尿液處理方法和氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)尿液甲基丙二酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及尿液處理方法和尿液有機(jī)酸，特別是尿液甲基丙二酸的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甲基丙二酸血癥(MMA)，又稱為甲基丙二酸尿癥，是一種常染色體隱性遺傳的代謝性疾病，是有機(jī)酸血癥中最常見(jiàn)的類型。其發(fā)病原因是由于甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A的代謝過(guò)程中出現(xiàn)障礙，從而導(dǎo)致體內(nèi)甲基丙二酰輔酶A、甲基丙二酸、丙酸等有機(jī)酸蓄積，引發(fā)代謝性酸中毒，損害神經(jīng)系統(tǒng)，嚴(yán)重者可引起酮癥酸中毒、低血糖、高血氨、高甘氨酸血癥等，新生兒、嬰幼兒期的病死率很高。
[0003]然而，由于有機(jī)酸代謝病臨床表現(xiàn)復(fù)雜，且癥狀均為非特異性的，臨床診斷較為困難，需要依賴質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行篩查。目前，甲基丙二酸血癥的診斷主要采用兩種方法:使用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)濾紙干血片?；鈮A的方法和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用檢測(cè)尿液甲基丙二酸的方法。但是，在串聯(lián)質(zhì)譜濾紙干血片檢測(cè)中，即使檢測(cè)結(jié)果顯示?；鈮A的含量升高，患者仍存在患有甲基丙二酸血癥或丙酸血癥兩種病癥的可能性，診斷的特異性不高，容易出現(xiàn)誤診或錯(cuò)診。因此，GC-MS聯(lián)用檢測(cè)尿液有機(jī)酸的方法是輔助診斷甲基丙二酸血癥的主要手段，能夠診斷多數(shù)的有機(jī)酸代謝疾病。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)的GC-MS聯(lián)用尿液有機(jī)酸檢測(cè)通常包括如下步驟:取一定量的尿樣，加入尿素酶去除尿素后加入內(nèi)標(biāo)并定容，調(diào)節(jié)PH值，加入鹽酸羥胺進(jìn)行反應(yīng)，之后進(jìn)行酸堿中和，萃取、干燥后進(jìn)行衍生化反應(yīng)，以及樣品上機(jī)進(jìn)行有機(jī)酸檢測(cè)。檢測(cè)的儀器條件一般為:
[0005]1.GC 部分
[0006]進(jìn)樣方式:分流模式；
[0007]分流比:10:1;
[0008]進(jìn)樣口溫度:280 °C;
[0009]升溫程序:100°C保持4分鐘，以4°C /分鐘的升溫速率升至280°C，保持11分鐘；
[0010]流量控制模式:恒線速度。
[0011]2.MS 部分
[0012]離子源溫度:200 °C ;
[0013]接口溫度:280 °C;
[0014]采樣方式:Scan ；
[0015]間隔:0.50s;
[0016]掃描速度:1000;
[0017]開始掃描離子質(zhì)核比(m/z):50 ；
[0018]結(jié)束掃描離子質(zhì)核比(m/z):500。
[0019]上述檢測(cè)方法中，樣品上機(jī)前的整個(gè)前處理周期需要5-6個(gè)小時(shí)，同時(shí)樣品分析周期也長(zhǎng)，一般需要I小時(shí)左右。這么長(zhǎng)的前處理和檢測(cè)周期有可能會(huì)延誤甲基丙二酸血癥患兒的診斷、治療甚至搶救。
[0020]綜上，鑒于甲基丙二酸血癥在有機(jī)酸代謝疾病中的發(fā)病率高，會(huì)造成患兒不可逆的神經(jīng)損害等嚴(yán)重后果，串聯(lián)質(zhì)譜法濾紙干血片檢測(cè)的敏感指標(biāo)與丙酸血癥相似，特異性不高，不易確診；而作為目前主要檢測(cè)手段的GC-MS聯(lián)用尿液有機(jī)酸檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，可能會(huì)延誤最佳治療時(shí)機(jī)。因此，需要找到一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)尿液甲基丙二酸的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021]針對(duì)現(xiàn)有串聯(lián)質(zhì)譜法濾紙干血片檢測(cè)和GC-MS聯(lián)用尿液甲基丙二酸檢測(cè)方法的缺陷，本發(fā)明的目的在于通過(guò)簡(jiǎn)單的尿液前處理方法、以及優(yōu)化氣相色譜和質(zhì)譜的儀器條件，從而實(shí)現(xiàn)尿液甲基丙二酸的快速檢測(cè)。
