本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種藥物組合物及其用途。

背景技術(shù)：

脂肪肝(fattyliver)是常見的彌漫性肝病之一，是由多種原因引起的肝臟脂肪代謝紊亂的一種代謝性疾病，主要是肝細(xì)胞攝取的脂肪增加而氧化減少所致的肝細(xì)胞內(nèi)蓄積脂肪過多的病理狀態(tài)。脂肪肝的病因比較復(fù)雜，常見如酗酒、肥胖、糖尿病、脂質(zhì)代謝異常等，特別是與高脂血癥有密切關(guān)系。脂肪肝的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。一般認(rèn)為肝細(xì)胞合成甘油三酯及分泌低密度脂蛋白之間的不平衡是形成脂肪肝的主要原因。根據(jù)形成脂肪肝病因的不同，通常分為酒精性脂肪性肝病(alcoholicfattyliverdisease，afld)和非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease,nafld)。nafld是指過多的脂肪以甘油三酯(脂肪變性)的形式在肝臟中堆積，其發(fā)病機(jī)制與胰島素抵抗(insulinresistance，ir)和代謝綜合征(metabolismsyndrome，ms)有關(guān)。nafld的疾病譜從單純的肝臟脂肪變性(nonalcoholicfattyliver，nafl)到非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，nash)，以致發(fā)展為肝纖維化及肝硬化甚至肝細(xì)胞癌。nafld不僅是歐美發(fā)達(dá)國家的第一大肝病，據(jù)估計(jì)發(fā)達(dá)國家有20％～30％人口有非酒精性脂肪肝，預(yù)計(jì)到2030年該數(shù)值將攀升至50％，但目前卻仍無獲批上市的藥物；其在全球范圍內(nèi)也正迅猛增加，在我國同樣如此，已成為富裕地區(qū)第一大慢性肝病，由脂肪肝引發(fā)的肝病發(fā)病勢頭也越來越猛。在體檢人群中，40至49歲的男性脂肪肝發(fā)病率最高，達(dá)28％。更令人擔(dān)心的是，查出脂肪肝之后，到醫(yī)院進(jìn)一步檢查的人寥寥無幾。我國脂肪肝的發(fā)病率占平均人口的10％，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，其肝纖維化的發(fā)生率高達(dá)25％，且約1.5％～8.0％的患者可發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌。nafld若進(jìn)展為nash，發(fā)生肝硬化，肝衰竭和肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)將大大增加，據(jù)報(bào)道nafld目前已經(jīng)影響到了20％～40％的成人人群，其中約30％nafld進(jìn)展為nash，而nash患者肝硬化發(fā)病率15％～25％，最終死于肝病的約30％～40％。因此脂肪性肝病已成為當(dāng)代肝病領(lǐng)域的新挑戰(zhàn)。

目前治療nafld的主要藥物包括胰島素增敏劑(雙胍類藥物如二甲雙胍、噻唑烷二酮類化合物如羅格列酮和匹格列酮)、降脂藥物(他汀類、貝特類)、利膽藥物(熊去氧膽酸)、護(hù)肝類藥物(維生素e、水飛薊素、乙酰半胱氨酸)以及中藥(何首烏、丹參、澤瀉、 川芎、決明子、山楂等)。種類繁多，作用機(jī)制單一，療效差異不大，整體效果不佳，且伴隨副作用、患者耐受性差，仍有待改進(jìn)。nafld目前沒公認(rèn)有效的治療方法，許多新藥仍在臨床試用中。盡管胰島素增敏劑如噻唑烷二酮類藥物已被證實(shí)在改善肝臟炎癥和脂肪含量方面有一定療效，但無法阻斷nash所致的纖維化進(jìn)展。

