人血清中三種極長鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人血清中三種極長鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法，包括：（1）人血清樣品前處理得到衍生化產(chǎn)物；（2）對所述衍生化產(chǎn)物用氣相色譜-質(zhì)譜儀進行檢測；（3）根據(jù)所述衍生化產(chǎn)物的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖對所述人血清樣品中各極長鏈脂肪酸進行定性分析，根據(jù)選擇離子色譜圖計算所述人血清樣品中各極長鏈脂肪酸的含量，所述極長鏈脂肪酸包括二十二烷酸、二十四烷酸和二十六烷酸。相比于【背景技術(shù)】，本發(fā)明的前處理過程快速、靈敏、準確。
【專利說明】人血清中三種極長鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及極長鏈脂肪酸檢測的【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種人血清中三種極長鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]體內(nèi)的超長鏈飽和脂肪酸VLCFA (very-long-chain fatty acids)主要包括二十二烷酸(C22:0 )、二十四烷酸(C24:0 )和二十六烷酸(C26:0 )3種，它們只能在過氧化物酶體中進行β_氧化。VLCFA在體內(nèi)主要以酯的方式存在，包括甘油三酯、磷脂、糖脂等，但是也有少部分以游離方式或游離方式結(jié)合血清白蛋白存在。
[0003]測定血清中VLCFA的含量，可以用來輔助診斷疑似過氧化物酶體代謝失調(diào)相關(guān)的遺傳代謝性疾病，包括過氧化物酶體生源性失調(diào)、X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良以及過氧化物酶體功能評價等。
[0004]目前，廣泛使用的人血清中極長鏈脂肪酸的檢測方法為氣相色譜(GC)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)，因為使用GC和GC-MS要求檢測的化合物必須揮發(fā)性強，熱穩(wěn)定性好，因此，極長鏈脂肪酸在上機檢測之前，必須進行相應(yīng)的前處理，使其轉(zhuǎn)化成為適合GC和GC-MS檢測的化合物，這也就導致極長鏈脂肪酸的前處理過程復雜，分析時間較長，應(yīng)用時
具有一定的局限性。
[0005]目前，國內(nèi)外使用最廣泛的前處理方法就是將脂肪酸進行硅烷衍生化或甲酯化反應(yīng)，生成硅烷化產(chǎn)物或者甲酯化產(chǎn)物，然后進GC或GC-MS檢測。
[0006]硅烷衍生化的前處理步驟:首先進行水解，將在體內(nèi)以酯化方式存在的極長鏈脂肪酸水解出來，采用非極性的溶劑萃取游離的脂肪酸，氮氣吹干之后，加入衍生化試劑反應(yīng)，衍生化產(chǎn)物上機測定。
[0007]甲酯化的前處理步驟分為兩種:一種為采用有機溶劑將游離的脂肪酸及以酯化狀態(tài)存在的脂肪酸使用非極性溶劑或者混合溶劑萃取之后，加入甲酯化試劑，其中游離的脂肪酸進行甲酯化反應(yīng)，酯化狀態(tài)的脂肪酸發(fā)生轉(zhuǎn)甲酯化反應(yīng)，然后采用正己烷萃取甲酯化的產(chǎn)物，氮氣吹干，復溶后檢測；另一種為直接在樣品中加入甲酯化試劑，游離的脂肪酸進行甲酯化反應(yīng)，結(jié)合狀態(tài)的脂肪酸進行轉(zhuǎn)甲酯化反應(yīng)，然后采用有機溶劑萃取甲酯化的產(chǎn)物，氮氣吹干，復溶后檢測。
[0008]由于血清中含有大量非極性的留醇類，在采用非極性的有機溶劑萃取脂肪酸時，會同時萃取到大量的留醇類雜質(zhì)，這些留醇類化合物上機檢測，所得的響應(yīng)非常高，干擾到目標化合物在色譜柱上的分離分析，因此在前處理過程中去除留醇類雜質(zhì)的干擾必不可少。
[0009]針對留醇類雜質(zhì)的去除，在采用硅烷衍生化方法時，在水解之后將溶液加鹽酸酸化，使用正己烷萃取，這一步同時將脂肪酸和非極性的留醇類化合物萃取出來，然后再加入氫氧化鉀，使脂肪酸發(fā)生皂化反應(yīng)，以離子化狀態(tài)存在于水相層，而沒有羧基的留醇類雜質(zhì)由于沒有發(fā)生皂化反應(yīng)，仍然留在了有機相層，通過將有機相層棄除，來除掉大部分的甾醇類雜質(zhì)，然后在水相層中再次加入鹽酸，使離子化的脂肪酸呈現(xiàn)游離狀態(tài)，加入正己烷萃取，氮氣吹干，進行衍生化反應(yīng)，該方法步驟繁瑣，操作復雜，萃取效率低，不利于得到穩(wěn)定的結(jié)果。而使用甲酯化反應(yīng)的前處理方法中沒有涉及到留醇類化合物去除的步驟。