[0022]本發(fā)明提供一種尿液處理方法，包括以下步驟:取一定量的尿樣，加入內(nèi)標(biāo)及冰凍無(wú)水乙醇，充分震蕩混合均勻，離心處理去除蛋白，取上清液，氮吹至完全干燥，加入衍生化試劑進(jìn)行反應(yīng)。
[0023]優(yōu)選本發(fā)明的尿液處理方法中所述一定量的尿樣含0.2毫克肌酐。
[0024]優(yōu)選本發(fā)明的尿液處理方法中所述內(nèi)標(biāo)為托品酸。
[0025]優(yōu)選本發(fā)明的尿液處理方法中所述冰凍無(wú)水乙醇為2.0ml。
[0026]優(yōu)選本發(fā)明的尿液處理方法中所述離心在4000rpm下進(jìn)行5分鐘。
[0027]優(yōu)選本發(fā)明的尿液處理方法中所述氮吹在60°C條件下進(jìn)行。
[0028]優(yōu)選本發(fā)明的尿液處理方法中所述衍生化反應(yīng)使用雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺:三甲基氯硅烷為99:1的硅烷化試劑，在70°C條件下進(jìn)行。
[0029]本發(fā)明還提供一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)尿液甲基丙二酸的方法，包括本發(fā)明的尿液處理方法，以及在下述氣相色譜和質(zhì)譜儀器條件下上機(jī)檢測(cè)。
[0030]1.氣相色譜部分
[0031]進(jìn)樣方式:分流模式；
[0032]分流比:10:1;
[0033]進(jìn)樣口溫度:280 °C;
[0034]升溫程序:120°C保持2分鐘，以10°C /分鐘的升溫速率升至180°C，保持1.5分鐘
[0035]流量控制模式:恒線速度。
[0036]2.質(zhì)譜部分
[0037]離子源溫度:200°C ；
[0038]接口溫度:280 °C;
[0039]采樣方式:Scan ；
[0040]間隔:0.50s;
[0041]掃描速度:1000;
[0042]開始掃描離子質(zhì)核比(m/z):50 ；
[0043]結(jié)束掃描離子質(zhì)核比(m/z):300。
[0044]本發(fā)明的尿液處理方法不需要經(jīng)尿素酶處理去除尿素，并且通過(guò)離心去除蛋白，操作簡(jiǎn)單易行，大大節(jié)省了樣本處理時(shí)間。此外，本發(fā)明的尿液甲基丙二酸檢測(cè)方法能夠達(dá)到較高的精確度和準(zhǔn)確度，是一項(xiàng)簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，可以用于有機(jī)酸血癥，特別是甲基丙二酸血癥的診斷及治療效果監(jiān)測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0045]圖1是通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)的尿液有機(jī)酸檢測(cè)方法測(cè)得的正常新生兒GC-MS圖譜。
[0046]圖2是通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)的尿液有機(jī)酸檢測(cè)方法測(cè)得的甲基丙二酸血癥患兒GC-MS圖
■]並曰O
[0047]圖3是通過(guò)本發(fā)明的尿液甲基丙二酸檢測(cè)方法測(cè)得的正常新生兒GC-MS圖譜。
[0048]圖4是通過(guò)本發(fā)明的尿液甲基丙二酸檢測(cè)方法測(cè)得的甲基丙二酸血癥患兒GC-MS圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0049]為了便于理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)的說(shuō)明。
[0050]實(shí)施例1尿液的處理
