本發(fā)明涉及醫(yī)學免疫體外診斷領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素b1的方法。
背景技術(shù)：
：黃曲霉毒素b1(aflatoxinb1簡寫為afb1)是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰酮(香豆素)。黃曲霉毒素b1是已知的化學物質(zhì)中致癌性最強的一種。黃曲霉毒素b1對包括人和若干動物具有強烈的毒性，其毒性作用主要是對肝臟的損害。在天然食物中以黃曲霉毒素b1最為多見，危害性也最強，國家質(zhì)檢總局規(guī)定黃曲霉毒素b1是大部分食品的必檢項目之一；它在wto確定的重點研究毒物中被列為首位。當食品、飼料制品未能及時曬干或儲藏不當時極易受到黃曲霉毒素b1污染，黃曲霉毒素b1可通過直接或間接進入人類食物鏈，在機體內(nèi)干擾信息rna和dna的合成，進而影響細胞蛋白質(zhì)的合成，導致機體全身性的損害，其主要靶器官是肝臟，嚴重時可引起肝硬化、肝癌甚至死亡。并且，黃曲霉毒素b1十分耐熱，分解溫度為268℃，故在烹調(diào)過程中很難將其破壞。因此，把好食物及飼料入口關(guān)，建立簡便、快速、靈敏的黃曲霉毒素b1檢測方法顯得至關(guān)重要。國內(nèi)早期檢測黃曲霉毒素常用的方法有薄層色譜法(tlc)和高效液相色譜法(hplc)，但二者均存在著檢測時間長、儀器設(shè)備昂貴、操作復雜且不適于大批量樣品的檢測、需專業(yè)人員進行操作等缺點。免疫化學分析法的應(yīng)用開辟了黃曲霉毒素b1檢測的新領(lǐng)域，目前常用的方法有放射免疫分析法、熒光免疫分析法和酶聯(lián)免疫分析法等。其中，放射免疫分析雖然高靈敏、高特異，但存在有效期短、具有放射性污染的缺點；熒光免疫分析法雖然特異性強、敏感性高、速度快，但非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，程序也比較復雜；酶聯(lián)免疫分析法是70年代出現(xiàn)的新的免疫測定技術(shù)，其原理是抗原(或抗體)吸附于載體上的免疫吸附劑和用酶標記的抗體(或抗原)與標本中的待測物(抗原或抗體)起特異的免疫學反應(yīng)，然后加入酶底物進行顯色反應(yīng)，通過顏色的深淺來判斷樣品中待測物的含量，雖然靈敏度高、特異性強，但存在內(nèi)源性酶干擾、終止液為具有腐蝕性的硫酸、底物大部分有毒或為致癌物質(zhì)、吸光度的檢測易受到劃痕等多種外在因素的影響等缺點?；瘜W發(fā)光免疫分析法是在抗原抗體特異性結(jié)合的基礎(chǔ)上，依據(jù)化學發(fā)光檢測體系中待測物濃度與體系的化學發(fā)光強度在一定條件下呈線性定量關(guān)系的原理，利用儀器對體系化學發(fā)光強度進行檢測，從而確定待測物含量的一種痕量分析方法。吖啶酯是一類良好的熒光試劑，發(fā)光效率高，光猝滅效應(yīng)小，反應(yīng)條件溫和，不受連接臂長短的影響，近年來受到免疫化學工作者的廣泛關(guān)注。吖啶酯可以通過標記抗原、抗體和dna等生物大分子，實現(xiàn)化學發(fā)光免疫分析。化學發(fā)光免疫分析法因靈敏度高、線性動力學范圍寬、光信號持續(xù)時間長、分析方法簡便快捷、結(jié)果穩(wěn)定、誤差小、安全性好及使用期長等優(yōu)點，近年來在食品、臨床、獸醫(yī)、生命科學、環(huán)境等領(lǐng)域起到重要作用，是快速檢測食品、飼料中微量毒素殘留的重要手段。黃曲霉毒素具有很強的毒性和致癌性。黃曲霉毒素是微生物產(chǎn)生的，不像三聚氰胺屬于惡意添加。黃曲霉毒素是脂溶性的，如果牛飼料中存在黃曲霉毒素，牛肉中含量不會很高。但內(nèi)臟特別是肝臟中含量會高。黃曲霉毒素非常耐熱，加熱到280°都不會被破壞，所以米粉中只要含有，就不會被去除。紫外線只能少量破壞。