因此，目前用于治療脂肪肝病的藥物還有待進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種有效治療或預(yù)防非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝炎的藥物組合物。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施例的藥物組合物包括：第一組分和第二組分。其中第一組分為選自法尼醇x受體激動(dòng)劑及其前體、活性代謝產(chǎn)物、立體異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、酯類和溶劑合物中的至少之一；第二組分為選自npc1l1受體抑制劑及其前體、活性代謝產(chǎn)物、立體異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、酯類和溶劑合物中的至少一種。

因此，本發(fā)明所述藥物組合物具有降低總膽固醇和/或甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、和/或谷丙轉(zhuǎn)氨酶和/或天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶水平、肝系數(shù)的功效，進(jìn)而在預(yù)防和/或治療nafld、糖尿病或心血管疾病，以及預(yù)防和/或治療肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌等方面具有顯著效果。尤其對(duì)預(yù)防/治療非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝炎效果優(yōu)異。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述法尼醇x受體激動(dòng)劑為選自膽酸(ca)、石膽酸(lca)、奧貝膽酸(oca)、鵝去氧膽酸(cdca)、熊去氧膽酸(udca)、脫氧膽酸(dca)、gw4064、way-362450、px-102和px20350中的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述npc1l1受體抑制劑為膽固醇吸收抑制劑化合物。由此將膽酸(ca)、石膽酸(lca)、奧貝膽酸(oca)、鵝去氧膽酸(cdca)、熊去氧膽酸(udca)、脫氧膽酸(dca)、gw4064、way-362450、px-102和px20350中的至少一種與膽固醇吸收抑制劑化合物進(jìn)行聯(lián)合使用得到的組合物預(yù)防/治療非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝炎具有顯著。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述法尼醇x受體激動(dòng)劑優(yōu)選為奧貝膽酸。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，npc1l1受體抑制劑優(yōu)選為海折麥布、依折麥布。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述依折麥布的活性代謝物為依折麥布酚葡糖苷酸。由此通過將奧貝膽酸與海折麥布和/或依折麥布進(jìn)行聯(lián)合組成上述藥物組合物可以進(jìn)一步提高預(yù)防/治療非酒精性脂肪肝和非酒 精性脂肪肝炎作用。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，上述藥物組合物中npc1l1受體抑制劑優(yōu)選典型代表藥物依折麥布。依折麥布是一種選擇性膽固醇吸收抑制劑，其作用于小腸黏膜的刷狀緣，特異性結(jié)合于腸黏膜上niemann-pickc1-like1(npc1l1)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，選擇性抑制外源性膽固醇和相關(guān)植物甾醇類在小腸部位的吸收，使肝臟膽固醇儲(chǔ)存減少，降低血漿中總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇的同時(shí)，提升高密度脂蛋白膽固醇水平。但對(duì)其他營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素，脂肪，蛋白質(zhì)和糖等吸收抑制作用不明顯，主要針對(duì)飲食引起的高脂血癥起作用。與他汀類藥物不一樣，其對(duì)肝臟內(nèi)源性合成的膽固醇無抑制作用。根據(jù)目前技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀，對(duì)依折麥布的研發(fā)重點(diǎn)仍然集中于作為他汀類藥物的聯(lián)合用藥，以降低糖尿病以及代謝綜合征引起高膽固醇血癥患者的ldl-c水平；以及其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、通過強(qiáng)化降脂以降低心腦血管事件發(fā)生等。

近來研究表明依折麥布的作用靶點(diǎn)npc1l1不僅分布在小腸絨毛凹陷，在靈長類動(dòng)物或人類的肝臟也有表達(dá)和分布。所以依折麥布也可作用于在肝臟上npc1l1受體蛋白，促進(jìn)低密度脂蛋白(ldl)和含有大量脂質(zhì)的乳糜微粒或極低密度脂蛋白(vldl)從肝膽排除，具有改善脂肪肝的作用。盡管有人提出依折麥布基于其優(yōu)秀的在降低ldl-c的表現(xiàn)，可能會(huì)成為nafld治療中的希望，但尚未見任何明確結(jié)論。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述藥物組合物中所選用的依折麥布，為安全性極高的藥物。依折麥布口服后可被迅速吸收，在腸腔和肝臟中糖化為更有活力的產(chǎn)物，經(jīng)而經(jīng)肝腸循環(huán)，反復(fù)用途于npc1l1。以¹⁴c為標(biāo)記的依折麥布藥物代謝實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，依折麥布幾乎不通過主要藥物代謝酶——細(xì)胞色素p450代謝，故幾乎不與其它藥物發(fā)生作用。