[0010]由于目前報道的測定血清中極長鏈脂肪酸的前處理方法都非常復雜，因此建立一種快速、靈敏、準確的前處理方法就顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明實施例所要解決的技術(shù)問題是提供一種人血清中三種極長鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法，前處理過程快速、靈敏、準確。
[0012]為了解決上述問題，本發(fā)明公開了一種人血清中三種極長鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法，所述方法包括:
[0013](1)、人血清樣品前處理得到衍生化產(chǎn)物，包括:
[0014]在人血清中加入十七烷酸和二十七烷酸的混合內(nèi)標溶液，再加入鹽酸-乙腈溶液，充分混勻后在設(shè)定為80?120°C的烘箱中酸水解；
[0015]將酸水解后的溶液靜置冷卻至室溫,加入氫氧化鈉-甲醇水溶液,充分混勻后在設(shè)定為80?120°C的烘箱中堿水解；
[0016]將堿水解后的溶液靜置冷卻至室溫，加入正己烷萃取留醇類雜質(zhì)，棄除上層溶液，加入鹽酸至溶液的pH值顯酸性；
[0017]加入正己烷并充分混勻，離心后取出上層溶液用氮氣吹干，在殘渣中加入衍生化試劑，置于70?90°C的烘箱中進行衍生化反應(yīng)得到衍生化產(chǎn)物；
[0018](2)、對所述衍生化產(chǎn)物用氣相色譜-質(zhì)譜儀進行檢測；
[0019]其中，氣相色譜條件包括:
[0020]色譜柱:Rxi_-5SilMS 30mΧ0.25mmΧ0.25 μ m ；
[0021]載氣:氦氣，99.999% ；
[0022]載氣流速:1.0mL/min ；
[0023]進樣方式:不分流進樣；
[0024]進樣體積:1 μ L ;
[0025]進樣口溫度:300°C;
[0026]Post Run Temp:320°C ；
[0027]Post Run Time:3min ；
[0028]其中，質(zhì)譜條件包括:
[0029]電離源:電子轟擊離子源，70ev ；
[0030]傳輸線溫度:310°C ;
[0031]離子源溫度:280 °C ;
[0032]四極桿質(zhì)量分析器溫度:150°C ；
[0033]溶劑延遲時間:6min ；
[0034]掃描模式:全掃描和選擇離子掃描，全掃描范圍為m/z73.00-500.00 ；
[0035](3)、根據(jù)所述衍生化產(chǎn)物的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖對所述人血清樣品中各極長鏈脂肪酸進行定性分析，根據(jù)選擇離子色譜圖計算所述人血清樣品中各極長鏈脂肪酸的含量，所述極長鏈脂肪酸包括二十二烷酸、二十四烷酸和二十六烷酸。
[0036]優(yōu)選地，所述酸水解的時間為40~60min，所述堿水解的時間為40~60min。
[0037]優(yōu)選地，所述人血清樣品與所述鹽酸-乙腈溶液的體積比為(1:20)~(1:40)，所述人血清樣品與所述氫氧化鈉-甲醇水溶液的體積比為(1:20)~(1:40)；
[0038]所述將堿水解后的溶液靜置冷卻至室溫，加入正己烷萃取留醇類雜質(zhì)，棄除上層溶液，加入鹽酸至溶液的pH值顯酸性的步驟中，所述正己烷與所述人血清樣品的體積比為(40:1)~(60:1),所述鹽酸與所述人血清樣品的體積比為(5:1)~(10:1)；
[0039]所述加入正己烷并充分混勻，離心后取出上層溶液進行萃取的步驟中，所述正己烷與所述人血清樣品的體積比為(40:1)~(100:1)。
[0040]優(yōu)選地，所述十七烷酸和二十七烷酸的混合內(nèi)標溶液包括十七烷酸和二十七烷酸，其中，所述十七烷酸和二十七烷酸的質(zhì)量比為(8:1)~(15:1)。
[0041]優(yōu)選地，所述衍生化試劑包括雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷，所述雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺與所述三甲基氯硅烷的比例為99:1。
[0042]優(yōu)選地，氣相色譜的色譜柱升溫程序包括:
