一種功能化磁珠分離-酶聯(lián)適配體檢測食品中土霉素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品中土霉素的檢測方法，屬于食品安全分析技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 土霉素（Oxytetracycline，0TC),別名5-羥基四環(huán)素，地霉素，地靈霉素，氧四環(huán) 素等，是一種廣譜抗菌藥物，常作為牛、豬、家禽、魚等動物疾病的預(yù)防和感染的治療用藥。 然而由于濫用及不遵守休藥期規(guī)定等原因，造成其在畜產(chǎn)品中的殘留，不僅給人類健康帶 來嚴(yán)重危害，也給環(huán)境造成了嚴(yán)重威脅。世界糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織、歐盟及我國政府對 食品中土霉素的殘留限量作了規(guī)定。
[0003] 目前,土霉素檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC)、毛細(xì)管電泳法（CE)、液相 色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS)、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)等。但儀器分析方法設(shè)備昂貴，前處理 繁瑣?？焖贆z測方法通常采用抗原抗體特異相互作用識別模式，但由于受到抗體易失活、制 備依賴免疫動物和細(xì)胞、繁瑣費(fèi)時、一些小分子物質(zhì)難以產(chǎn)生特異性抗體等因素的影響，在 一定程度上限制了抗體在快速檢測技術(shù)中的應(yīng)用。
[0004] 核酸適配體(Aptamer)技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了抗體在相關(guān)檢測領(lǐng)域中應(yīng)用的不足。 目前已有利用核酸適配子為識別分子應(yīng)用于食品中土霉素檢測的報道。如劉賓(暨南大 學(xué)碩士論文）建立了基于配適體的生物素-親和素酶聯(lián)檢測土霉素的分析方法，但檢測限 (1.58凡）不能滿足土霉素檢測的需要（限量值 ：10〇11^/1^)。1(;[1116七31.(4仙1.01；[111· Acta, 2009，634: 250-254)建立了適配體電化學(xué)傳感器檢測土霉素的分析方法，但適配 體固定步驟相對耗時，且樣品基質(zhì)對電化學(xué)信號易造成干擾。2010年他又利用納米金修飾 的適配體為探針比色檢測土霉素（Biosens· Bioelectron 26: 1644-1649)，但無法精確定 量。2014 年 Kim et al. (Biosens· Bioelectron 51: 426 - 430)基于 ELISA 原理，建立了 牛奶中土霉素的間接酶聯(lián)適配體分析（ic-ELAA)方法，檢測限為12. 3 ng/mL，但方法需要將 OTC - BSA包被于酶標(biāo)板，造成檢測時間較長（>IOh)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、檢測快速、靈敏度高、成本低的功 能化磁珠分離-酶聯(lián)適配體檢測食品中土霉素的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來具體實(shí)現(xiàn)： 一種功能化磁珠分離-酶聯(lián)適配體檢測食品中土霉素的方法，采用核酸適配體-磁納 米粒子復(fù)合物探針，通過HRP-OTC與樣品中的OTC直接競爭結(jié)合磁珠表面的OTC適配體，底 物顯色檢測吸光值變化來定量分析樣品中土霉素含量。
[0007] 其原理是將適配體通過生物素-親和素系統(tǒng)固定于納米磁珠表面，辣根過氧化酶 酶標(biāo)記OTC (HRP-OTC)與樣品中的OTC直接競爭結(jié)合磁珠表面的OTC適配體，通過底物顯 色檢測吸光值變化來定量分析樣品中土霉素含量。檢測原理如圖1所示。
[0008] 核酸適配體-磁納米粒子復(fù)合物探針的制備，采用文獻(xiàn)（Wu SJ, Duan N, Wang ZP, et al. Analyst, 2011, 136, 2306-2314)報道的方法進(jìn)行制備。
[0009] 進(jìn)一步的，所述的核酸適配體-磁納米粒子復(fù)合物探針為生物素修飾的適配體連 接親和素修飾的納米磁珠，即采用化學(xué)共沉淀法制備Fe 3O4納米顆粒，然后利用戊二醛法將 氨基化的納米磁珠與親和素偶聯(lián)。
[0010] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述OTC核酸適配體的5'端修飾了生物素，通過生物素-親和素系 統(tǒng)，同時固定于親和素修飾的納米磁珠表面。
[0011] 作為優(yōu)選方案，上述的功能化磁珠分離-酶聯(lián)適配體檢測食品中土霉素的方法， 包括如下步驟： 1) HRP-OTC與OTC直接競爭結(jié)合固定于納米磁珠表面的OTC適配體： a. 將步驟1)中制得的納米磁珠分散于PBS中，取100 μ L添加到酶標(biāo)板孔中，磁分離， 去上清； b. 每孔中加入20〇μL封閉液，37°C孵育40min，磁分離，PBST洗滌多余的封閉液； c. 然后于每孔中依次加入50 μ L HRP-OTC和50 μ LOTC標(biāo)準(zhǔn)品溶液，37°C孵育40min， 磁分離，PBST洗滌液洗滌； d. 每孔中加入100 μ L TMB底物顯色液，37°C避光反應(yīng)20min ; e. 最后每孔中加入100 μ L終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm測吸光值； 2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按步驟1)的操作步驟對土霉素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，OTC標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次 為0. 