發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，依折麥布與奧貝膽酸聯(lián)合應(yīng)用可以明顯加強(qiáng)奧貝膽酸的改善非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪肝炎的作用，同時(shí)還可以降低奧貝膽酸單用帶來的ldl升高等副作用，進(jìn)而將上述兩種藥物進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，很好地彌補(bǔ)了奧貝膽酸在治療非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪肝炎中的缺陷。另外，依折麥布與奧貝膽酸聯(lián)合應(yīng)用未出現(xiàn)藥物之間的相互作用，因此，該藥物組合物具有良好的安全性。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，發(fā)明人將奧貝膽酸與依折麥布聯(lián)合應(yīng)用得到上述實(shí)施例的藥物組合物是基于下列發(fā)現(xiàn)完成的。

首先，奧貝膽酸是一種半合成鵝去氧膽酸，在肝臟、腸道和腎臟等參與膽紅素代謝的細(xì)胞中大量表達(dá)，膽汁酸是其天然配體。相比于安慰劑對(duì)照，奧貝膽酸治療組患者的總膽固醇和低密度脂蛋白水平更高，而高密度脂蛋白下降。部分患者接受了血脂干預(yù)，甚至因此提前停藥。由治療引起的膽固醇升高及胰島素抵抗，或增加動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致心血管事件，長期安全性成為最大的顧慮，尚需要進(jìn)一步研究加以明確。

為減少這一副作用，目前的技術(shù)人員通常會(huì)聯(lián)想到聯(lián)合使用他汀類藥物。根據(jù)目前技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀，他汀類藥物作為應(yīng)用范圍最廣的調(diào)脂藥物，對(duì)它的單方研究已較為成熟。心血管疾病的患者目前主要獲益于他汀類藥物降低膽固醇的作用，并且大量體內(nèi)和體外研究表明，他汀類藥物同樣具有獨(dú)立于調(diào)脂之外的抗炎作用，表現(xiàn)為調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗血栓形成及抗菌等方面的作用。由于炎癥及氧化還原機(jī)制與nafld及nash的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，各國指南均推薦他汀類藥物應(yīng)用于血脂異常的nafld及nash治療。

目前，對(duì)他汀類藥物治療對(duì)nafld、nash的有效性及安全性的研究較多。他汀類藥物治療降低轉(zhuǎn)氨酶，減輕肝脂肪變性的程度，但是不能改善肝纖維化的嚴(yán)重程度，可能延緩nafld至nash的進(jìn)展。即他汀對(duì)nafld、nash合并血脂異常(高ldl-c血癥)的治療具有一定療效。但是這些臨床試驗(yàn)存在樣本量相對(duì)較小、隨訪時(shí)間不夠長的問題，同時(shí)大部分實(shí)驗(yàn)沒有進(jìn)行組織學(xué)檢查。并且他汀類藥物一方面存在嚴(yán)重的安全隱患：肌肉疾病可能算是他汀類藥物最嚴(yán)重的不良反應(yīng)，肌病的發(fā)生率和嚴(yán)重程度均與他汀的劑量呈正相關(guān)性，主要表現(xiàn)為肌痛或肌無力，伴有ck升高至正常上限10倍以上，也可有發(fā)熱和全身不適癥狀。肌病未能及時(shí)被發(fā)現(xiàn)，仍舊繼續(xù)用藥，則可能導(dǎo)致橫紋肌溶解和急性腎功能衰竭。同時(shí)他汀類藥物還可能會(huì)引起患者血糖異常，肝酶異常、記憶和認(rèn)知障礙等。另一方面，也是最為關(guān)鍵的：他汀類藥物是通過競爭性抑制內(nèi)源性膽固醇合成限速酶(hmg-coa)還原酶，阻斷細(xì)胞內(nèi)羥甲戊酸代謝途徑，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成減少，從而反饋性刺激細(xì)胞膜表面(主要為肝細(xì)胞)低密度脂蛋白受體數(shù)量和活性增加，使血清膽固醇清除增加、水平降低。其對(duì)外源性膽固醇作用并不佳。而脂肪肝病人的血膽固醇有極大部分屬于因飲食攝入的外源性膽固醇。并且，他汀類藥物在聯(lián)合其它藥物使用時(shí)，如貝特類、煙酸類、環(huán)孢霉素、hiv蛋白酶抑制劑等，常會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)。因此，發(fā)明人認(rèn)為常規(guī)聯(lián)用他汀類藥物，并非合適選擇。

