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一種鉻-極低密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用

文檔序號(hào):9325131閱讀:513來源:國知局
一種鉻-極低密度脂蛋白螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重金屬離子的免疫學(xué)檢測,具體涉及一種鉻-極低密度脂蛋白螯合物 及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂蛋白(lipoproteins)是蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合所形成的一種脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù) 合物,按密度分為高密度脂蛋白(high density lipoprotein,簡稱HDL)、中間密度脂 蛋白(intermediate density lipoprotein,簡稱 IDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,簡稱 LDL)、極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,簡稱 VLDL)、 乳糜顆粒(chylomicron,CM)。血液中大約百分之三十的膽固醇是通過HDL從組織細(xì)胞中 運(yùn)輸?shù)礁闻K轉(zhuǎn)化為膽汁酸或通過膽汁排出體外的。血液中約70%的膽固醇由LDL和VLDL 所攜帶,肝臟中產(chǎn)生的內(nèi)源性甘油三酯(triglyceride,TG)也主要依靠 VLDL運(yùn)輸至肝外。 VLDL的增多與高脂血癥、脂代謝紊亂息息相關(guān),而血脂異常又是多種疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn) 因素,因而VLDL含量水平的穩(wěn)定對(duì)于人體各方面機(jī)能功能的穩(wěn)定起著重要作用。
[0003] VLDL含量水平及結(jié)構(gòu)功能的穩(wěn)定對(duì)機(jī)體意義重大。其含量過高與脂肪肝、脂代謝 紊亂、心血管疾病、腎臟功能損傷等息息相關(guān)。定量檢測VLDL可以用于這些疾病的早期診 斷以及治療效果監(jiān)測,甚至作為預(yù)后好壞的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。而對(duì)于營養(yǎng)不良、慢性貧血、肝 功能受損者等患者,血清VLDL含量也會(huì)下降,定量檢測VLDL也可用于這些疾病的早期診 斷、治療效果監(jiān)測以及作為預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一。
[0004] 絡(luò)(chromium,Cr)是元素周期表VI族中的一種過渡金屬,其質(zhì)地堅(jiān)硬,表面具有 光澤,有較高的熔點(diǎn),在工業(yè)生產(chǎn)中具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,一個(gè)世紀(jì)以來被廣泛應(yīng)用,每年 全球鉻生產(chǎn)量高達(dá)107噸,因而鉻是一種名副其實(shí)的重要金屬污染物。目前,鉻廣泛應(yīng)用于 電鍍、鞣革、顏料、油漆、合金、印染等各個(gè)方面,與人們的生活息息相關(guān),但是同樣也對(duì)人 類的身體健康產(chǎn)生巨大影響。
[0005] 自然界中鉻主要以三價(jià)和六價(jià)的形式存在,而一般認(rèn)為,三價(jià)鉻(Cr3+)是人類所 需的微量元素,而六價(jià)鉻(Cr6+)才是明顯的毒性物質(zhì)。由于六價(jià)鉻易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞, 而且可以通過一系列反應(yīng),產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性及基因毒性,因而普遍認(rèn)為六價(jià)鉻的毒性 高于三價(jià)鉻,達(dá)10 -100倍。學(xué)者認(rèn)為當(dāng)水中的六價(jià)鉻含量超過〇.〇5mg/L即是有毒的。六 價(jià)鉻可以通過皮膚接觸、食物攝入、飲用水飲入、呼吸道吸入等途徑進(jìn)入人體,對(duì)于職業(yè)性 暴露人群主要是通過呼吸道吸入六價(jià)鉻灰塵,而對(duì)于普通人群則是通過飲入污染水源、食 入被污染的食物、吸入等方式攝入六價(jià)鉻。六價(jià)鉻進(jìn)入體內(nèi)后,可以引發(fā)氧化應(yīng)激、顯色體 畸變、細(xì)胞凋亡、多種DNA損傷(包括單鏈斷裂、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA-氨基酸交聯(lián)、Cr-DNA 配合物形成等),從而造成機(jī)體多處組織、器官、系統(tǒng)損傷。