5、1、2、5、10、25、50、100 ng/mL，以不同土霉素濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以抑制率B/B。為 縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，Btl=OTC標(biāo)準(zhǔn)品濃度為Ong/mL所對應(yīng)的吸光度； B :OTC標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度所對應(yīng)的吸光度； 3) 將食品樣品提取液代替標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照步驟1)所述步驟進(jìn)行檢測，根據(jù)步驟2)的 標(biāo)準(zhǔn)曲線計算食品樣品中OTC的含量。
[0012] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟1)的步驟a中，核酸適配體-磁納米粒子復(fù)合物探針分 散后的濃度為1.0 mg/mL。
[0013] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述封閉液為0· 1% BSA。
[0014] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述終止液為2. 0 mol/L的H2SO4溶液。
[0015] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算計算IC5tl值為14. 47 ng/mL (IC 5(|值：抑制率為50%所對應(yīng)的 藥物濃度）和檢測限LOD為0. 88ng/mL (L0D :吸收值為Btl-空白對照3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對應(yīng) 的標(biāo)品濃度） 本發(fā)明針對傳統(tǒng)大型儀器不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測、前處理繁瑣、以及免疫分析方法需 要制備抗體的缺點(diǎn)，利用納米磁珠快速分離及有效富集靶物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，適配體的高特異性 和選擇性特點(diǎn)，及酶標(biāo)板的高通量篩選特性，建立了磁珠分離-酶聯(lián)適配體檢測方法，可用 于食品中土霉素殘留的快速(檢測時間：l〇〇min)、高靈敏（L0D :0. 88ng/mL)檢測。與傳統(tǒng)的 ELISA和酶聯(lián)適配體（ELAA)相比，本發(fā)明提高了檢測速度、靈敏度和特異性，降低了檢測成 本。
[0016] 與傳統(tǒng)ELISA和酶聯(lián)適配體（ELAA)相比，優(yōu)點(diǎn)如下： (1)此方法不需要制備抗體，適配體可體外人工合成，制備簡單，節(jié)約勞動力； (2) 檢測成本低于傳統(tǒng)的免疫分析方法； (3) 相對于微孔板，磁納米顆?？沙浞职l(fā)揮比表面積及小尺寸效應(yīng)，提供更多的結(jié)合位 點(diǎn)，提高檢測的特異性； (4) 相對于以微孔板為載體的ELAA分析方法，適配體不需要包被在酶標(biāo)板上，縮短了 分析時間(本發(fā)明檢測時間為lOOmin，以微孔板為載體的ELAA分析方法則需要IOh以上)， 同時適配體修飾磁珠均勻分散于溶液中，加快了識別分子與靶物質(zhì)的結(jié)合速率，使檢測速 度大大提高； (5) 在外加磁場的作用下通過磁分離可實(shí)現(xiàn)樣品一步分離和靶物質(zhì)有效富集，使洗滌 更徹底，降低基質(zhì)干擾，提高了分析方法的信噪比與靈敏度。
【附圖說明】
[0017] 圖1是功能化納米磁珠分離-酶聯(lián)適配體檢測土霉素的原理圖； 圖2是氨基化納米磁珠掃描電鏡圖； 圖3是氨基化納米磁珠紅外表征圖；580 cm-1為Fe-O的伸縮振動，2854、2920和3433 CnT1為C - H和N - H的伸縮振動，1633 cm 4為氨基化納米材料上的N - H的變形振動。
[0018] 圖4是親和素結(jié)合納米磁珠的紫外掃描圖，a.親和素原液吸光值；b.親和素結(jié) 合納米磁珠后的上清液吸光值； 圖5是磁珠分離-酶聯(lián)適配體檢測土霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； 圖6是本發(fā)明與國標(biāo)方法檢測同一樣品中土霉素的相關(guān)性曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用 于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0020] 以下實(shí)施例中所用適配體是根據(jù)文獻(xiàn)報道（Niazi JH.，Lee SJ, Kim YS, et al. Bioorgan· Med. Chem.，2008，16: 1254-1261)，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。 5; -biotin- GGAATTCGCTAGCACGTTGACGCTGGTGCCCGGTTGTGGTGCGAGTGTTGTGTGGATCCGAGCTC CACGTG-3 ; (Mw, 22052. I; Tm, 80.1 ° C) 實(shí)施例1 :牛奶樣品測定 一、核酸適配體-磁納米粒子復(fù)合物探針的制備 核酸適配體-磁納米粒子復(fù)合物探針的制備采用文獻(xiàn)SJ, Duan N, Wang ZP, et al. Analyst, 2011, 136, 2306-2314)報道的方法進(jìn)行制備。
[0021] 1.氨基化納米磁珠的制備：在30mL乙二醇中加入6. 5g的1,6-己二胺