為此，發(fā)明人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，意外發(fā)現(xiàn)，法尼醇x受體激動(dòng)劑與膽固醇吸收抑制劑具有協(xié)同效應(yīng)，特別是奧貝膽酸與依折麥布組合用藥有著意想不到的治療nafld和nash的效果，特別是該組合物可降低奧貝膽酸單用帶來的ldl升高的副作用。從而可以預(yù)期該組合藥物可以作為治療非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎和高脂血癥性脂肪肝的組合藥物繼續(xù)開發(fā)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，上述實(shí)施例的藥物組合物中含有：1～100重量份的所述第一組分；以及1～100重量份的所述第二組分。由此通過采用上述配比，可以進(jìn)一步提高二者協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)而提高治療nafld和nash的效果。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，優(yōu)選地，上述實(shí)施例的藥物組合物中含有2.5～50重量份的所述第一組分；以及5～50重量份的所述第二組分。由此通過采用上述配比，可以進(jìn)一步提 高二者協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)而提高治療nafld和nash的效果。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種藥物制劑，該藥物制劑包括前面所述的藥物組合物作為活性成分。由此該制劑發(fā)揮活性成分的藥理作用，進(jìn)而具有該藥物組合物的所用功效。具體地，該制劑具有降低總膽固醇和/或甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、和/或谷丙轉(zhuǎn)氨酶和/或天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶水平、肝系數(shù)的功效，進(jìn)而在預(yù)防和/或治療nafld、糖尿病或心血管疾病，以及預(yù)防和/或治療肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌等方面具有顯著效果。尤其對(duì)預(yù)防/治療非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝炎效果優(yōu)異。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，上述藥物制劑除以前面所述的作為活性成分外，還包括藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥學(xué)可接受的載體為選自藥學(xué)上可接受的溶劑、拋射劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、著色劑、粘合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑、潤濕劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、助流劑、矯味劑、防腐劑、助懸劑、包衣材料、芳香劑、抗粘合劑、整合劑、滲透促進(jìn)劑、ph值調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、增塑劑、表面活性劑、發(fā)泡劑、消泡劑、增稠劑、包合劑、保濕劑、吸收劑、稀釋劑、絮凝劑與反絮凝劑、助濾劑、釋放阻滯劑、高分子骨架材料和成膜材料中的至少一種。由此可以使得所述藥物組合物能夠制劑成型，呈現(xiàn)臨床用藥物制劑適于給藥的形式。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，上述藥物制劑可以為任一適于口服的劑型。當(dāng)口服給藥時(shí)，本發(fā)明以藥物組合物為活性成分的藥物劑型包括但不僅限于片劑、舌下含片、泡騰片、包衣片、糖衣片、分散片、腸溶片、顆粒劑、明膠膠囊、腸溶膠囊、緩釋膠囊、控釋膠囊、口服液，優(yōu)選為片劑或膠囊。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，上述藥物制劑中的活性成分藥物組合物中的第一組分的含量為1mg～100mg，優(yōu)選為2.5mg～50mg；第二組分的含量為1mg～100mg，優(yōu)選為5mg～50mg。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，上述藥物制劑中的活性成分藥物組合物中的第一組分的含量為1mg，第二組分的含量為1mg。