[0051]采集正常新生兒和甲基丙二酸血癥患兒尿液，按照以下步驟進(jìn)行處理:(1)采用紫外分光光度法測(cè)定尿液中的肌酐含量，取相當(dāng)于0.2毫克肌酐的尿樣；(2)加入內(nèi)標(biāo)2-苯基-3-羥基丙酸(托品酸)及2.0ml冰凍無(wú)水乙醇，用自動(dòng)振動(dòng)器充分震蕩混合均勻；
(3)用離心分離機(jī)以4000rpm離心5分鐘去除蛋白；(4)將上清液轉(zhuǎn)移，在60°C條件下用氮吹儀氮吹至完全干燥；(5)在70°C條件下，向干燥殘余物中加入雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA):三甲基氯硅烷(TMCS)為99:1的硅烷化試劑進(jìn)行30分鐘衍生化反應(yīng)。整個(gè)處理過(guò)程需要約I小時(shí)。
[0052]對(duì)比例I尿液的處理(現(xiàn)有技術(shù)方法)
[0053]采集正常新生兒和甲基丙二酸血癥患兒尿液，按照以下步驟進(jìn)行處理:(I)采用紫外分光光度法測(cè)定尿液中的肌酐含量，取相當(dāng)于0.2毫克肌酐的尿樣；(2)加入30μ1尿素酶(IKU)充分振蕩后，在37°C條件下，靜置30分鐘去除尿素，然后加入40 μ I內(nèi)標(biāo)托品酸并定容至2.0ml ；(3)調(diào)節(jié)PH至12，加入鹽酸羥胺充分反應(yīng)后，加入600 μ I濃度為37%的鹽酸，充分振蕩，進(jìn)行10分鐘酸堿中和；(4)使用6ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取后，在60°C條件下使用氮吹儀氮吹至完全干燥；(5)在70°C條件下加入100 μ I的BSTFA:TMCS (99:1)進(jìn)行30分鐘衍生化反應(yīng)。整個(gè)處理過(guò)程需要約5小時(shí)。
[0054]實(shí)施例2對(duì)處理過(guò)的尿液進(jìn)行檢測(cè)
[0055]將經(jīng)如上前處理的尿樣分別用現(xiàn)有的GC-MS尿液有機(jī)酸檢測(cè)法和本發(fā)明的GC-MS尿液甲基丙二酸檢測(cè)法上機(jī)檢測(cè)。
[0056]現(xiàn)有GC-MS尿液有機(jī)酸檢測(cè)法的儀器條件如下:
[0057]1.GC 部分
[0058]進(jìn)樣方式:分流模式；
[0059]分流比:10:1;
[0060]進(jìn)樣口溫度:280 °C;
[0061 ] 升溫程序:100°C保持4分鐘，以4°C /分鐘的升溫速率升至280°C，保持11分鐘
[0062]流量控制模式:恒線速度；
[0063]2.MS 部分
[0064]離子源溫度:200°C ；
[0065]接口溫度:280 °C;
[0066]米樣方式:Scan ；
[0067]間隔:0.50s;
[0068]掃描速度:1000;
[0069]開始m/z: 50;
[0070]結(jié)束m/z: 500。
[0071]檢測(cè)得到的圖譜如圖1和圖2所示，圖1為正常新生兒的結(jié)果，圖2為甲基丙二酸血癥患兒的結(jié)果。由圖1和圖2可以看出，現(xiàn)有檢測(cè)方法的檢測(cè)周期約為I小時(shí)，較長(zhǎng)。
[0072]本發(fā)明的檢測(cè)方法除了如下改變GC部分的升溫程序和MS部分的結(jié)束掃描離子質(zhì)核比以外，其他儀器條件保持不變。
[0073]1.GC部分條件
[0074]升溫程序:120°C保持2分鐘，以10°C /分鐘的升溫速率升至180°C，保持1.5分鐘；
[0075]2.MS部分條件
[0076]結(jié)束m/z: 300。
[0077]檢測(cè)得到的圖譜如圖3和圖4所示，圖3為正常新生兒的結(jié)果，圖4為甲基丙二酸血癥患兒的結(jié)果。由圖3和圖4可以看出，本發(fā)明檢測(cè)方法的檢測(cè)周期僅約為9分鐘，大幅縮短。
[0078]通過(guò)比較圖2和圖4可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明檢測(cè)方法中甲基丙二酸的色譜峰與現(xiàn)有技術(shù)方法同樣容易識(shí)別，同時(shí)整個(gè)檢測(cè)周期得到了大幅縮短，是一種快捷而準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。