從而，這導致在米粉中可能會含有黃曲霉毒素，由于嬰兒在成長時期，幾乎都會選擇一定量的米粉喂養(yǎng)，這便需要對嬰兒米粉(或者其他食品)進行黃曲霉毒素b1的檢測，根據(jù)《gb10765-2010食品安全國家標準嬰兒配方食品》中規(guī)定：黃曲霉毒素m1或黃曲霉毒素b1≤0.5μg/kg。目前，雖然針對黃曲霉毒素b1的檢測方法及檢測試劑盒的產(chǎn)品也有不少，但這些檢測產(chǎn)品檢出限較高，應(yīng)用于常規(guī)的檢測，對于嬰兒食品中的黃曲霉毒素b1的檢測，難以達到效果，即使有一些較為精密的檢測產(chǎn)品，但檢測成本高，一般的，因此，需要提供一種方便快速同時檢出限相對較低(滿足嬰兒食品中的黃曲霉毒素b1的檢測)的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種更加快速、靈敏的afb1含量檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素b1的方法，包括以下步驟：(1)樣品前處理：將嬰兒米粉與水按照5％稀釋為樣品液，37℃保濕封閉，備用；(2)制備黃曲霉毒素b1抗原afb1-bsa：用黃曲霉毒素b1(afb1)與羧甲基羥胺半鹽酸鹽在吡啶中反應(yīng)生成黃曲霉毒素b1肟(afb1o)，再用活性酯法將afb1o與載體蛋白偶聯(lián)合成完全抗原。采用該方法，afb1的肟化率和afb1o的利用率均較高。(3)吖啶酯標記的黃曲霉毒素抗原afb1-bsa-ae的制備：稱取吖啶酯酸1mg溶解于200uln,n-二甲基甲酰胺中，取該溶液50μl緩慢滴入250μl3.5mg/ml的afb1-bsa溶液中，并加入40μl0.1mol/lpbs，于25℃避光、150r/min反應(yīng)過夜，反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水4℃透析2d，備用。(4)建立標準曲線：用二抗包被2條化學發(fā)光板，37℃溫育2h；洗板3次，每孔加入350μl蒸餾水，37℃保濕封閉1.5h；洗板3次，每孔加入等量afb1單克隆抗體，37℃溫育45min；加入濃度分別為0、0.02、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的afb1標準品各50μl和經(jīng)稀釋的afb1-bsa-ae各50μl，混勻，空白孔加入100μlpbs，37℃恒溫45min；洗板4次，每孔加入tritonx-100吖啶酯啟動劑100μl，然后通過化學發(fā)光儀加入啟動劑ctab100μl，邊加邊測，共測定10次，取平均值；計算各濃度的結(jié)合率，制作標準曲線。(5)加樣進行免疫反應(yīng)測定：用二抗進行包被，37℃溫育2h；洗板3次，每孔加入350μl樣品液，37℃保濕封閉1.5h；洗板3次，加入afb1單克隆抗體4μg/ml進行競爭性化學發(fā)光檢測。(6)讀值定量：根據(jù)檢測的結(jié)果對比標準曲線獲得黃曲霉毒素b1的含量。進一步，制作標準曲線時，結(jié)合率(％)＝b/b0×100％，其中b0為不加afb1的發(fā)光值，b為加afb1的發(fā)光值。進一步，制作標準曲線時，每孔按照1∶1800加入afb1單克隆抗體100μl，并按照1∶500稀釋afb1-bsa-ae。進一步，在步驟(4)和步驟(5)中，采用15μg/ml兔抗鼠igg二抗進行包被。發(fā)明提供了一種化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素b1的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有更加快速、靈敏的效果：本申請的所述檢測的線性范圍為0.1～5.0ng/ml，回收率為75％～115％，變異系數(shù)為0.36％～1.20％，能靈敏準確地檢測樣品中的afb1含量。