根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出了前面所述的藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于：降低總膽固醇和/或甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、和/或谷丙轉(zhuǎn)氨酶和/或天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶水平、肝系數(shù)。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了前面所述的藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于：預(yù)防和/或治療nafld、糖尿病或心血管疾病。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述藥物用于：預(yù)防和/或治療肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌。

根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了前面所述的藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療 nash藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了前面所述的藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療高脂血癥性脂肪肝藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，藥物組合物在制備藥物中的用途中，藥物組合物的給藥方式采用口服的方式，或以混合物形式給藥，或給予不同時(shí)間的先后次序形式給藥。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，藥物組合物在制備藥物中的用途中，藥物組合物的用藥劑量為1～1000mg/天。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說明

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例4，給藥4周對(duì)nafld金黃地鼠肝組織外觀的影響的圖譜；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例4，給藥4周對(duì)nafld金黃地鼠肝組織顏色的影響的圖譜。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1制備奧貝膽酸

將1.3kg3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷酸、13.0kg純化水、0.65kg50％氫氧化鈉水溶液和0.13kg10％鈀碳加入反應(yīng)釜中。反應(yīng)混合物在1～3個(gè)大氣壓下氫化，直至反應(yīng)完全。用氮?dú)庵脫Q后，反應(yīng)液過濾回收催化劑，收集母液并轉(zhuǎn)移入反應(yīng)釜中，升溫至95～100℃，攪拌直至反應(yīng)結(jié)束。加入11.5kg乙酸丁酯，攪拌下用約5.2kg檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)ph至4～5。繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)后，靜置分層，分離有機(jī)相經(jīng)水洗后加入活性炭，在55℃左右處理約0.5小時(shí)，濾出活性炭，濾液減壓濃縮至大量固體析出。過濾，濾餅用0.6kg乙酸丁酯洗滌后，在不高于60℃減壓真空干燥，得到1.2kg3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷酸。

將1.15kg3α-羥基-6α-乙基-7-酮基-5β-膽烷酸、9.2kg純化水和1.1kg50％氫氧化鈉水溶液加入反應(yīng)釜中。將混合物升溫至80℃左右，攪拌至全部溶清。將溶解于5％氫氧化鈉水溶液中的硼氫化鈉(0.104kg)堿水溶液加入反應(yīng)釜中，隨后繼續(xù)升溫至95～105℃，保溫?cái)? 拌直至反應(yīng)完成。反應(yīng)液冷卻至55℃左右，加入8.1kg乙酸丁酯和8.6kg50％的檸檬酸水溶液，調(diào)節(jié)ph至4～5，靜置分層，分離有機(jī)相經(jīng)水洗后減壓濃縮，過濾收集析出固體，用乙酸丁酯重結(jié)晶后，真空干燥得到0.75kg奧貝膽酸粗品。將粗品加入6.0kg純化水和0.17kg50％氫氧化鈉水溶液中，攪拌溶解后經(jīng)濾膜過濾，濾液加入到由16.7kg純化水和0.25kg37％濃鹽酸配制成的稀鹽酸中，控制體系溫度不低于40℃。滴加完畢后繼續(xù)在40～45℃攪拌約1小時(shí)。將反應(yīng)液降溫至20℃左右，過濾，濾餅用純化水洗滌至濾液ph為6.0～7.0，在50℃左右真空干燥，得0.7kg奧貝膽酸。

