一類熒光試劑，制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 發(fā)明涉及到一類熒光試劑及其制備方法，并將其應(yīng)用于血清蛋白濃度及鑒別其是 否變性上，屬于生物大分子含量及結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] B0P頂-NR在水中的熒光強(qiáng)度非常微弱，一旦進(jìn)入到血清蛋白（SerumAlbumin，SA) 結(jié)構(gòu)中，就會(huì)發(fā)出較為強(qiáng)烈的綠色熒光，且熒光強(qiáng)度與SA濃度之間存在很好的劑量關(guān)系， 可以作為一種靈敏的SA識(shí)別探針試劑。當(dāng)SA完全變性，化合物的熒光發(fā)射譜發(fā)生明顯變 化，波長(zhǎng)藍(lán)移達(dá)到15nm以上，峰型也會(huì)發(fā)生明顯變化，可以以此鑒別SA的變性，并監(jiān)測(cè)其變 性過程。此類方法屬首次報(bào)道，鑒別方法較為直觀，具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高和成本低廉等 特點(diǎn)，值得推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種熒光試劑，該試劑的結(jié)構(gòu)式為：
[0004]
封己為 B0P頂-NR。
[0005] 所述的熒光試劑B0P頂-NR的結(jié)構(gòu)以核磁共振（NMR)譜鑒定： 莊匪尺(4001抱，〇)(：13):5 8.35((1，了 = 5.6Hz，1H)，8.05 (t，J = 7.8Hz，1H)，8.00 (d，J = 8. 0Hz, 1H), 7. 54 (m, 4H), 7. 34 (t, J = 6. 6Hz, 1H), 6. 72 (m, 4H), 2. 98 (s, 6H), 2. 96 (s, 6H). C13NMR(100MHz, CDC13) : S 148. 91，148. 59, 144. 79, 144. 08, 143. 27, 140. 00, 133. 35, 128. 51 ，127. 88, 122. 49, 120. 76, 117. 90, 116. 28, 111. 30, 111. 10, 39. 54, 39. 29。產(chǎn)品純度 95% 以 上，產(chǎn)率20%。
[0006] 本發(fā)明還提供一種熒光試劑的合成方法，具體為：
[0007] 1)稱取取代氨基苯甲醛，2-氰基吡啶，以及醋酸銨入微波反應(yīng)器的三頸瓶中，溫 度設(shè)定為150~200°C，半小時(shí)后形成棕色溶液；
[0008] 2)將該棕色溶液倒入冰水，加氫氧化鈉中和，用碳酸鈉檢測(cè)，接著用乙酸乙酯做萃 取劑，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，硅膠柱色譜分離，得橙色固體；
[0009] 3)在充氮?dú)鈼l件下，將上述橙色固體，三乙胺，加入二氯甲烷溶劑中，在冰鹽浴滴 加三氟化硼乙醚后再在室溫條件下攪拌過夜，母液水洗，二氯乙烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥， 濃縮，硅膠柱色譜分離，得到紅棕色粉末狀固體即為熒光試劑，標(biāo)記為B0P頂-NR，具體合成 路線為：
[0010]
b
[0011] 上述的步驟1)中，對(duì)（N，N-二甲基）苯甲醛、2-氰基吡啶、醋酸銨的摩爾比為1 : 2-3 :4-7 ;步驟2)中，橙色固體與三氟化硼的摩爾比為1 :4-6。
[0012] 進(jìn)一步優(yōu)選為步驟1)中，對(duì)取代氨基苯甲醛、2-氰基吡啶、醋酸銨的摩爾比為1 : 2. 5 :5 ;步驟2)中，橙色固體與三氟化硼的摩爾比為1 :5. 5。
[0013] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單，靈敏度高和成本低廉的熒光探針法測(cè) 定血清蛋白（SA)濃度及鑒別其是否變性的方法。
