亚洲狠狠干,亚洲国产福利精品一区二区,国产八区,激情文学亚洲色图

一種化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法與流程

文檔序號:11197324閱讀:1071來源:國知局
一種化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素B1的方法與流程
本發(fā)明涉及醫(yī)學免疫體外診斷領(lǐng)域,更具體地說,涉及一種化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素b1的方法。
背景技術(shù)
:黃曲霉毒素b1(aflatoxinb1簡寫為afb1)是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物,含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰酮(香豆素)。黃曲霉毒素b1是已知的化學物質(zhì)中致癌性最強的一種。黃曲霉毒素b1對包括人和若干動物具有強烈的毒性,其毒性作用主要是對肝臟的損害。在天然食物中以黃曲霉毒素b1最為多見,危害性也最強,國家質(zhì)檢總局規(guī)定黃曲霉毒素b1是大部分食品的必檢項目之一;它在wto確定的重點研究毒物中被列為首位。當食品、飼料制品未能及時曬干或儲藏不當時極易受到黃曲霉毒素b1污染,黃曲霉毒素b1可通過直接或間接進入人類食物鏈,在機體內(nèi)干擾信息rna和dna的合成,進而影響細胞蛋白質(zhì)的合成,導致機體全身性的損害,其主要靶器官是肝臟,嚴重時可引起肝硬化、肝癌甚至死亡。并且,黃曲霉毒素b1十分耐熱,分解溫度為268℃,故在烹調(diào)過程中很難將其破壞。因此,把好食物及飼料入口關(guān),建立簡便、快速、靈敏的黃曲霉毒素b1檢測方法顯得至關(guān)重要。國內(nèi)早期檢測黃曲霉毒素常用的方法有薄層色譜法(tlc)和高效液相色譜法(hplc),但二者均存在著檢測時間長、儀器設(shè)備昂貴、操作復雜且不適于大批量樣品的檢測、需專業(yè)人員進行操作等缺點。免疫化學分析法的應(yīng)用開辟了黃曲霉毒素b1檢測的新領(lǐng)域,目前常用的方法有放射免疫分析法、熒光免疫分析法和酶聯(lián)免疫分析法等。其中,放射免疫分析雖然高靈敏、高特異,但存在有效期短、具有放射性污染的缺點;熒光免疫分析法雖然特異性強、敏感性高、速度快,但非特異性染色問題尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性不足,程序也比較復雜;酶聯(lián)免疫分析法是70年代出現(xiàn)的新的免疫測定技術(shù),其原理是抗原(或抗體)吸附于載體上的免疫吸附劑和用酶標記的抗體(或抗原)與標本中的待測物(抗原或抗體)起特異的免疫學反應(yīng),然后加入酶底物進行顯色反應(yīng),通過顏色的深淺來判斷樣品中待測物的含量,雖然靈敏度高、特異性強,但存在內(nèi)源性酶干擾、終止液為具有腐蝕性的硫酸、底物大部分有毒或為致癌物質(zhì)、吸光度的檢測易受到劃痕等多種外在因素的影響等缺點?;瘜W發(fā)光免疫分析法是在抗原抗體特異性結(jié)合的基礎(chǔ)上,依據(jù)化學發(fā)光檢測體系中待測物濃度與體系的化學發(fā)光強度在一定條件下呈線性定量關(guān)系的原理,利用儀器對體系化學發(fā)光強度進行檢測,從而確定待測物含量的一種痕量分析方法。吖啶酯是一類良好的熒光試劑,發(fā)光效率高,光猝滅效應(yīng)小,反應(yīng)條件溫和,不受連接臂長短的影響,近年來受到免疫化學工作者的廣泛關(guān)注。吖啶酯可以通過標記抗原、抗體和dna等生物大分子,實現(xiàn)化學發(fā)光免疫分析。化學發(fā)光免疫分析法因靈敏度高、線性動力學范圍寬、光信號持續(xù)時間長、分析方法簡便快捷、結(jié)果穩(wěn)定、誤差小、安全性好及使用期長等優(yōu)點,近年來在食品、臨床、獸醫(yī)、生命科學、環(huán)境等領(lǐng)域起到重要作用,是快速檢測食品、飼料中微量毒素殘留的重要手段。