抑制素b的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及抑制素b測(cè)試方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測(cè)試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種抑制素 B的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒 及抑制素 B測(cè)試方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抑制素 B是由生殖系統(tǒng)細(xì)胞分泌產(chǎn)生，與生殖能力有密切關(guān)系，對(duì)生殖功能具有內(nèi) 分泌、旁分泌和自分泌的調(diào)節(jié)作用。目前已經(jīng)證實(shí)抑制素 B是卵巢儲(chǔ)備功能和睪丸曲細(xì)精管 功能的主要標(biāo)記物，可W用于卵巢因素引起的女性不孕和曲細(xì)精管功能障礙引起的男性不 育檢測(cè)。
[0003] 目前，抑制素 B的檢測(cè)采用常規(guī)酶聯(lián)免疫方法化LISA)，具體操為:首先，向樣本中 添加預(yù)先包被的微孔板，進(jìn)行解育后，經(jīng)多次洗涂，再加入二抗酶標(biāo)及顯色系統(tǒng)，通過(guò)酶標(biāo) 儀讀取OD值，W判定樣品中抑制素 B的濃度。然而采用常規(guī)的酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)抑制素 B，由 于耗時(shí)較長(zhǎng)、檢測(cè)線性狹窄，靈敏度低、抗干擾能力弱，不利于在臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)中使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于，提供一種抑制素 B的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及抑制素 B測(cè) 試方法，W克服現(xiàn)有測(cè)試抑制素 B方法存在的耗時(shí)較長(zhǎng)、檢測(cè)線性狹窄，靈敏度低、抗干擾能 力弱等的不足。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0006] -種抑制素 B的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于:包括包被有抗抑制素 B抗體的 酶標(biāo)板、生物素標(biāo)記二抗、親和素標(biāo)記酶標(biāo);其中，制備所述包被有抗抑制素 B抗體的酶標(biāo)板 所用的包被原是針對(duì)抑制劑郵亞單位特異性抗體，所述生物素標(biāo)記二抗為生物素標(biāo)記抑制 素 Ba亞單位單克隆抗體。
[0007] W及，一種檢測(cè)抑制素 B的方法，包括采用本發(fā)明抑制素 B的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒 對(duì)待測(cè)樣品檢測(cè)的步驟。
[0008] 上述本發(fā)明抑制素 B的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒含有針對(duì)抑制劑郵亞單位特異性抗體 包被原的酶標(biāo)板和生物素標(biāo)記抑制素 Ba亞單位單克隆抗體，使得因此，本發(fā)明抑制素 B的酶 聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒特異性強(qiáng)、能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)體液中抑制素 B含量，如最低檢測(cè)限能達(dá)到 Wng/L，樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測(cè)大量的樣品，本發(fā)明對(duì)解決大批量樣 品的抑制素 B檢測(cè)技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0009] 進(jìn)一步地，所述生物素標(biāo)記抑制素 Ba亞單位單克隆抗體中的抑制素 Ba亞單位單克 隆抗體通過(guò)由半抗原人工重組抑制素 Ba亞單位膚段與載體蛋白偶聯(lián)成免疫經(jīng)體內(nèi)免疫反 應(yīng)制備獲得，提高了本發(fā)明抑制素 B的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒特異性強(qiáng)、能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)體 液中抑制素 B含量。
[0010] 上述本發(fā)明檢測(cè)抑制素 B的方法是直接采用上述本發(fā)明抑制素 B的酶聯(lián)免疫檢測(cè) 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)抑制素 B，因此，本發(fā)明檢測(cè)抑制素 B的方法靈敏高，特異性和抗干擾能力 強(qiáng)，能快速同時(shí)檢測(cè)大量的樣品。
【附圖說(shuō)明】
[0011]下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中：
[001^ 圖巧本發(fā)明抑審朦B的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0014] 本發(fā)明實(shí)施例提供了具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、省時(shí)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，用于 抑制素 B的檢測(cè)。
[001引在一實(shí)施例中，該抑制素 B的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒包括包被有抗抑制素 B抗體的酶 標(biāo)板、生物素標(biāo)記二抗、親和素標(biāo)記酶標(biāo)。