[0014] 所述的血清蛋白變性包括高溫變性、化學(xué)變性、超聲變性等一切物理及化學(xué)因素 誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。
[0015] 具體檢測(cè)方法如下：
[0016] (1)測(cè)定溶液的配制
[0017] 稱量B0P頂-NR，加入1，4-二氧六環(huán)助溶，再加入10mL磷酸鹽緩沖液，得到 2. 0 X 10 6mol/L的溶液，用保鮮膜和錫箱紙包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存，同時(shí)，將正 常或變性的牛血清蛋白，以磷酸鹽緩沖液配制成1. 0X 10 4mol/L溶液備用；
[0018] (2)熒光測(cè)定方法
[0019] 取B0P頂-NR溶液加入石英熒光比色皿中，加入血清蛋白儲(chǔ)備液10~100 y L，在熒 光分光光度計(jì)上設(shè)置365nm為激發(fā)波長(zhǎng)，狹縫均調(diào)為10nm，在370~700nm范圍進(jìn)行掃描， 得到B0PIM-NR在SA存在時(shí)的熒光光譜；
[0020] (3)定量測(cè)定血清蛋白含量
[0021] 通過B0P頂-NR在不同濃度牛血清蛋白存在時(shí)的熒光光譜，固定發(fā)射波長(zhǎng)485nm， 讀取熒光強(qiáng)度，應(yīng)用以下方稈：
[0022]
[0023] 式中：1。、1和^分別為沒有SA存在、有SA存在以及SA的濃度無(wú)限大時(shí)B0P頂?shù)?熒光強(qiáng)度。以1AI-U對(duì)1/[SA]作圖，建立得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定B0P頂-NR在未知樣品中 的熒光強(qiáng)度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到SA含量。
[0024] (4) SA變性鑒別方法
[0025] 根據(jù)熒光試劑B0P頂-NR的熒光發(fā)射波長(zhǎng)和峰型進(jìn)行鑒別，在正常牛血清蛋白中， BOP頂-NR的熒光發(fā)射波長(zhǎng)在較長(zhǎng)波長(zhǎng)（約485nm)，峰型對(duì)稱；當(dāng)血清蛋白變性后，化合物在 其中的熒光發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移20nm，至465nm，峰型不再對(duì)稱。
[0026] 熒光測(cè)定時(shí)溶液配制緩沖液所用水均為二次蒸餾水或更高純度的水。
[0027] 所述的磷酸鹽緩沖液為由NaCl 8g，KCl 0.28，腿2?040 . 248，似2冊(cè)041.448(如果是 Na 2HP04 ? 12H20,則3. 63g)溶于1000mL水中配制而成。
[0028] 本發(fā)明使用的熒光試劑合成路線簡(jiǎn)單，原料成本低廉，反應(yīng)條件相對(duì)溫和，產(chǎn)率較 高，產(chǎn)物分離方法較為簡(jiǎn)單，產(chǎn)物純度可達(dá)到99 %以上，試劑存放條件溫和，產(chǎn)品穩(wěn)定，不宜 光解或分解。
[0029] 本發(fā)明使用的熒光試劑合成工藝條件易控制，易實(shí)現(xiàn)路線放大或工業(yè)化，設(shè)備要 求不苛刻，反應(yīng)產(chǎn)生廢棄物少，污染小，廢棄物易處理。
[0030] 采用本類熒光試劑容易實(shí)現(xiàn)在水體系中進(jìn)行SA定量測(cè)定，而現(xiàn)行的熒光試劑大 多水溶性較差，難于實(shí)現(xiàn)；測(cè)量的機(jī)制主要是基于此類化合物具有易扭轉(zhuǎn)的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn) 移特性，進(jìn)入到血清蛋白的疏水腔中，化合物結(jié)構(gòu)和熒光性質(zhì)會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物 大分子的特性識(shí)別。