黃曲霉毒素具有很強的毒性和致癌性。黃曲霉毒素是微生物產(chǎn)生的,不像三聚氰胺屬于惡意添加。黃曲霉毒素是脂溶性的,如果牛飼料中存在黃曲霉毒素,牛肉中含量不會很高。但內(nèi)臟特別是肝臟中含量會高。黃曲霉毒素非常耐熱,加熱到280°都不會被破壞,所以米粉中只要含有,就不會被去除。紫外線只能少量破壞。從而,這導致在米粉中可能會含有黃曲霉毒素,由于嬰兒在成長時期,幾乎都會選擇一定量的米粉喂養(yǎng),這便需要對嬰兒米粉(或者其他食品)進行黃曲霉毒素b1的檢測,根據(jù)《gb10765-2010食品安全國家標準嬰兒配方食品》中規(guī)定:黃曲霉毒素m1或黃曲霉毒素b1≤0.5μg/kg。目前,雖然針對黃曲霉毒素b1的檢測方法及檢測試劑盒的產(chǎn)品也有不少,但這些檢測產(chǎn)品檢出限較高,應(yīng)用于常規(guī)的檢測,對于嬰兒食品中的黃曲霉毒素b1的檢測,難以達到效果,即使有一些較為精密的檢測產(chǎn)品,但檢測成本高,一般的,因此,需要提供一種方便快速同時檢出限相對較低(滿足嬰兒食品中的黃曲霉毒素b1的檢測)的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素:為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷,本發(fā)明提供了一種更加快速、靈敏的afb1含量檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素b1的方法,包括以下步驟:(1)樣品前處理:將嬰兒米粉與水按照5%稀釋為樣品液,37℃保濕封閉,備用;(2)制備黃曲霉毒素b1抗原afb1-bsa:用黃曲霉毒素b1(afb1)與羧甲基羥胺半鹽酸鹽在吡啶中反應(yīng)生成黃曲霉毒素b1肟(afb1o),再用活性酯法將afb1o與載體蛋白偶聯(lián)合成完全抗原。采用該方法,afb1的肟化率和afb1o的利用率均較高。(3)吖啶酯標記的黃曲霉毒素抗原afb1-bsa-ae的制備:稱取吖啶酯酸1mg溶解于200uln,n-二甲基甲酰胺中,取該溶液50μl緩慢滴入250μl3.5mg/ml的afb1-bsa溶液中,并加入40μl0.1mol/lpbs,于25℃避光、150r/min反應(yīng)過夜,反應(yīng)結(jié)束后,用蒸餾水4℃透析2d,備用。(4)建立標準曲線:用二抗包被2條化學發(fā)光板,37℃溫育2h;洗板3次,每孔加入350μl蒸餾水,37℃保濕封閉1.5h;洗板3次,每孔加入等量afb1單克隆抗體,37℃溫育45min;加入濃度分別為0、0.02、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的afb1標準品各50μl和經(jīng)稀釋的afb1-bsa-ae各50μl,混勻,空白孔加入100μlpbs,37℃恒溫45min;洗板4次,每孔加入tritonx-100吖啶酯啟動劑100μl,然后通過化學發(fā)光儀加入啟動劑ctab100μl,邊加邊測,共測定10次,取平均值;計算各濃度的結(jié)合率,制作標準曲線。(5)加樣進行免疫反應(yīng)測定:用二抗進行包被,37℃溫育2h;洗板3次,每孔加入350μl樣品液,37℃保濕封閉1.5h;洗板3次,加入afb1單克隆抗體4μg/ml進行競爭性化學發(fā)光檢測。(6)讀值定量:根據(jù)檢測的結(jié)果對比標準曲線獲得黃曲霉毒素b1的含量。進一步,制作標準曲線時,結(jié)合率(%)=b/b0×100%,其中b0為不加afb1的發(fā)光值,b為加afb1的發(fā)光值。進一步,制作標準曲線時,每孔按照1∶1800加入afb1單克隆抗體100μl,并按照1∶500稀釋afb1-bsa-ae。進一步,在步驟(4)和步驟(5)中,采用15μg/ml兔抗鼠igg二抗進行包被。