一種鉻-極低密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重金屬離子的免疫學(xué)檢測，具體涉及一種鉻-極低密度脂蛋白螯合物 及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合所形成的一種脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù) 合物，按密度分為高密度脂蛋白（high density lipoprotein，簡稱HDL)、中間密度脂 蛋白（intermediate density lipoprotein，簡稱 IDL)、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，簡稱 LDL)、極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,簡稱 VLDL)、 乳糜顆粒（chylomicron，CM)。血液中大約百分之三十的膽固醇是通過HDL從組織細(xì)胞中 運(yùn)輸?shù)礁闻K轉(zhuǎn)化為膽汁酸或通過膽汁排出體外的。血液中約70%的膽固醇由LDL和VLDL 所攜帶，肝臟中產(chǎn)生的內(nèi)源性甘油三酯（triglyceride，TG)也主要依靠 VLDL運(yùn)輸至肝外。 VLDL的增多與高脂血癥、脂代謝紊亂息息相關(guān)，而血脂異常又是多種疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn) 因素，因而VLDL含量水平的穩(wěn)定對(duì)于人體各方面機(jī)能功能的穩(wěn)定起著重要作用。
[0003] VLDL含量水平及結(jié)構(gòu)功能的穩(wěn)定對(duì)機(jī)體意義重大。其含量過高與脂肪肝、脂代謝 紊亂、心血管疾病、腎臟功能損傷等息息相關(guān)。定量檢測VLDL可以用于這些疾病的早期診 斷以及治療效果監(jiān)測，甚至作為預(yù)后好壞的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。而對(duì)于營養(yǎng)不良、慢性貧血、肝 功能受損者等患者，血清VLDL含量也會(huì)下降，定量檢測VLDL也可用于這些疾病的早期診 斷、治療效果監(jiān)測以及作為預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一。
[0004] 絡(luò)（chromium，Cr)是元素周期表VI族中的一種過渡金屬，其質(zhì)地堅(jiān)硬，表面具有 光澤，有較高的熔點(diǎn)，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，一個(gè)世紀(jì)以來被廣泛應(yīng)用，每年 全球鉻生產(chǎn)量高達(dá)107噸，因而鉻是一種名副其實(shí)的重要金屬污染物。目前，鉻廣泛應(yīng)用于 電鍍、鞣革、顏料、油漆、合金、印染等各個(gè)方面，與人們的生活息息相關(guān)，但是同樣也對(duì)人 類的身體健康產(chǎn)生巨大影響。
[0005] 自然界中鉻主要以三價(jià)和六價(jià)的形式存在，而一般認(rèn)為，三價(jià)鉻（Cr3+)是人類所 需的微量元素，而六價(jià)鉻（Cr6+)才是明顯的毒性物質(zhì)。由于六價(jià)鉻易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞， 而且可以通過一系列反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性及基因毒性，因而普遍認(rèn)為六價(jià)鉻的毒性 高于三價(jià)鉻，達(dá)10 -100倍。學(xué)者認(rèn)為當(dāng)水中的六價(jià)鉻含量超過〇.〇5mg/L即是有毒的。六 價(jià)鉻可以通過皮膚接觸、食物攝入、飲用水飲入、呼吸道吸入等途徑進(jìn)入人體，對(duì)于職業(yè)性 暴露人群主要是通過呼吸道吸入六價(jià)鉻灰塵，而對(duì)于普通人群則是通過飲入污染水源、食 入被污染的食物、吸入等方式攝入六價(jià)鉻。六價(jià)鉻進(jìn)入體內(nèi)后，可以引發(fā)氧化應(yīng)激、顯色體 畸變、細(xì)胞凋亡、多種DNA損傷（包括單鏈斷裂、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA-氨基酸交聯(lián)、Cr-DNA 配合物形成等），從而造成機(jī)體多處組織、器官、系統(tǒng)損傷。
[0006] 如前所述，鉻與多種蛋白質(zhì)之間關(guān)系密切，可以與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制多種蛋白 酶的活性。隨著對(duì)鉻毒性研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到鉻與蛋白的相互作用在其致毒過程 中扮演著重要的角色，被認(rèn)為是了解鉻的毒性機(jī)理的關(guān)鍵所在，因此，對(duì)鉻和蛋白質(zhì)相互作 用的研究就顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關(guān)于鉻與蛋白質(zhì)作用的機(jī)理僅是冰山一角，還有很多蛋 白質(zhì)與鉻之間的關(guān)系還不清楚，因而加強(qiáng)對(duì)于鉻與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。
[0007] 關(guān)于鉻中毒，特別是慢性鉻中毒的評(píng)價(jià)，通過檢測血鉻含量也不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)人體 內(nèi)的循環(huán)鉻含量，無法進(jìn)一步評(píng)估鉻對(duì)于機(jī)體功能的損傷程度，而隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā) 展，鉻與人體的關(guān)系也日益緊密，因而尋找一種可以從免疫功能角度評(píng)價(jià)鉻中毒，特別是慢 性鉻中毒對(duì)于機(jī)體的損害程度的評(píng)價(jià)方式日益重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)鉻污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鉻-極低密度脂蛋白螯合物 及其制備方法，并建立鉻-極低密度脂蛋白螯合物的定性、定量檢測方法，以便定量檢測 鉻-極低密度脂蛋白螯合物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉻污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個(gè)地區(qū)人 群血清中鉻-極低密度脂蛋白螯合物，可以間接反映這個(gè)地區(qū)人群受鉻污染的情況，從而 間接反映這個(gè)地區(qū)鉻污染程度。
[0009] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種鉻-極低密度脂蛋白螯合 物，該鉻-極低密度脂蛋白螯合物是鉻離子與極低密度脂蛋白通過巰基或/和半胱氨酸殘 基螯合而成。
[0010] 本發(fā)明還提供一種上述的鉻-極低密度脂蛋白螯合物的制備方法，即體外合成 法，包括以下步驟：
[0011] A)鉻-極低密度脂蛋白螯合物的合成：在提純?cè)从谌梭w的極低密度脂蛋白或按照 生物學(xué)方法重組的極低密度脂蛋白中加入鉻離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0012] B)鉻-極低密度脂蛋白螯合物純化：采用免疫親和層析法，去除步驟A)反應(yīng)溶液 中未反應(yīng)的極低密度脂蛋白、特異性抗體和鉻離子，即得鉻-極低密度脂蛋白螯合物。