上述方法的檢出限能夠滿足嬰兒食品的黃曲霉毒素b1的檢測。附圖說明圖1為吖啶酯化學發(fā)光法檢測afb1方法的標準曲線。具體實施方式以下所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的保護范圍。實施例1一種化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素b1的方法，包括以下步驟：(1)樣品前處理：將嬰兒米粉與水按照5％稀釋為樣品液，，37℃保濕封閉，備用；(2)制備黃曲霉毒素b1抗原afb1-bsa：用黃曲霉毒素b1(afb1)與羧甲基羥胺半鹽酸鹽在吡啶中反應(yīng)生成黃曲霉毒素b1肟(afb1o)，再用活性酯法將afb1o與載體蛋白偶聯(lián)合成完全抗原。具體的，包括以下過程：a.黃曲霉毒素b1肟(afb10)的制備：取一定量afb1溶于甲醇：吡啶(1：1)溶液中，加入羧甲基羥胺半鹽酸鹽，70℃下攪拌作用5h。反應(yīng)過程中每隔30min取反應(yīng)液做薄層層析(tlc)，監(jiān)測afb1o合成反應(yīng)進程。用適量甲醇溶解afb1o，紫外分光光度計進行掃描，測定最大吸收峰處的光吸收值，計算afb-和afb-o濃度。b.afb10與戴體蛋白的連接：用dmf溶解afb1o，加入dcc和nhs，室溫磁力攪拌下反應(yīng)4h。取適量bsa(或hsa)溶解于碳酸鹽緩沖液中，磁力攪拌下將afb1o溶液逐滴加入蛋白溶液中，室溫下反應(yīng)2h。反應(yīng)溶液用pbs透析。afb1的肟化率和afb1o的利用率較高(經(jīng)檢測，afb1的肟化率和afb1o的利用率分別為85％和56％)，合成的完全抗原經(jīng)檢驗具有較好的免疫效果，保存360d后抗原效價沒有明顯變化。并且，選擇合成相對低結(jié)合比的完全抗原，不僅可以降低生產(chǎn)成本，而且有助于提高抗體的選擇和親和力。(3)吖啶酯標記的黃曲霉毒素抗原afb1-bsa-ae的制備：稱取吖啶酯酸1mg溶解于200uln,n-二甲基甲酰胺中，取該溶液50μl緩慢滴入250μl3.5mg/ml的afb1-bsa溶液中，并加入40μl0.1mol/lpbs，于25℃避光、150r/min反應(yīng)過夜，反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水4℃透析2d，備用。(4)建立標準曲線：采用15μg/ml兔抗鼠igg二抗包被2條化學發(fā)光板，37℃溫育2h；洗板3次，每孔加入350μl蒸餾水，37℃保濕封閉1.5h；洗板3次，每孔按照1∶1800加入afb1單克隆抗體100μl，37℃溫育45min；加入濃度分別為0、0.02、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的afb1標準品各50μl和按照1∶500稀釋的afb1-bsa-ae各50μl，混勻，空白孔加入100μlpbs，37℃恒溫45min；洗板4次，每孔加入tritonx-100吖啶酯啟動劑100μl，然后通過化學發(fā)光儀加入啟動劑ctab100μl，邊加邊測，共測定10次，取平均值；計算各濃度的結(jié)合率，制作標準曲線。制作標準曲線時，結(jié)合率(％)＝b/b0×100％，其中b0為不加afb1的發(fā)光值，b為加afb1的發(fā)光值。標準曲線如圖1所示。(5)加樣進行免疫反應(yīng)測定：采用15μg/ml兔抗鼠igg二抗進行包被，37℃溫育2h；洗板3次，每孔加入350μl樣品液，37℃保濕封閉1.5h；洗板3次，加入afb1單克隆抗體4μg/ml進行競爭性化學發(fā)光檢測。(6)讀值定量：根據(jù)檢測的結(jié)果對比標準曲線獲得黃曲霉毒素b1的含量。實施例2步驟同實施例1，樣品來源不同。檢測結(jié)果：實施例測得afb1含量(ng/ml)實施例10.18實施例20.32當前第1頁12