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種人血清中三種極長鏈脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法，其特征在于，所述方法包括:(1)、人血清樣品前處理得到衍生化產(chǎn)物，包括:在人血清中加入十七烷酸和二十七烷酸的混合內(nèi)標溶液，再加入鹽酸-乙腈溶液，充分混勻后在設(shè)定為80~120°C的烘箱中酸水解；將酸水解后的溶液靜置冷卻至室溫，加入氫氧化鈉-甲醇水溶液，充分混勻后在設(shè)定為80~120°C的烘箱中堿水解；將堿水解后的溶液靜置冷卻至室溫，加入正己烷萃取留醇類雜質(zhì)，棄除上層溶液，加入鹽酸至溶液的pH值顯酸性；加入正己烷并充分混勻，離心后取出上層溶液用氮氣吹干，在殘渣中加入衍生化試劑，置于70~90°C的烘箱中進行衍生化反應(yīng)得到衍生化產(chǎn)物；(2)、對所述衍生化產(chǎn)物用氣相色譜-質(zhì)譜儀進行檢測；其中，氣相色譜條件包括:色譜柱:Rxi?-5Sil MS 30mX0.25mmX0.25 μ m ；載氣:氦氣，99.999% ；載氣流速:1.0mL/min ；進樣方式:不分流進樣；進樣體積:ι μ L ;進樣口溫度:300°c ；Post Run Temp:320°C ；Post Run Time:3min ；其中，質(zhì)譜條件包括:電尚源:電子轟擊尚子源，70ev ；傳輸線溫度:310 C ；離子源溫度:280°C ；四極桿質(zhì)量分析器溫度:150°C ；溶劑延遲時間:6min ；掃描模式:全掃描和選擇離子掃描，全掃描范圍為m/z73.00-500.00 ；(3)、根據(jù)所述衍生化產(chǎn)物的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖對所述人血清樣品中各極長鏈脂肪酸進行定性分析，根據(jù)選擇離子色譜圖計算所述人血清樣品中各極長鏈脂肪酸的含量，所述極長鏈脂肪酸包括二十二烷酸、二十四烷酸和二十六烷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸水解的時間為40~60min，所述堿水解的時間為40~60min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述人血清樣品與所述鹽酸-乙腈溶液的體積比為(1:20)~(1:40)，所述人血清樣品與所述氫氧化鈉-甲醇水溶液的體積比為(1:20)~(1:40)；所述將堿水解后的溶液靜置冷卻至室溫，加入正己烷萃取留醇類雜質(zhì)，棄除上層溶液，加入鹽酸至溶液的pH值顯酸性的步驟中，所述正己烷與所述人血清樣品的體積比為(40:1)~(60:1),所述鹽酸與所述人血清樣品的體積比為(5:1)~(10:1)；所述加入正己烷并充分混勻，離心后取出上層溶液進行萃取的步驟中，所述正己烷與所述人血清樣品的體積比為(40:1)~(100:1)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述十七烷酸和二十七烷酸的混合內(nèi)標溶液包括十七燒酸和二十七燒酸，其中，所述十七燒酸和二十七燒酸的質(zhì)量比為(8:1)~(15:1)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生化試劑包括雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷，所述雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺與所述三甲基氯硅烷的比例為99:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，氣相色譜的色譜柱升溫程序包括:
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，選擇離子掃描(SIM)模式參數(shù)包括:|
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述根據(jù)所述衍生化產(chǎn)物的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖對人血清樣品中各極長鏈脂肪酸進行定性分析，根據(jù)選擇離子色譜圖計算所述人血清樣品中各極長鏈脂肪酸的含量的步驟包括:以所述衍生化產(chǎn)物中三種極長鏈脂肪酸分別與標準品的保留時間、全掃描所得的質(zhì)譜圖進行譜庫檢索以及與標準物質(zhì)的質(zhì)譜圖進行比對作為定性依據(jù)；用內(nèi)標標準曲線法定量，依據(jù)各極長鏈脂肪酸的峰面積分別與相應(yīng)內(nèi)標物峰面積的比值為縱坐標，各極長鏈脂肪酸的濃度分別與內(nèi)標物的濃度比值為橫坐標，繪制標準曲線，計算所述人血清樣品中各極長鏈脂肪酸的含量。
【文檔編號】G01N30/02GK103645263SQ201310720163
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】李維, 程雅婷, 趙蓓蓓, 劉偉霞, 吳華順 申請人:廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司