實(shí)施例2制備依折麥布

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將(4s)-3-[(5s)-5-(4-氟苯基)-5-羥基-1-氧代戊基]-4-苯基-2-噁唑烷酮(2.0kg)，4-[[(4-氟苯基)亞胺]甲基]-苯酚(2.4kg)，二氯甲烷(15.0kg)加入50l反應(yīng)釜中，控溫低于-5℃，加入dipea(3.8kg)，攪拌下緩慢滴加三甲基氯硅烷(2.3kg)，滴加完畢后繼續(xù)攪拌直至反應(yīng)結(jié)束，記為體系a。

將四氯化鈦(1.26kg)加入含有二氯甲烷(4.5kg)的100l反應(yīng)釜中，降溫至-15℃左右，加入四異丙醇鈦(0.68kg)，攪拌20分鐘后降溫至-30℃，緩慢滴加上述tms保護(hù)的主原料體系a，控制溫度不超過-20℃，滴加完畢后，劇烈攪拌約3小時(shí)，反應(yīng)完畢。

控制溫度低于0℃，滴加異丙醇(16.0kg)，再加入二氯甲烷(34.5kg)，攪拌0.5小時(shí)，加入飽和酒石酸水溶液(35.0kg)，自然升溫至室溫，繼續(xù)攪拌3小時(shí)至反應(yīng)完全。分液用二氯甲烷萃取水相，合并有機(jī)相用純化水(24.0kg)洗滌，再向有機(jī)相加入20％亞硫酸氫鈉水溶液(35.0kg)攪拌約3小時(shí)，有固體析出，過濾收集固體并用純化水洗滌。母液轉(zhuǎn)移入反應(yīng)釜中，分出水層，有機(jī)相用純化水(16.0kg)洗滌后減壓濃縮直至無餾分，再加入二氯甲烷(5.6kg)和純化水(4.0kg)攪拌，固體析出，過濾，得到固體與上述固體合并，烘干，得到1.82kg(s)-3-((s)-5-(4-氟苯基)-5-(三甲基硅氧基)戊酰基)-4-苯基-2-噁唑烷酮。

將(s)-3-((s)-5-(4-氟苯基)-5-(三甲基硅氧基)戊酰基)-4-苯基-2-噁唑烷酮(1.82kg)，二氯甲烷(10.5kg)，bsa(2.55kg)加入100l的反應(yīng)釜中，加熱至回流，攪拌至反應(yīng)結(jié)束，降溫至常溫，加入甲基叔丁基醚(4.9kg)攪拌1小時(shí)，再加入tbaf·3h2o(36.4g)，攪拌至反應(yīng)結(jié)束，減壓濃縮至無餾分流出，向濃縮液中加入丙酮(3.8kg)，0～10℃滴加2mol/l的硫酸溶液(2.0kg)，常溫?cái)嚢柚练磻?yīng)結(jié)束，加入二氯甲烷(9.0kg)和純化水(4.0kg)攪拌，固體析出，抽濾，收集固體。母液重新加入反應(yīng)釜中，分出水相，有機(jī)相再次加入純化水(10kg)，控溫0～10℃攪拌，固體析出，抽濾，得到的固體與上述固體合并，再加入二氯甲烷(5kg)和純化水(5kg)，打漿后降溫至0～5℃抽濾，濾餅在45～55℃減壓真空 干燥，所得固體加入無水乙醇(14kg)，溶清后過濾，濾液在45～55℃減壓濃縮至約1/2體積，加純化水(6.6kg)后，降溫至0～5℃析晶，攪拌約1小時(shí)后抽濾，收集固體，在約50℃減壓真空干燥，得依折麥布770g。

