)。
[0011] 3、本發(fā)明采用兩種衍生化試劑0PA-FM0C聯(lián)用并聯(lián)合Millipore新型超濾離心管實(shí) 現(xiàn)了沼液內(nèi)24種氨基酸的全分析。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為本發(fā)明的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品得到的譜圖。
[0013]圖2、3為實(shí)施例1中5%反應(yīng)器和20%反應(yīng)器產(chǎn)生沼液樣品得到的譜圖。
[00M]圖4兩種不同前處理方法得到的沼液中DFAA液相色譜對(duì)比圖，（a)pH2.2條件下通 過(guò)SCX前處理得到的沼液中DFAA色譜圖（b)Millip〇re新型超濾離心管前處理得到的沼液 中DFAA色譜圖。
[0015]圖中標(biāo)號(hào)：1-天門冬氨酸，2-谷氨酸，3-天門冬酰胺，4-絲氨酸，5-谷氨酰胺，6-組 氨酸，7-甘氨酸，8-蘇氨酸，9-瓜氨酸，10-精氨酸，11-丙氨酸，12-酪氨酸，13-α-氨基丁酸， 14-胱氨酸，15-纈氨酸，16-蛋氨酸，17-正纈氨酸，18-色氨酸，19-苯丙氨酸，20-異亮氨酸， 21-亮氨酸，22-賴氨酸，23-羥脯氨酸，24-肌氨酸，25-脯氨酸。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于所述內(nèi)容。
[0017] 實(shí)施例1 采取含固率為5%和20%的6L污泥厭氧消化小試試驗(yàn)裝置出料沼液和進(jìn)料剩余污泥作為 實(shí)驗(yàn)材料。將上述所有的沼液分別過(guò)〇. 22μπι的濾膜去除顆粒物，用1Μ氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至 10.2,取上述沼液各5ml于50ml旋蒸前型瓶中于40攝氏度下抽真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干以去掉高 濃度氨氮和揮發(fā)性生物胺，用5ml 0.1M鹽酸重新溶出，渦旋30s混勻。取上述重新溶出液 200yL于0.5ML 3K Mliipore新型超濾離心管內(nèi)，13000g離心至所有液體通過(guò)，渦旋混勻置 于4°C待用。
[0018] 上述樣品經(jīng)安捷倫HPLC1260自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣程序如下：0.5yL混合0.5yL