一種鉻-IgA螯合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測領域，更具體地說，涉及一種鉻-IgA螯合物及其制備方法和應 用。
【背景技術】
[0002] IgA主要由粘膜相關淋巴樣組織產(chǎn)生，其中大部分是由胃腸淋巴樣組織所合成，少 部分由呼吸道、唾液腺和生殖道粘膜組織合成。哺乳期產(chǎn)婦腺組織含有大量IgA產(chǎn)生細胞， 這些細胞主要來自胃腸。在人類，還有少量的IgA來自骨髓。人出生后4~6月開始合成 IgA，4~12歲血清中含量達成人水平，血清型IgA總Ig的10 %左右，半衰期約5~6天。 IgA有IgAl和IgA2兩個亞類。IgAl主要存在于血清中，約占血清中IgA的85%，a 1鏈分 子量為56kD ;IgA2主要存在于外分泌液中，少部分以血清型IgA存在，約占血清中IgA的 15%，α 2鏈缺乏鉸鏈區(qū)，分子量為52kD。血清中的IgA除單體形式外還有由J鏈共價相連 的二聚體或三聚體等形式。分泌型IgA是由J連接的雙體和分泌成分所組成，主要存在于 初乳、唾液、淚液、胃腸液、支氣管分泌等外分泌液中，是粘膜局部免疫的最重要因素，分泌 型IgA通過與相應的病原微生物（如脊髓灰質炎病毒）結合，阻抑其吸附到易感細胞上，分 泌型IgA還可中和毒素如霍亂弧菌毒素和大腸桿毒素等。新生兒易患呼吸道、胃腸道感染 可能與IgA合成不足有關。慢性支氣管炎發(fā)作與分泌型IgA的減少也有一定關系。產(chǎn)婦可 通過初乳將分泌型IgA傳遞給嬰兒，這也是一種重要的自然被動免疫。嗜酸性粒細胞、中性 粒細胞和巨噬細胞表達Fe a R，血清型單體IgA可介導調理吞噬和ADCC作用。此外，分泌 型IgA具有免疫排除功能，即分泌型IgA結合飲食中大量的可溶性抗原以及腸道正常菌群 或病原微生物所釋放的熱原物質，防止它們進入血液。
[0003] 絡（chromium，Cr)是元素周期表VI族中的一種過渡金屬，其質地堅硬，表面具有 光澤，有較高的熔點，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重大的經(jīng)濟價值，一個世紀以來被廣泛應用，每年 全球鉻生產(chǎn)量高達107噸，因而鉻是一種名副其實的重要金屬污染物。目前，鉻廣泛應用于 電鍍、鞣革、顏料、油漆、合金、印染等各個方面，與人們的生活息息相關，但是同樣也對人 類的身體健康產(chǎn)生巨大影響。在美國，Cr與Cr、Cr、Pb被稱為四大環(huán)境污染物。據(jù)統(tǒng)計，每 年有幾十個億的民眾都在飲用鉻污染的水源，而在加利福利亞有高達30%的水資源都已經(jīng) 被鉻污染，因而鉻污染嚴重影響著人們的身體健康。
[0004]自然界中鉻主要以三價和六價的形式存在，而一般認為，三價鉻（Cr3+)是人類所 需的微量元素，而六價鉻（Cr6+)才是明顯的毒性物質。由于六價鉻易通過細胞膜進入細 胞，而且可以通過一系列反應，產(chǎn)生強烈的細胞毒性及基因毒性，因而普遍認為六價鉻的毒 性高于三價絡，達10-100倍。學者認為當水中的六價鉻含量超過0.05mg/L即是有毒的。六 價鉻可以通過皮膚接觸、食物攝入、飲用水飲入、呼吸道吸入等途徑進入人體，對于職業(yè)性 暴露人群主要是通過呼吸道吸入六價鉻灰塵，而對于普通人群則是通過飲入污染水源、食 入被污染的食物、吸入等方式攝入六價鉻。六價鉻進入體內(nèi)后，可以引發(fā)氧化應激、染色體 畸變、細胞凋亡、多種DNA損傷（包括單鏈斷裂、DNA-蛋白質交聯(lián)、DNA-氨基酸交聯(lián)、Cr-DNA 配合物形成等），從而造成機體多處組織、器官、系統(tǒng)損傷。不僅如此，六價鉻還被認為是一 種強有力的致癌物，早在1990年國際癌癥研究組織。
[0005] 鉻與多種蛋白質之間關系密切，可以與多種蛋白質結合，抑制多種蛋白酶的活性。 隨著對鉻毒性研究的深入，人們逐漸認識到鉻與蛋白的相互作用在其致毒過程中扮演著重 要的角色，被認為是了解鉻的毒性機理的關鍵所在，因此，對鉻和蛋白質相互作用的研究就 顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關于鉻與蛋白質作用的機理僅是冰山一角，還有很多蛋白質與鉻之 間的關系還不清楚，因而加強對于鉻與蛋白質之間的關系至關重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對鉻污染嚴重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鉻-IgA螯合物及其制備方 法，并建立鉻-IgA螯合物的定性、定量檢測方法，以便定量檢測鉻-IgA螯合物在評價一個 地區(qū)鉻污染程度的應用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中鉻-IgA螯合物可以間接反映 這個地區(qū)人群受鉻污染的情況，從而間接反映這個地區(qū)鉻污染程度。
[0007] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：提供一種鉻-IgA螯合物，鉻離子與 IgA通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。
[0008] 本發(fā)明還提供一種上述的鉻-IgA螯合物的制備方法，包括以下步驟：
[0009] A)鉻與IgA的螯合反應：在提純源于人體的IgA或按照生物學方法重組的IgA中 加入鉻離子進行螯合反應，得到反應溶液；
[0010] B)純化鉻-IgA螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應溶液中未反應的 IgA以及多余的鉻離子，即得鉻-IgA螯合物。
[0011] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：
[0012] (1)溶解樣品：向經(jīng)過步驟A)得到的反應溶液中加入生理鹽水使鉻-IgA螯合物 復溶；