實(shí)施例3制備依折麥布的酚葡糖苷酸

在-25℃將0.091ml三氟化硼乙醚加入到3.33g3,4,6-三鄰乙?；?α-d-吡喃葡萄糖1,2-(原酸甲酯)和4.24g3-o-乙酰基依折麥布的二氯甲烷溶液中。在-20℃反應(yīng)2小時(shí)，升溫至10℃繼續(xù)反應(yīng)至完全后，以飽和氯化銨水溶液淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取分層。分離得有機(jī)相，分別以飽和氯化銨水溶液、水和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥后，濃縮并經(jīng)硅膠柱層析純化獲得5.39g反應(yīng)中間體。

將5.08g該中間體溶于127ml甲醇和127ml三乙胺中，在室溫緩慢加入445ml水。所得澄清反應(yīng)液攪拌過夜直至反應(yīng)完全。濃縮去除甲醇和三乙胺，殘留溶液用1m鹽酸酸化后，以乙酸乙酯萃取。合并萃取所得有機(jī)相，分別以1m鹽酸、水和氯化鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥后，濃縮并經(jīng)硅膠柱層析純化和干燥獲得2.6g依折麥布酚葡糖苷酸。

實(shí)施例4奧貝膽酸與依折麥布聯(lián)合用藥與分別單獨(dú)用藥對(duì)單純高脂飲食誘導(dǎo)的nafld的影響

1、儀器

sysmexchex-180全自動(dòng)生化儀；beckman22r離心機(jī)；sartoriuscp124s電子天平；kudossk7200h超聲波清洗器。

2、試藥

tc(批號(hào)20150912)、tg(批號(hào)20151012)、ldl-c(批號(hào)20151122)、hdl-c(批號(hào)20150322)、alp(批號(hào)20151112)、glu(批號(hào)20150822)試劑盒均由上?？迫A生物工程股份有限公司提供；alt(批號(hào)zg5005)和ast(批號(hào)zg5004)試劑盒購自希森美康；

奧貝膽酸、依折麥布藥物均用10％kolliphorhs15配制所需濃度(basf，批號(hào)21466288k0)。

3、動(dòng)物

雄性spf級(jí)金黃地鼠78只，bw70～90g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：scxk(京)2012-0001。

4、模型制備

10只金黃地鼠作為正常組喂以普通飼料，其余68只動(dòng)物于購進(jìn)當(dāng)日喂以高脂飼料(配方：0.3％膽固醇，12.5％棕櫚油，87.2％基礎(chǔ)飼料)，自由飲水，光照周期10h/14h，飼養(yǎng)3w后，禁食14h，自由飲水，次日眼眶后靜脈采血0.8ml，肝素鈉抗凝，5000r·min^-1離心10min，移取300μl上清液于微量杯，用全自動(dòng)生化儀測定血漿中tc、tg、ldl-c、hdl-c和alt含量，并根據(jù)測定結(jié)果對(duì)地鼠進(jìn)行篩選分組。

5、分組與給藥

篩選出6只常規(guī)飲食地鼠作為正常組，30只高脂飲食地鼠均勻隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為模型組，奧貝膽酸組(1mg/kg)、奧貝膽酸(1mg/kg)+依折麥布組(1mg/kg)。篩選分組當(dāng)天下午4:00開始給藥，各組動(dòng)物均按10ml·kg^-1體積給藥，模型組給予等體積的10％kolliphor。除正常組外，其他3組給藥期間繼續(xù)喂以高脂飼料，給藥2周后，所有地鼠禁食不禁水，次日上午將動(dòng)物乙醚麻醉后，眼眶后靜脈采血0.8ml，肝素鈉抗凝，5000r·min^-1離心10min，取300μl血漿，用全自動(dòng)生化儀測定血漿中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast和alp水平。給藥4周后，取血漿繼續(xù)測定各組血漿中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast和alp水平；采血完畢后，乙醚深度麻醉，稱取動(dòng)物體質(zhì)量，腹正中切口開腹，觀察肝臟的大小、顏色、質(zhì)地并拍照，同時(shí)取出肝臟，生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱取質(zhì)量用于計(jì)算肝指數(shù)，并迅速剪下肝左葉置10％中性福爾馬林中固定，制成石蠟切片，he染色后光鏡觀察肝組織病理學(xué)變化。

