山姜素或豆蔻明與血清作用的差異蛋白檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用雙向電泳研究技術檢測山姜素或豆蔻明與人血清蛋白相互作 用差異顯示蛋白的方法，屬于生物化學研究領域。
【背景技術】
[0002] 血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質，含量約為4g/100mL(0. 6mmol ·〇,占 血漿總蛋白的60%，是血漿蛋白質中少有的非糖蛋白之一，它能與許多內(nèi)源及外源性化合 物結合，起到存儲和轉運作用。大多數(shù)藥物小分子通過與生物體內(nèi)的大分子（如血液蛋白） 結合起一定作用，這也是決定藥物是否具有良好的生物利用度、藥理活性、代謝穩(wěn)定性和低 毒性的主要因素。藥物進入血液后，必然或多或少與血液蛋白結合，結合后的藥物不易穿 透毛細血管壁、血腦屏障及腎小球等多種生物膜，限制其進一步運輸，從而對藥物在體內(nèi) 的分布與代謝產(chǎn)生重要影響，同時藥物與血液蛋白結合的程度決定了藥物儲留于血液中的 量，影響藥物的最大作用強度，有利于防止作用大幅度波動以及延長藥物作用時間起到緩 釋作用。因此藥物小分子與血液蛋白的結合為藥物分子結構與藥效之間關系提供了有利的 信息，同時有助于了解藥物小分子在血液蛋白的轉運和代謝過程，為新的高活性的藥物小 分子的設計與開發(fā)研究提供有價值的信息及重要理論。通過差異蛋白質組學方法，對藥物 小分子影響血液蛋白質組成、動態(tài)變化和相互作用的組學研究，可更加深入理解藥物對血 液生理狀態(tài)的影響，從而協(xié)助闡釋血液中相關體內(nèi)細胞信號傳導的途徑，有助于全面地發(fā) 現(xiàn)和驗證新的血液代謝相互作用網(wǎng)絡和分子間信號傳導途徑、蛋白質靶向物及生物標志物 在細胞體內(nèi)的結構和功能關系。
[0003] 迄今為止，利用2-DE聯(lián)合MS技術路線進行人體血清樣品和藥物的直接相互作用 研究尚未見報道，血清具有所含蛋白質種類多，樣品獲取容易和安全等優(yōu)點，此外血清樣品 中含機體在各種特殊時刻及時分泌是各種蛋白質表型，是尋求疾病標志物的重要源泉。
[0004] 本發(fā)明中所用的山姜素（Alpinetin，7-羥基-5甲氧基二氫黃酮）和豆蔻明 (Cardamonin，2'，4'-二羥基-6'-甲氧基查耳酮，結構圖見圖1)為姜科植物草豆蔻中主要 的兩種互為同分異構體的黃酮類成分，其藥理活性主要表現(xiàn)在抑制血小板聚集，抑制腫瘤 的形成，抗炎抑菌的方面，并且毒性很低，安全性好。
[0005] 通過在模擬人生理溫度條件下，進行血清與藥物相互結合的體外培養(yǎng)， 并采用蛋白質組學研究方法結合基質輔助激光解吸離子化一串聯(lián)飛行時間質譜 技術(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time ofFlightMass Spectr〇ment，MALDI-T0F-MS)開展存在山姜素或豆蔻明時的血清蛋白質組學研究，分析差 異表達蛋白，尋找特定疾病的特異血清蛋白標志物或者發(fā)現(xiàn)新的疾病相關蛋白質，為疾病 的診斷或治療提供新的依據(jù)，為新藥物的開發(fā)提供更加直觀的理論基礎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于建立一種利用雙向電泳研究技術檢測山姜素或豆蔻明與血清作 用的差異蛋白的技術方法，該技術經(jīng)反復實驗證明重復性好，圖譜清晰，是一套適用于血清 樣品與藥物相互作用后尋找差異顯示蛋白的雙向電泳技術。
[0007] 本發(fā)明所述的一種山姜素或豆蔻明與血清作用的差異蛋白檢測的雙向電泳研究 方法技術，包括以下步驟：
[0008] a.將血清蛋白與濃度為1. 0X10 3mol/L~3. 0X10 3mol/L的山姜素或豆蔻明低 速搖勾，恒溫培養(yǎng)。