[0016] 運(yùn)樣，本發(fā)明實(shí)施例抑制素 B的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒中的酶標(biāo)板上的每個(gè)孔均包 被有相同量的抗體，加入待測(cè)抑制素 B樣品，固相包被抗體和待測(cè)抑制素 B反應(yīng)，所W當(dāng)待測(cè) 的抑制素 B濃度高時(shí)，則被結(jié)合在固相抗體上抑制素 B多，加入的生物素標(biāo)記二抗及親和素 標(biāo)記酶標(biāo)與被固定抑制素 B結(jié)合量多，用洗涂液洗涂后加入底物液（顯色液），顯色反應(yīng)深， 用酶標(biāo)儀檢測(cè)的OD值高;反之，當(dāng)待測(cè)抑制素 B濃度低時(shí)，則所測(cè)的OD值低。根據(jù)用已知的抑 制素 B濃度檢測(cè)所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可W推算出待測(cè)抑制素 B的濃度。
[0017] 因此，在一實(shí)施例中，本發(fā)明實(shí)施例抑制素 B的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒中的包被有抗 抑制素 B抗體的酶標(biāo)板的制備過(guò)程中，所用的包被原是針對(duì)抑制素郵亞單位單克隆抗體，所 用包被液是碳酸鋼緩沖液，所用封閉液是含明膠的該包被液。在進(jìn)一步實(shí)施例中，碳酸鋼緩 沖液的濃度為1 % (w/v)~3% (w/v)。在另一實(shí)施例中，在該封閉液中，明膠含量為0.5% (v/ V)~5%(v/v)，優(yōu)選為1%。
[0018] 另外，包被有抗抑制素 B抗體的酶標(biāo)板的制備方法可W按照常規(guī)的包被抗體的酶 標(biāo)板的制備方法。
[0019] 在另一實(shí)施例中，所述生物素標(biāo)記二抗為生物素標(biāo)記抑制素 Ba亞單位單克隆抗 體。
[0020] 在進(jìn)一步實(shí)施例中，所述生物素標(biāo)記抑制素 Ba亞單位單克隆抗體中的抑制素 Ba亞 單位單克隆抗體是由半抗原人工重組抑制素 Ba亞單位膚段與載體蛋白偶聯(lián)成免疫原，再將 體內(nèi)免疫反應(yīng)和細(xì)胞培養(yǎng)、純化獲得。所述生物素標(biāo)記抑制素 Ba亞單位單克隆抗體由該方 法獲得，提高了本發(fā)明抑制素 B的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒特異性強(qiáng)、能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)體液中 抑制素 B含量。
[0021] 在一優(yōu)選實(shí)施例中，半抗原人工重組抑制素 Ba亞單位膚段是由下述方法制備獲 得：
[0022] 步驟SOI:根據(jù)抑制素 B編碼基因 INHBA，設(shè)計(jì)優(yōu)勢(shì)序列，進(jìn)行原核表達(dá)，PCR篩選陽(yáng) 性克??；
[0023] 步驟S02:將所述陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入E.coli BL21 (DE3)進(jìn)行培養(yǎng)至0D600 = 0.4-0.6，加 誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)處理，離屯、收集菌體；
[0024] 步驟S03:將收集的所述菌體破碎處理，并分離純化處理，得到所述半抗原人工重 組抑制素 Ba亞單位膚段。
[0025] 其中，上述步驟SOl中的抑制素 B編碼基因 INHBA是從GeneBank檢索的抑制素 B編碼 基因 INHBA。該抑制素 B編碼基因 INHBA如下沈QID NO: 1所示：
[0027] 上述沈QID N0:1所述的序列公用數(shù)據(jù)庫(kù)可查，如GenBa址:BT006954.1。
[0028] 該步驟SOl中設(shè)計(jì)優(yōu)勢(shì)序列如SEQID NO:2所示：
[0032] 該步驟SOl中的原核表達(dá)是將設(shè)計(jì)優(yōu)勢(shì)序列轉(zhuǎn)入T載體，PET-24b原核表達(dá)。
[0033] 上述步驟S02中的將所述陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入E.coli BL2UDE3)進(jìn)行培養(yǎng)方法是將帶有 正確表位的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入E.coli化21(DE3)，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，37°C震蕩（150巧m)培養(yǎng)至 00600 = 0.4-0.6。
[0034] 該步驟S02中加的誘導(dǎo)劑為IPTG至終濃度ImM。誘導(dǎo)表達(dá)處理的條件可W是在30°C 誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)。
[0035] 上述步驟S03中的體破碎處理方法是將離屯、收集菌體用抑7.4的PB重懸菌體，超聲 波破碎菌體，離屯、分離上清。
[0036] 該步驟S03中的分離純化處理是將分離的上清液進(jìn)行SDS-PAGE膠分析，收集分子 量約15.5邸、14KD處的蛋白帶，采用NI親和純化目的蛋白，即得到半抗原人工重組抑制素 Ba 亞單位膚段。在一實(shí)施例中，由半抗原人工重組抑制素 Ba亞單位膚段與載體蛋白偶聯(lián)成免 疫原中的載體蛋白選用牛血清白蛋白（BSA)、卵清蛋白（OVA)或匙孔血藍(lán)蛋白化LH)中的至 少一種。該些載體蛋白能有效與半抗原人工重組抑制素 Ba亞單位膚段進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)生成免 疫原。另外，該半抗原人工重組抑制素 Ba亞單位膚段與載體蛋白的偶聯(lián)反應(yīng)方法可W按照 常規(guī)的制備免疫原的方法進(jìn)行。
[0037] 在一實(shí)施例中，上述抑制素 B的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒實(shí)施例中的生物素標(biāo)記二抗 即生物素標(biāo)記抑制素 Ba亞單位單克隆抗體中的生物素標(biāo)記物選用酷-N徑基下二酷亞胺醋 (BNHS)、酷阱(BHZ)和阱化生物胞素(BC監(jiān)）、3-(N-馬來(lái)酷亞胺-丙酷)-生物胞素(MPB)中的 至少一種