[0013] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與IgA特 異性結合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0014] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，IgA與 填料特異性結合；
[0015] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液I ;
[0016] (5)收集：收集洗脫液I ;
[0017] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0018] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鉻特異性結合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0019] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；
[0020] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷 酸鹽溶液進行洗脫，得到洗脫液II ;
[0021] (10)收集：收集洗脫液II ;
[0022] (11)透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得鉻-IgA螯合物。
[0023] 其中，上述鉻-IgA螯合物的制備方法，還包括步驟C):對鉻-IgA螯合物的鑒定；
[0024] 其中，步驟C)中具體如下：
[0025] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質制備膠床；
[0026] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的鉻-IgA螯合物，加入稀釋緩沖液，并混勻， 然后加樣于樣品槽中；
[0027] (3)電泳：連接電泳板，進行電泳；
[0028] (4)檢測：在膠床上找出含鉻的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測是否含有鉻以及檢測鉻的含量。
[0029] 本發(fā)明還提供一種如上述的鉻-IgA螯合物在制備檢測人體內(nèi)鉻-IgA螯合物的試 劑或試劑盒中的應用。
[0030] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鉻-IgA螯合物作為標準品的試劑盒。
[0031] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲IgA的物質或捕獲鉻的物 質。
[0032] 本發(fā)明還提供一種定量檢測鉻-IgA螯合物的方法，以已知含量的上述的鉻-IgA 螯合物作為標準品，采用以下方法之一對樣品進行檢測：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收 光譜結合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質譜結合法、提純鉻-IgA螯合物與酶聯(lián)免疫結 合法、提純鉻-IgA螯合物與原子吸收光譜結合法、提純鉻-IgA螯合物與電感耦合等離子體 質譜結合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質譜結合法。
[0033] 實施本發(fā)明的鉻-IgA螯合物及其制備方法和應用，具有以下有益效果：
[0034] 1.本發(fā)明首次體外合成鉻-IgA螯合物；
[0035] 2.本發(fā)明首次提出鉻-IgA螯合物可用于制備檢測血樣中鉻-IgA螯合物的試劑或 試劑盒中的應用。
[0036] 3.本發(fā)明建立了鉻-IgA螯合物的定性定量檢測方法，以便定量檢測鉻-IgA螯合 物在評價一個地區(qū)鉻污染程度的應用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中鉻-IgA螯合物 可以間接反映這個地區(qū)人群受鉻污染的情況，從而間接反映這個地區(qū)鉻污染程度。本發(fā)明 建立的鉻-IgA螯合物定量檢測方法其準確度大大提高，并且使檢測的重復性得到大大提 尚。
【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明所述的鉻-IgA螯合物的非變性電泳條帶圖；
[0038] 圖2為本發(fā)明所述的鉻-IgA螯合物的電泳條帶的同步輻射X線熒光分析圖。
【具體實施方式】
[0039] 下面，結合【具體實施方式】，對本發(fā)明做進一步描述：
[0040] 本發(fā)明除特別說明外，涉及的實驗操作步驟均為本領域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒有列舉出來的均為本領域常用的試劑或可以通過市購方式 獲得：
[0041] 磷酸鹽溶液為 0· 05-0. lmol/L Na2HPO4溶液或 0· 5-lmol/L Na 2ΗΡ04溶液；
[0042] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0043] 膠床介質為瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種；
[0044] 捕獲IgA的物質購買自艾美捷科技有限公司的型號為Abeam ab8508的兔Anti-人 類IgA H&L ;其中，本發(fā)明所述與IgA特異性結合的物質、抗IgA抗體、抗IgA抗體均為捕獲 IgA的物質；
[0045] 捕獲鉻的物質購買自廣州然科生物科技有限公司的型號為RK10641的抗鉻抗體； 其中，本發(fā)明所述與鉻特異性結合的物質、抗Cr抗體、抗鉻抗體均為捕獲鉻的物質；
[0046] 酶標抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標記的抗體中的一種；
[0047] 底物為甲基聯(lián)