[0031] 用于定量測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，適用于低含量SA的定量測(cè)定（10 6M以 下）。對(duì)SA變性的鑒別方法直觀，簡(jiǎn)潔，直接通過熒光光譜可以得出正確結(jié)論。從文獻(xiàn)調(diào)研 結(jié)果來(lái)看，本鑒別方法是目前最直觀的SA變性鑒別方式。
【附圖說明】
[0032] 圖1為熒光試劑在不同介質(zhì)中的熒光圖，其中，圖1-1為水體系中；圖1-2為在BSA 體系中。
[0033] 圖2為B0P頂-NR在不同濃度BSA中的熒光光譜。CBSA從1到10的濃度依次為 1 y M，2 y M，3 y M，4 y M，5 y M，6 y M，7 y M，8 y M，9 y M, 10 y M〇
[0034] 圖3為BSA定量測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0035] 圖4. B0P頂-NR在正常BSA與熱變性BSA的熒光圖譜，其中，a為正常BSA的熒光 光譜圖，b為熱變性的熒光光譜圖。
[0036] 圖5.正常BSA與超聲破碎后的BSA的熒光圖譜，a為正常BSA的熒光光譜圖，b為 超聲破碎后的BSA的熒光圖譜。
[0037] 圖6. B0P頂-NR在正常BSA與尿素致變性的BSA的熒光圖譜，其中，a為正常BSA的 熒光光譜圖，b為加尿素后的BSA的熒光圖譜。
[0038] 圖7熒光試劑B0P頂-NR在BSA體系中溫育溫育不同時(shí)間時(shí)熒光發(fā)射波長(zhǎng)
[0039] 圖8 B0P頂-NR在經(jīng)不同方式處理的BSA中的熒光發(fā)射波長(zhǎng)變化
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下述試驗(yàn)和實(shí)施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。
[0041] 實(shí)施例1
[0042] 由N，N_二甲基苯甲醛，氰基吡啶，三氟化硼等為主要原料經(jīng)兩步反應(yīng)合成得到。 合成步驟：
[0043]稱量對(duì)二甲基苯甲醛1. 5g(0.0 lmol)，2_氰基吡啶2. 6g(0. 025mol)，以及醋酸銨 3. 9g(0. 05mol)加入微波反應(yīng)器的三頸瓶中，溫度設(shè)定為170°C，半小時(shí)后形成棕色溶液。 母液倒入冰水，加氫氧化鈉中和，用碳酸鈉檢測(cè)，接著用乙酸乙酯做萃取劑，無(wú)水硫酸鈉干 燥，濃縮，硅膠柱色譜分離，得橙色固體。在充氮?dú)鈼l件下，稱量橙色固體1. 53g(4mmol)，三 乙胺（6ml)，加入二氯甲烷（25ml)做溶劑，冰鹽浴滴加3. 2g (2. 8ml，22mmol)三氟化硼乙醚， 在室溫條件下攪拌過夜。母液水洗，二氯乙烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，硅膠柱色譜分 離，得到紅棕色粉末狀固體BOP頂-NR。
[0044] (1) B0P頂-NR定量測(cè)定BSA含量，其方法如下：
[0045] 稱量B0P頂-NR0. 00862g，準(zhǔn)確加入1，4-二氧六環(huán)0. lmL和10mL磷酸鹽緩沖液 (PBS，pH7. 2~7. 4)，得到2. 0X 10 6m〇l/L的溶液，用保鮮膜和錫箱紙包裹好，密封，避光， 置于冰箱中保存。同時(shí)，將牛血清蛋白（BSA)以磷酸鹽緩沖液配制成1.0X10 4m〇l/L溶液 備用。
[0046] 取B0P頂-NR溶液2mL加入石英熒光比色皿中，依次加入BSA溶液10~100 y L， 在熒光分光光度計(jì)上設(shè)置365nm為激發(fā)波長(zhǎng)，激發(fā)和發(fā)射狹縫均調(diào)為10nm，在370~700nm 范圍進(jìn)行掃描，得到B0PIM-NR在不同濃度BSA存在時(shí)的熒光光譜，見圖2。
[0047] 讀取B0P頂-NR在不同濃度BSA存在時(shí)、發(fā)射波長(zhǎng)485nm的熒光強(qiáng)度，應(yīng)用以下方 程：