[0013] 作為優(yōu)選，所述步驟B)中具體包括以下步驟：
[0014] (1)溶解樣品：將上述步驟A)的鉻-極低密度脂蛋白螯合物溶解于生理鹽水中， 得鉻-極低密度脂蛋白螯合物的溶液；
[0015] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與極低 密度脂蛋白特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0016] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)的溶液，然后上柱，使極低 密度脂蛋白與填料特異性結(jié)合；
[0017] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lOmol/L的 Na2HP0j§液進(jìn)行洗脫；
[0018] (5)收集：收集步驟（4)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0019] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0020] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鉻特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0021] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；
[0022] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的 Na2HP0j§液進(jìn)行洗脫；
[0023] (10)收集：收集步驟（9)的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復(fù)原；
[0024] (11)透析：將步驟（10)中的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次后， 4°C透析過夜，收集樣本，即得鉻-極低密度脂蛋白螯合物。
[0025] 作為優(yōu)選，上述鉻-極低密度脂蛋白螯合物的制備方法，還包括以下對(duì)鉻-極低密 度脂蛋白螯合物的鑒定步驟，具體包括以下步驟：
[0026] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0027] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鉻-極低密度脂蛋白螯合物，加入上樣緩 沖液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0028] (3)電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0029] (4):在膠床上找出含鉻的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出，將蛋白條帶溶解，然后再 采用ICP-MS或AAS檢測是否含有鉻以及檢測鉻的含量。
[0030] 本發(fā)明還提供一種如上述的鉻-極低密度脂蛋白螯合物在制備檢測人體內(nèi)鉻-極 低密度脂蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鉻-極低密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的 試劑盒。
[0032] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液包括捕獲極低密度脂蛋白的物質(zhì)或 捕獲金屬鉻的物質(zhì)。
[0033] 本發(fā)明還提供一種定量檢測鉻-極低密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上 述的鉻-極低密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測：酶聯(lián)免 疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純 鉻-極低密度脂蛋白螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鉻-極低密度脂蛋白螯合物與原子吸 收光譜結(jié)合法、提純鉻-極低密度脂蛋白螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與 酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0034] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0035] 1.本發(fā)明首次合成了鉻-極低密度脂蛋白螯合物；
[0036] 2.本發(fā)明首次提出鉻-極低密度脂蛋白螯合物可用于制備檢測血樣中鉻-極低密 度脂蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用；
[0037] 3.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了鉻-極低密度脂蛋白螯合物的特異性識(shí)別和定量檢測，以便定量 檢測人群血清中鉻-極低密度脂蛋白螯合物的含量，以評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉻污染程度的應(yīng)用， 為工業(yè)地區(qū)的鉻污染水平提供間接指標(biāo)。本發(fā)明建立的鉻-極低密度脂蛋白螯合物定量檢 測方法的準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。
【附圖說明】
[0038] 圖1為本發(fā)明所述的鉻-極低密度脂蛋白螯合物的非變性電泳條帶圖；
[0039] 圖2為本發(fā)明所述的鉻-極低密度脂蛋白螯合物的電泳條帶的同步輻射X線熒光 分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0041] 本發(fā)明除特別說明外，涉及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟；所用試劑、材 料如未特殊說明，均視為可從市購方式購得：
[0042] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0043] 捕獲極低密度脂蛋白的物質(zhì)為抗極低密度脂蛋白抗體，可通過市售獲得，以下實(shí) 施例方式，使用的抗極低密度脂蛋白抗體為貨號(hào)為"Genetex gtxl6419"的VLDL antibody， 所述與極低密度脂蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗極低密度脂蛋白抗體、抗VLDL抗體均為捕獲 極低密度脂蛋白的物質(zhì)；
[0044] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0045] 稀釋緩沖液為pH 9. 6的0. 05M碳酸鹽緩沖液，配制方法示例：取I. 5g的Na2COjP 2. 93g 的 NaHCO3溶解加 CldH2O 定容至 1000 mL ;
[0046] 洗滌緩沖液為ρΗ7· 4的0· 15M PBS溶液，配制方法示例：取0· 2g的ΚΗ2Ρ04、2. 90g 的 Na2HPO4 · 12Η20、8· Og 的 NaCl、0. 2g 的 KC1、0. 5mLTween-