[0009] b.把培養(yǎng)好的樣品按血清白蛋白清除劑步驟除去高豐度蛋白。
[0010] c.得到的蛋白粉用蛋白質上樣緩沖液復溶，再用Bradford法進行定量。
[0011] d.按蛋白質上樣量為1200 μ g~1500 μ g/24cm膠條，進行第一向等電聚焦。
[0012] e.第一向等電聚焦完畢，膠條平衡后轉到聚丙烯酰胺凝膠電泳，進行第二垂直電 泳。
[0013] f.電泳結束后進行考馬斯亮藍染色，脫色，保存，掃描分析。
[0014] g.差異蛋白點的酶解及質譜鑒定。
[0015] 具體地，藥物溶液的溶劑是水、乙醇、甲醇、異丙醇、正丁醇中的至少一種。
[0016] 優(yōu)選地，所述藥物溶液的溶劑是甲醇。
[0017] 優(yōu)選地，所述藥物濃度為：1. OX 10 3mol/L~3. OX 10 3mol/L。
[0018] 優(yōu)選地，所述蛋白質上樣量為：1200 yg~1500 yg/24cm膠條。
[0019] 優(yōu)選地，所述恒溫培養(yǎng)為：35°C~37°C，r = 0~300rpm，20min~50min。
[0020] 優(yōu)選地，所述去除血清高豐度蛋白按血清白蛋白清除劑步驟操作。
[0021] 優(yōu)選地，所述蛋白上樣緩沖液為含尿素7M，硫脲2M，CHAPS 2%的水溶液。
[0022] 優(yōu)選地，所述蛋白粉復溶按：蛋白質樣品10mg/lmL上樣緩沖液復溶。
[0023] 優(yōu)選地，所述膠條為：IPG pH = 3~10NL。
[0024] 優(yōu)選地，所述膠條平衡為IOmin~20min。
[0025] 優(yōu)選地，所述平衡液為：PH = 8. 8, I. 5M tris-HCl，尿素 6M，甘油 30%，SDS 2%， 溴酚藍0. 002%。
[0026] 優(yōu)選地，所述第二向垂直電泳的溫度為：16°C~20°C。
[0027] 優(yōu)選地，所述第二向垂直電泳參數(shù)為4~6W/60min，7~9W直至結束。
[0028] 相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明山姜素或豆蔻明與人血清作用的差異蛋白檢測的雙向電泳 研究方法，優(yōu)點是使用血清白蛋白清除劑能夠去除血清中高豐度蛋白，樣品處理時間短，操 作簡單，得到的圖譜清晰，重復性好。
【附圖說明】
[0029] 圖1為山姜素的結構圖。
[0030] 圖2為豆蔻明的結構圖。
[0031] 圖3為人血清樣品與山姜素相互結合的雙向電泳圖譜。
[0032] 圖4為人血清樣品與豆蔻明相互結合的雙向電泳圖譜。
[0033] 圖5為載脂蛋白E(編號3)的匹配的肽段序列圖譜。
[0034] 圖6為間α胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白（編號4)的匹配肽段序列圖譜。
[0035] 圖7為鏈C，人類補體成分補體3 (C3c)(編號5)的匹配肽段序列圖譜。
[0036] 圖8為補體B因子（編號6)的匹配肽段序列圖譜。
[0037] 圖9為1-抗胰蛋白酶（編號7)的匹配肽段序列圖譜。
[0038] 圖10為絲氨酸肽酶抑制劑，進化枝Α(α 1-抗蛋白酶，抗胰蛋白酶）（編號8)的匹 配肽段序列圖譜。
[0039] 圖11為類型II角質亞單位蛋白，不完整的（編號9)的匹配的肽段序列圖譜。
[0040] 圖12為鏈Α，游離型人類載脂蛋白A-I的晶體結構（編號10)的匹配肽段序列圖 譜。
[0041] 圖13為載脂蛋白E(編號3)匹配的肽段分子量為2730.4(+1)的二級圖譜，基質： HCCA(下同）。
[0042] 圖14為間α胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白（編號4)匹配的肽段分子量為 2968. 4 (+1)的二級圖譜