[0006] 如前所述,鉻與多種蛋白質(zhì)之間關(guān)系密切,可以與多種蛋白質(zhì)結(jié)合,抑制多種蛋白 酶的活性。隨著對(duì)鉻毒性研究的深入,人們逐漸認(rèn)識(shí)到鉻與蛋白的相互作用在其致毒過程 中扮演著重要的角色,被認(rèn)為是了解鉻的毒性機(jī)理的關(guān)鍵所在,因此,對(duì)鉻和蛋白質(zhì)相互作 用的研究就顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關(guān)于鉻與蛋白質(zhì)作用的機(jī)理僅是冰山一角,還有很多蛋 白質(zhì)與鉻之間的關(guān)系還不清楚,因而加強(qiáng)對(duì)于鉻與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。
[0007] 關(guān)于鉻中毒,特別是慢性鉻中毒的評(píng)價(jià),通過檢測血鉻含量也不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)人體 內(nèi)的循環(huán)鉻含量,無法進(jìn)一步評(píng)估鉻對(duì)于機(jī)體功能的損傷程度,而隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā) 展,鉻與人體的關(guān)系也日益緊密,因而尋找一種可以從免疫功能角度評(píng)價(jià)鉻中毒,特別是慢 性鉻中毒對(duì)于機(jī)體的損害程度的評(píng)價(jià)方式日益重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)鉻污染嚴(yán)重的問題,本發(fā)明的目的在于提供一種鉻-極低密度脂蛋白螯合物 及其制備方法,并建立鉻-極低密度脂蛋白螯合物的定性、定量檢測方法,以便定量檢測 鉻-極低密度脂蛋白螯合物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉻污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個(gè)地區(qū)人 群血清中鉻-極低密度脂蛋白螯合物,可以間接反映這個(gè)地區(qū)人群受鉻污染的情況,從而 間接反映這個(gè)地區(qū)鉻污染程度。
[0009] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:提供一種鉻-極低密度脂蛋白螯合 物,該鉻-極低密度脂蛋白螯合物是鉻離子與極低密度脂蛋白通過巰基或/和半胱氨酸殘 基螯合而成。
[0010] 本發(fā)明還提供一種上述的鉻-極低密度脂蛋白螯合物的制備方法,即體外合成 法,包括以下步驟:
[0011] A)鉻-極低密度脂蛋白螯合物的合成:在提純?cè)从谌梭w的極低密度脂蛋白或按照 生物學(xué)方法重組的極低密度脂蛋白中加入鉻離子進(jìn)行螯合反應(yīng),得到反應(yīng)溶液;
[0012] B)鉻-極低密度脂蛋白螯合物純化:采用免疫親和層析法,去除步驟A)反應(yīng)溶液 中未反應(yīng)的極低密度脂蛋白、特異性抗體和鉻離子,即得鉻-極低密度脂蛋白螯合物。
[0013] 作為優(yōu)選,所述步驟B)中具體包括以下步驟:
[0014] (1)溶解樣品:將上述步驟A)的鉻-極低密度脂蛋白螯合物溶解于生理鹽水中, 得鉻-極低密度脂蛋白螯合物的溶液;
[0015] (2)平衡層析柱:使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路,在層析柱中裝入能與極低 密度脂蛋白特異性結(jié)合的填料,裝柱后,繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱;
[0016] (3)上樣:待層析柱平衡后,用稀釋緩沖液稀釋步驟(1)的溶液,然后上柱,使極低 密度脂蛋白與填料特異性結(jié)合;
[0017] (4)洗脫:使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡,然后使用0. 05-0. lOmol/L的 Na2HP0j§液進(jìn)行洗脫;
[0018] (5)收集:收集步驟(4)的洗脫液,收集完畢后立即使蛋白復(fù)原;
[0019] (6)透析:將步驟(5)中的收集的洗脫液,裝透析袋,用CldH2O透析除鹽,換水三次 后,4°C透析過夜,收集樣本;
[0020] (7)平衡層析柱:采用新的層析柱,用稀釋緩沖液沖洗管路,在該層析柱中裝入能 與鉻特異性結(jié)合的填料,裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱;
[0021] (8)上樣:待層析柱平衡后,用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本,然后上柱;
[0022] (9)洗脫:使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡,然后使用0. 5-1. Omol/L的 Na2HP0j§液進(jìn)行洗脫;
[0023] (10)收集:收集步驟(9)的洗脫液,收集完畢后立即使蛋白復(fù)原;
[0024] (11)透析:將步驟(10)中的洗脫液,裝透析袋,用CldH2O透析除鹽,換水三次后, 4°C透析過夜,收集樣本,即得鉻-極低密度脂蛋白螯合物。
[0025] 作為優(yōu)選,上述鉻-極低密度脂蛋白螯合物的制備方法,還包括以下對(duì)鉻-極低密 度脂蛋白螯合物的鑒定步驟,具體包括以下步驟:
[0026] (1)制備膠床:以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床;
[0027] (2)加樣:取步驟B)中提取純化得到的鉻-極低密度脂蛋白螯合物,加入上樣緩 沖液,并混勻,然后加樣于樣品槽中;
[0028] (3)電泳:連接電泳板,進(jìn)行電泳;
[0029] (4):在膠床上找出含鉻的蛋白條帶,將該蛋白條帶取出,將蛋白條帶溶解,然后再 采用ICP-MS或AAS檢測是否含有鉻以及檢測鉻的含量。
[0030] 本發(fā)明還提供一種如上述的鉻-極低密度脂蛋白螯合物在制備檢測人體內(nèi)鉻-極 低密度脂蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鉻-極低密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的 試劑盒。
[0032] 優(yōu)選地,該試劑盒中還包括包被液,該包被液包括捕獲極低密度脂蛋白的物質(zhì)或 捕獲金屬鉻的物質(zhì)。
[0033] 本發(fā)明還提供一種定量檢測鉻-極低密度脂蛋白螯合物的方法,以已知含量的上 述的鉻-極低密度脂蛋白螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品,采用以下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測:酶聯(lián)免 疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純 鉻-極低密度脂蛋白螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鉻-極低密度脂蛋白螯合物與原子吸 收光譜結(jié)合法、提純鉻-極低密度脂蛋白螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與 酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0034] 相比現(xiàn)有技術(shù),本發(fā)明的有益效果在于:
[0035] 1.本發(fā)明首次合成了鉻-極低密度脂蛋白螯合物;
[0036] 2.本發(fā)明首次提出鉻-極低密度脂蛋白螯合物可用于制備檢測血樣中鉻-極低密 度脂蛋白螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用;
[0037] 3.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了鉻-極低密度脂蛋白螯合物的特異性識(shí)別和定量檢測,以便定量 檢測人群血清中鉻-極低密度脂蛋白螯合物的含量,以評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鉻污染程度的應(yīng)用, 為工業(yè)地區(qū)的鉻污染水平提供間接指標(biāo)。本發(fā)明建立的鉻-極低密度脂蛋白螯合物定量檢 測方法的準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。
【附圖說明】
[0038] 圖1為本發(fā)明所述的鉻-極低密度脂蛋白螯合物的非變性電泳條帶圖;
[0039] 圖2為本發(fā)明所述的鉻-極低密度脂蛋白螯合物的電泳條帶的同步輻射X線熒光 分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】,對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述:
[0041] 本發(fā)明除特別說明外,涉及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟;所用試劑、材 料如未特殊說明,均視為可從市購方式購得:
[0042] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等(采用PEG法);
[0043] 捕獲極低密度脂蛋白的物質(zhì)為抗極低密度脂蛋白抗體,可通過市售獲得,以下實(shí) 施例方式,使用的抗極低密度脂蛋白抗體為貨號(hào)為"Genetex gtxl6419"的VLDL antibody, 所述與極低密度脂蛋白特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗極低密度脂蛋白抗體、抗VLDL抗體均為捕獲 極低密度脂蛋白的物質(zhì);
[0044] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種;
[0045] 稀釋緩沖液為pH 9. 6的0. 05M碳酸鹽緩沖液,配制方法示例:取I. 5g的Na2COjP 2. 93g 的 NaHCO3溶解加 CldH2O 定容至 1000 mL ;
[0046] 洗滌緩沖液為ρΗ7· 4的0· 15M PBS溶液,配制方法示例:取0· 2g的ΚΗ2Ρ04、2. 90g 的 Na2HPO4 · 12Η20、8· Og 的 NaCl、0. 2g 的 KC1、0. 5mLTween-
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