發(fā)明提供了一種化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素b1的方法,與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有更加快速、靈敏的效果:本申請的所述檢測的線性范圍為0.1~5.0ng/ml,回收率為75%~115%,變異系數(shù)為0.36%~1.20%,能靈敏準確地檢測樣品中的afb1含量。上述方法的檢出限能夠滿足嬰兒食品的黃曲霉毒素b1的檢測。附圖說明圖1為吖啶酯化學發(fā)光法檢測afb1方法的標準曲線。具體實施方式以下所舉實例只用于解釋本發(fā)明,并非用于限定本發(fā)明的保護范圍。實施例1一種化學發(fā)光免疫檢測嬰兒米粉中黃曲霉毒素b1的方法,包括以下步驟:(1)樣品前處理:將嬰兒米粉與水按照5%稀釋為樣品液,,37℃保濕封閉,備用;(2)制備黃曲霉毒素b1抗原afb1-bsa:用黃曲霉毒素b1(afb1)與羧甲基羥胺半鹽酸鹽在吡啶中反應(yīng)生成黃曲霉毒素b1肟(afb1o),再用活性酯法將afb1o與載體蛋白偶聯(lián)合成完全抗原。具體的,包括以下過程:a.黃曲霉毒素b1肟(afb10)的制備:取一定量afb1溶于甲醇:吡啶(1:1)溶液中,加入羧甲基羥胺半鹽酸鹽,70℃下攪拌作用5h。反應(yīng)過程中每隔30min取反應(yīng)液做薄層層析(tlc),監(jiān)測afb1o合成反應(yīng)進程。用適量甲醇溶解afb1o,紫外分光光度計進行掃描,測定最大吸收峰處的光吸收值,計算afb-和afb-o濃度。b.afb10與戴體蛋白的連接:用dmf溶解afb1o,加入dcc和nhs,室溫磁力攪拌下反應(yīng)4h。取適量bsa(或hsa)溶解于碳酸鹽緩沖液中,磁力攪拌下將afb1o溶液逐滴加入蛋白溶液中,室溫下反應(yīng)2h。反應(yīng)溶液用pbs透析。afb1的肟化率和afb1o的利用率較高(經(jīng)檢測,afb1的肟化率和afb1o的利用率分別為85%和56%),合成的完全抗原經(jīng)檢驗具有較好的免疫效果,保存360d后抗原效價沒有明顯變化。并且,選擇合成相對低結(jié)合比的完全抗原,不僅可以降低生產(chǎn)成本,而且有助于提高抗體的選擇和親和力。(3)吖啶酯標記的黃曲霉毒素抗原afb1-bsa-ae的制備:稱取吖啶酯酸1mg溶解于200uln,n-二甲基甲酰胺中,取該溶液50μl緩慢滴入250μl3.5mg/ml的afb1-bsa溶液中,并加入40μl0.1mol/lpbs,于25℃避光、150r/min反應(yīng)過夜,反應(yīng)結(jié)束后,用蒸餾水4℃透析2d,備用。(4)建立標準曲線:采用15μg/ml兔抗鼠igg二抗包被2條化學發(fā)光板,37℃溫育2h;洗板3次,每孔加入350μl蒸餾水,37℃保濕封閉1.5h;洗板3次,每孔按照1∶1800加入afb1單克隆抗體100μl,37℃溫育45min;加入濃度分別為0、0.02、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的afb1標準品各50μl和按照1∶500稀釋的afb1-bsa-ae各50μl,混勻,空白孔加入100μlpbs,37℃恒溫45min;洗板4次,每孔加入tritonx-100吖啶酯啟動劑100μl,然后通過化學發(fā)光儀加入啟動劑ctab100μl,邊加邊測,共測定10次,取平均值;計算各濃度的結(jié)合率,制作標準曲線。制作標準曲線時,結(jié)合率(%)=b/b0×100%,其中b0為不加afb1的發(fā)光值,b為加afb1的發(fā)光值。標準曲線如圖1所示。(5)加樣進行免疫反應(yīng)測定:采用15μg/ml兔抗鼠igg二抗進行包被,37℃溫育2h;洗板3次,每孔加入350μl樣品液,37℃保濕封閉1.5h;洗板3次,加入afb1單克隆抗體4μg/ml進行競爭性化學發(fā)光檢測。(6)讀值定量:根據(jù)檢測的結(jié)果對比標準曲線獲得黃曲霉毒素b1的含量。實施例2步驟同實施例1,樣品來源不同。檢測結(jié)果:實施例測得afb1含量(ng/ml)實施例10.18實施例20.32當前第1頁12
當前第1頁1 2 
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1