[0043] 圖15為鏈C，人類補體成分補體3 (C3c)(編號5)匹配的肽段分子量為3107. 5 (+1) 的二級圖譜。
[0044] 圖16為補體B因子（編號6)匹配的肽段分子量為3788.8(+1)的二級圖譜。
[0045] 圖17為1-抗胰蛋白酶（編號7)匹配的肽段分子量為2574.3(+1)的二級圖譜。
[0046] 圖18為絲氨酸肽酶抑制劑，進化枝Α(α 1-抗蛋白酶，抗胰蛋白酶）（編號8)匹配 的肽段分子量為2574.6(+1)的二級圖譜。
[0047] 圖19為類型II角質亞單位蛋白，不完整的（編號9)匹配的肽段分子量為 1475.8(+1)的二級圖譜。
[0048] 圖20為鏈A，游離型人類載脂蛋白A-I的晶體結構（編號10)匹配的肽段分子量 為2618.3(+1)的二級圖譜。
【具體實施方式】
[0049] 以下通過具體實例進一步說明本發(fā)明。但實施例的具體細節(jié)僅用于解釋本發(fā)明， 不應理解為對本發(fā)明總的技術方案的限定。
[0050] 通過采集健康人血清樣品，取10例血清樣品等體積混合，再從中取出ImL血 清置于PE管中，加入優(yōu)選I. 0X10 3mol/L~3. 0X10 3mol/L，更優(yōu)選2. 0X10 3mol/L~ 2. 5X10 3mol/L的山姜素或豆蔻明，于恒溫箱中優(yōu)選35~37 °C，更優(yōu)選36~37 °C，優(yōu)選 20min~50min，更優(yōu)選25min~35min培養(yǎng)，按血清白蛋白清除劑步驟除去高豐度蛋白，通 過利用Bradford法進行蛋白定量，以上處理方法和實驗條件能夠得到穩(wěn)定性和重復性較 好的血清蛋白質2-DE圖譜，蛋白質點能夠較好分離。利用ImageMaster5. 0凝膠圖像分析 軟件找出10個差異表達蛋白質點，再通過NCBInr的Blast的檢索，確定了它們的蛋白名稱 (見表1)，其中編號1-5號為經(jīng)山姜素處理后得到的差異表達蛋白質點，6-10號為豆蔻明處 理后的差異表達蛋白質點，而1號和6號、2和7號分別為共同的差異表達蛋白質點。
[0051] 載脂蛋白E主要是由肝臟合成的299個氨基酸組成的糖蛋白，位于19號染色體長 臂3區(qū)，含有4個外顯因子和3個內(nèi)含子，是血漿中一種重要載脂蛋白，具有明顯而豐富的 多態(tài)性，在脂質及脂蛋白代謝中起重要的作用。間α胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白 可由一系列炎癥介質導致表達分泌，是一種不穩(wěn)定的蛋白，其可以抑制毒素的活性，也可以 連接多形核白細胞表面的活性因子，抑制吞噬細胞活性，所以被認為是抗炎蛋白質。鏈C， 人類補體成分補體C3c是由C3bi被I因子及其他蛋白酶裂解而來。補體B因子作為一個 單鏈多肽因子在血液中循環(huán)，是補體旁路激活途徑中的一個重要成份，不僅在抗感染中具 有重要意義，在免疫復合物所致的炎性組織損傷亦起著極其重要的作用。1-抗胰蛋白酶是 一種糖蛋白，主要由肝臟合成，廣泛分布于正常人血清和體液中，是血清中最主要的蛋白酶 抑制劑，對凝血酶、尿激酶等其他酶也有抑制作用，也是一種急性時相反應蛋白，在炎癥性 疾患時，可以透過毛細管進入組織液，在炎癥局部往往濃度很高，對急性炎性疾病有一定限 制作用。絲氨酸肽酶抑制劑，進化枝Α(α1_抗蛋白酶，抗胰蛋白酶）由這個基因編碼的蛋 白質分泌和絲氨酸蛋白酶抑制劑，其目標包括彈性蛋白酶、血纖維蛋白溶酶、凝血酶、胰蛋 白酶、胰凝乳蛋白酶、纖溶酶原激活物。這個基因缺陷可能導致肺氣腫或肝臟疾病。人載脂 蛋白A-I基因位于第11號染色體長臂末端區(qū)域內(nèi)，由3個內(nèi)含子和4個外顯子組成，全長 1863bp，可在肝和小腸中表達。
[0052] 表1差異顯示蛋白的結果
[0053]
[0054] 通過以下具體的實施例加以說明。
[0055] 實施例1
[0056] (1)從-80°C冰箱中取出人血清樣品，取10例人血清樣品等體