本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是檢測(cè)大米中敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
敵敵畏為廣譜性殺蟲(chóng)、殺螨劑，用來(lái)防治棉蚜等農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，也用來(lái)殺死蚊，蠅等。具有觸殺、胃毒和熏蒸作用。觸殺作用比敵百蟲(chóng)效果好，對(duì)害蟲(chóng)擊倒力強(qiáng)而快。純品為無(wú)色至琥珀色液體，微帶芳香味。制劑為淺黃色至黃棕色油狀液體，在水溶液中緩慢分解，遇堿分解加快，對(duì)熱穩(wěn)定，對(duì)鐵有腐蝕性。對(duì)人畜中毒，對(duì)魚(yú)類(lèi)毒性較高，對(duì)蜜蜂劇毒。因此定期對(duì)敵敵畏殘留進(jìn)行檢測(cè)成為許多國(guó)家的監(jiān)控的必要手段。
酶聯(lián)免疫吸附法是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測(cè)方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)行業(yè)。本發(fā)明旨在建立一種檢測(cè)敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服色譜法的不足，本發(fā)明提供一種檢測(cè)敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法。該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的快速檢測(cè)。
本發(fā)明檢測(cè)敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括酶標(biāo)板、敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品、敵敵畏抗體工作液、敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。
本發(fā)明檢測(cè)敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備，包括以下步驟：酶標(biāo)板的制備、敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品的制備、敵敵畏抗體工作液的制備、敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。
其進(jìn)一步特征在于：所述的酶標(biāo)板經(jīng)由敵敵畏抗原包被制備，具體步驟是將敵敵畏半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將敵敵畏包被抗原稀釋成1：40000比例，100 μL/孔，37℃避光孵育2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，加入經(jīng)稀釋的濃縮洗滌液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，甩掉封閉液直接拍干，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封于4℃條件下保存。
敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
所述敵敵畏抗體工作液是采用敵敵畏人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：60000比例制備。
所述敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1：2000比例，所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過(guò)氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2 mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5% 吐溫-20，0.1 mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
檢測(cè)敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，基于抗原抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，該方法包括以下步驟：
(1)預(yù)處理待測(cè)樣品，即將待測(cè)試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測(cè)樣品，并將其復(fù)溶于樣品稀釋液中；
(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30 min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被有敵敵畏抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μL/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液，50 μL/孔，然后加入敵敵畏抗體工作液，50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min；
(4)小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液260 μL/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)；
(5)加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15～20 min；
(6)加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長(zhǎng)450/630 nm檢測(cè)，測(cè)定每孔吸光度值（請(qǐng)?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）；
(7)以的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中敵敵畏的含量。
本發(fā)明檢測(cè)敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法的測(cè)定原理：樣品中的敵敵畏與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競(jìng)爭(zhēng)抗體，加入酶標(biāo)二抗，與抗體反應(yīng)，通過(guò)酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來(lái)判斷樣品中敵敵畏的含量。如果樣品中的敵敵畏含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏、準(zhǔn)確、快速，適用于大批量樣品的快速檢測(cè)。
具體實(shí)施方式
敵敵畏蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備：
采用琥珀酸酐法得到帶羧基的敵敵畏半抗原衍生物，之后取0.05 mmol與載體蛋白BSA按10：1的結(jié)合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入0.15 mmol碳二亞胺，攪拌置室溫反應(yīng)24 h，最后于0.2 mol/L pH 7.6的PBS緩沖液中透析兩天，除去未反應(yīng)的半抗原，將得到的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
敵敵畏抗體的制備：
選用健康成年純種BALA/C小鼠，取與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備的免疫抗原50μg與等量完全弗氏佐劑混合采用腹腔注射進(jìn)行初次免疫，之后每隔3周用相同劑量免疫抗原加等量不完全弗氏佐劑采用腹腔注射進(jìn)行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾靜脈采血測(cè)定抗血清效價(jià)至一定滴度后，用相同劑量不加佐劑進(jìn)行末次免疫，3天后取脾制備脾細(xì)胞懸浮液與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行克隆化，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行凍存，用于腹水制備，先腹腔注射0.5 ml液體石蠟于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7-10天后可產(chǎn)生腹水，待腹水盡可能多時(shí)用注射器抽取腹水，反復(fù)收集數(shù)次，4000 rpm離心15 min，收集上清，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水對(duì)單克隆抗體進(jìn)行純化，冷凍干燥得凍干粉后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
制備包被有敵敵畏包被抗原的酶標(biāo)板：
包被抗原是將敵敵畏半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到的，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將敵敵畏抗原稀釋成1:40000比例，100 μL/孔，37℃放置2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μL/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μL/孔，37℃放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4℃下保存。
敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg。
敵敵畏抗體工作液的制備：采用敵敵畏人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：60000比例制備。
敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1：2000比例，底物液A為含有0.5 mmol/L的過(guò)氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，終止液為2 mol/L的硫酸，濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5% 吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
基于上述制備的試劑，本發(fā)明用于檢測(cè)敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒包括如下材料：
(1)96孔酶標(biāo)板×1塊；
(2)標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：(1mL/瓶) 0 mg/kg、0.1mg/kg、0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg、8.1 mg/kg；
(3)抗體工作液 7 mL；
(4)酶標(biāo)二抗工作液 7 mL；
(5)底物液A 7 mL；
(6)底物液B 7 mL；
(7)終止液 7 mL；
(8)10×濃縮稀釋液 40 mL；
(9)10×濃縮洗滌液 40 mL；
本發(fā)明的試劑盒用于檢測(cè)農(nóng)作物樣本中敵敵畏殘留量時(shí)，通過(guò)以下步驟實(shí)施：樣品預(yù)處理、用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)、分析結(jié)果。
(1)用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)待測(cè)樣品中敵敵畏殘留量
取包被有敵敵畏抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μL/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中；加入酶標(biāo)二抗工作液，50 μL/孔，然后加入敵敵畏抗體工作液，50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min；小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液300 μL/孔，充分洗滌4次，浸泡15-30 s，用吸水紙拍干；加入底物液A 50 μL/孔，底物液B 50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15 min；加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長(zhǎng)450/630 nm檢測(cè)，測(cè)定每孔吸光度值（請(qǐng)?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）；對(duì)比待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值大小，定量分析待測(cè)樣品中敵敵畏殘留量。
(2)分析結(jié)果
百分吸光度值的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值(%) ＝B/B0×100%
其中B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0—0 ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。
以敵敵畏的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。將樣本的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中敵敵畏的實(shí)際濃度。