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

給藥2周后各組地鼠血漿中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast和alp水平結(jié)果見表1。與正常組比較，模型組血漿中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast和alp水平均顯著性升高(p<0.05或p<0.01)；與模型組比較，奧貝膽酸單用組能顯著降低地鼠血漿中ast水平(p<0.05)，但對(duì)tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt和alp無顯著性影響(p>0.05)；與模型組比較，奧貝膽酸聯(lián)合依折麥布組能顯著降低血漿中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast水平(p<0.05或p<0.01)，但血漿中alp水平無明顯變化(p>0.05)。

給藥4周后各組地鼠血漿中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast和alp水平以及肝系數(shù)結(jié)果見表2。與正常組比較，模型組血漿中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast水平和肝系數(shù)均顯著性升高(p<0.01)，但alp無明顯差異(p>0.05)；與模型組比較，奧貝膽酸單用組能顯著降低地鼠血漿中tc、ldl-c、alt、ast水平(p<0.05或p<0.01)，但數(shù)值仍較高，且對(duì)tg、hdl-c、alp、肝系數(shù)無顯著性影響(p>0.05)；與模型組比較，奧貝膽酸聯(lián)合依折麥布組能顯著降低肝系數(shù)(p<0.01)以及血漿中tc、tg、ldl-c、hdl-c、 alt、ast、alp水平(p<0.01)。

給藥4周后，各組金黃地鼠肝組織標(biāo)本見圖1和圖2，其中，圖1表示給藥4w對(duì)nafld金黃地鼠肝組織外觀的影響，其中a-1,2,3：正常組；b-1,2,3：模型組；c-1,2,3：奧貝膽酸組；d-1,2,3：奧貝膽酸+依折麥布組，1、2、3表示中各組中任意選擇的小鼠。圖2顯示了給藥4w對(duì)nafld金黃地鼠肝組織顏色的影響，其中a：正常組；b：模型組；c：奧貝膽酸組；d：奧貝膽酸+依折麥布組。肝臟大體標(biāo)本觀察正常組肝臟呈鮮紅色，邊緣銳利，表面光滑，質(zhì)地柔軟；模型組地鼠肝臟體積明顯增大，外形飽滿，包膜緊張，表面粗糙，呈紅黃或奶油黃色，趨于白化，邊緣變鈍，觸之有油膩感，質(zhì)地較脆。奧貝膽酸單用組肝組織較模型組差異不大，但奧貝膽酸聯(lián)合依折麥布組的地鼠肝臟較模型組紅潤，有彈性，肝外觀均接近正常組。

說明奧貝膽酸單用對(duì)金黃地鼠nafld的治療效果不明顯，但奧貝膽酸與依折麥布聯(lián)用對(duì)其表現(xiàn)出理想的療效。

由此可見，法尼醇x受體激動(dòng)劑奧貝膽酸與膽固醇吸收抑制劑依折麥布聯(lián)合用藥有著意料不到的治療nafld和nash效果，特別是該組合物可降低奧貝膽酸單用帶來的ldl升高的副作用。從而可以預(yù)期該組合藥物可以作為治療非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎和高脂血癥性脂肪肝的組合藥物繼續(xù)開發(fā)。目前尚無相關(guān)奧貝膽酸的組合藥物治療的報(bào)道，更未見奧貝膽酸與依折麥布的組合。本發(fā)明人通過動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)了兩者的藥效協(xié)同作用，且沒有藥物-藥物相互作用的干擾，更安全。因此奧貝膽酸與依折麥布組合用藥對(duì)于治療非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎和高脂血癥性脂肪肝等疾病均具有明確的創(chuàng)新性。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。