[0079]需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的說(shuō)明書及附圖中給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施例，但這些實(shí)施例僅僅是示例性的，用于幫助理解本發(fā)明的內(nèi)容，并不構(gòu)成對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
的任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明公開內(nèi)容所進(jìn)行的各種改變/變換，均落入本發(fā)明要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種尿液處理方法，其特征在于，包括以下步驟: a.取一定量的尿樣， b.加入內(nèi)標(biāo)及冰凍無(wú)水乙醇，充分震蕩混合均勻， c.離心去除蛋白； d.取上清液，氮吹至完全干燥； e.加入衍生化試劑進(jìn)行反應(yīng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的尿液處理方法，其特征在于，所述一定量的尿樣含0.2毫克肌酐。3.根據(jù)權(quán)利要求1的尿液處理方法，其特征在于，所述內(nèi)標(biāo)為托品酸。4.根據(jù)權(quán)利要求1的尿液處理方法，其特征在于，所述冰凍無(wú)水乙醇為2.0mlo5.根據(jù)權(quán)利要求1的尿液處理方法，其特征在于，所述離心在4000rpm下進(jìn)行5分鐘。6.根據(jù)權(quán)利要求1的尿液處理方法，其特征在于，所述氮吹在60°C條件下進(jìn)行。7.根據(jù)權(quán)利要求1的尿液處理方法，其特征在于，所述衍生化反應(yīng)使用雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺:三甲基氯硅烷為99:1的硅烷化試劑，在70°C條件下進(jìn)行。8.一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)尿液甲基丙二酸的方法，其特征在于，包括權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的尿液處理方法，以及在下述氣相色譜和質(zhì)譜儀器條件下上機(jī)檢測(cè)，其中 氣相色譜儀器條件為: 進(jìn)樣方式:分流模式； 分流比:10:1 ； 進(jìn)樣口溫度:280°c ； 升溫程序:120°C保持2分鐘，以10°C /分鐘的升溫速率升至180°C， 保持1.5分鐘 流量控制模式:恒線速度。 質(zhì)譜儀器條件為: 離子源溫度:200°C ； 接口溫度:280 0C ； 采樣方式:Scan ；間隔:0.50s ； 掃描速度:1000 ； 開始掃描離子質(zhì)核比m/z:50 ； 結(jié)束掃描離子質(zhì)核比m/z:300。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種尿液處理方法，包括以下步驟：取一定量的尿樣，加入內(nèi)標(biāo)及冰凍無(wú)水乙醇，充分震蕩混合均勻，離心處理去除蛋白，取上清液，氮吹至完全干燥，加入衍生化試劑進(jìn)行反應(yīng)。本發(fā)明還公開了一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)尿液甲基丙二酸的方法，其包括本發(fā)明的尿液處理方法，并優(yōu)化了處理后氣相色譜和質(zhì)譜檢測(cè)的儀器條件。采用本發(fā)明的尿液處理和檢測(cè)方法，大大節(jié)省了尿樣處理時(shí)間，可以簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確地檢測(cè)有機(jī)酸血癥，特別是甲基丙二酸血癥。
【IPC分類】G01N30/88, G01N30/06
【公開號(hào)】CN104991018
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510363081
【發(fā)明人】楊江濤
【申請(qǐng)人】深圳愛(ài)灣醫(yī)學(xué)技術(shù)服務(wù)有限公司
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年6月26日