一種基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法，包括樣品前處理、色譜質(zhì)譜分離、代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、代謝物的定量分析、數(shù)據(jù)分析步驟。本發(fā)明采用極性溶劑和非極性溶劑分別萃取煙草柱頭極性代謝物和非極性代謝物，采用保留指數(shù)和質(zhì)譜譜圖庫定性鑒定氣相色譜質(zhì)譜所采集的所有代謝物，采用非靶標(biāo)定量分析方法定量分析所采集的所有代謝物。該方法的建立為開展煙草柱頭代謝組學(xué)相關(guān)研究提供了重要的參考。
【專利說明】
一種基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝 組學(xué)分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 代謝組學(xué)是對(duì)生物系統(tǒng)因病理生理刺激以及基因、環(huán)境等改變所致動(dòng)態(tài)多參數(shù)代 謝應(yīng)答的定性定量研究。代謝組學(xué)是近年來迅速發(fā)展的一個(gè)研究領(lǐng)域，從1997年提出代謝 組學(xué)的概念以來，在植物、動(dòng)物和微生物研究領(lǐng)域取得了卓有成效的成績(jī)，尤其在植物代謝 組學(xué)研究方面許多國(guó)內(nèi)外知名大學(xué)和研究單位都開展了相關(guān)研究工作。
[0003] 代謝組學(xué)研究所采用的分析方法主要有核磁共振光譜法、液相色譜質(zhì)譜法、氣相 色譜質(zhì)譜法等。到目前為止，氣相色譜質(zhì)譜由于其操作成本低、定性定量能力強(qiáng)以及對(duì)代謝 物的覆蓋面廣等特點(diǎn)，已經(jīng)成為植物代謝組學(xué)研究最重要的分析方法之一。
[0004] 煙草是植物生物學(xué)研究非常重要的一種模式植物，也是非常重要的一種經(jīng)濟(jì)植 物。目前，人們已在煙草品質(zhì)、抗病、抗蟲等方面開展了大量的研究，這些研究主要是從基 因、環(huán)境等方面展開，而從代謝組學(xué)的角度開展研究的相關(guān)報(bào)道卻較少。這主要是因?yàn)榇x 組學(xué)目前仍是一種不斷完善和發(fā)展的研究方法。由于煙葉是煙草的主要經(jīng)濟(jì)器官，人們對(duì) 于煙草的研究主要集中在煙葉上。煙草柱頭是煙草繁殖時(shí)接受花粉的器官，與煙草雜交育 種直接相關(guān)，是不同品種煙草間雜交親和性研究的直接對(duì)象。因此建立煙草柱頭的代謝組 學(xué)研究方法具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括樣品前處理、色譜質(zhì)譜分離、代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、 代謝物的定量分析、數(shù)據(jù)分析步驟，具體包括： A、 樣品前處理:將新鮮的煙草柱頭樣品放入研缽，加液氮冷凍，研磨，冷凍干燥后得到 凍干煙草柱頭樣本，于4°C進(jìn)行保存； B、 色譜質(zhì)譜分離： 1) 極性代謝物的提取及衍生化:準(zhǔn)確稱取20.0 mg的凍干煙草柱頭樣本于1.5 mL離心 管，加入370 yL甲醇、480 yL去離子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲，離 心，取下清液600此，放入凍干機(jī)離心濃縮2小時(shí)以去掉溶劑，取出樣品加入100 yL甲氧胺 溶液，37 °C恒溫肟化90 min，加入80 yL MSTFA，37 °C恒溫硅烷化30 min，衍生完的樣品轉(zhuǎn) 至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量1 yL; 2) 非極性代謝物的提取:準(zhǔn)確稱取100.0 mg凍干煙草柱頭樣本，加入4.9 mL二氯甲烷 和100 yL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲30 min，離心，取上清液2 mL氮?dú)獯蹈桑尤?00 yL二氯甲烷復(fù)溶， 復(fù)溶后提取液轉(zhuǎn)至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量1 yL; C、 代謝物結(jié)構(gòu)鑒定:采用質(zhì)譜去卷積和譜圖庫檢索、保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化合物驗(yàn)證相結(jié)合 的方法進(jìn)行化合物定性； D、 代謝物的定量分析:將代謝物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積相除，獲得相對(duì)定量信息， 具體計(jì)算公式如下：
其中，CjPCi分別代表代謝物X和內(nèi)標(biāo)的含量，yg/g; 八、和&分別代表代謝物X和內(nèi)容的色譜峰面積； E、 數(shù)據(jù)分析:將每個(gè)分析樣本中極性代謝物和非極性代謝物的定量分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng) 計(jì)，采用主成分分析和聚類分析作為多變量分析方法，進(jìn)行樣本之間的相對(duì)關(guān)系研究，采用 T檢驗(yàn)作為單變量統(tǒng)計(jì)分析方法，尋找關(guān)鍵代謝物。
[0007] 本發(fā)明采用極性溶劑和非極性溶劑分別萃取煙草柱頭極性代謝物和非極性代謝 物，采用保留指數(shù)和質(zhì)譜譜圖庫定性鑒定氣相色譜質(zhì)譜所采集的所有代謝物，采用非靶標(biāo) 定量分析方法定量分析所采集的所有代謝物。該方法的建立為開展煙草柱頭代謝組學(xué)相關(guān) 研究提供了重要的參考。
【附圖說明】
[0008] 圖1為K326和alata柱頭的主成分分析得分圖（左)和載荷圖（右）； 圖2為K326和alata柱頭代謝物無監(jiān)督聚類分析圖； 圖3為K326和alata柱頭代謝物的T檢驗(yàn)結(jié)果火山圖； 圖4為煙草柱頭極性代謝物的氣相色譜質(zhì)譜分析總離子流圖； 圖5為煙草柱頭非極性代謝物的氣相色譜質(zhì)譜分析總離子流圖。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以 限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010] 本發(fā)明所述的基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法，包括樣品前處 理、色譜質(zhì)譜分離、代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、代謝物的定量分析、數(shù)據(jù)分析步驟，具體包括： A、 樣品前處理:將新鮮的煙草柱頭樣品放入研缽，加液氮冷凍，研磨，冷凍干燥后得到 凍干煙草柱頭樣本，于4°C進(jìn)行保存； B、 色譜質(zhì)譜分離： 1) 極性代謝物的提取及衍生化:準(zhǔn)確稱取20.0 mg的凍干煙草柱頭樣本于1.5 mL離心 管，加入370 yL甲醇、480 yL去離子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲，離 心，取下清液600此，放入凍干機(jī)離心濃縮2小時(shí)以去掉溶劑，取出樣品加入100 yL甲氧胺 溶液，37 °C恒溫肟化90 min，加入80 yL MSTFA，37 °C恒溫硅烷化30 min，衍生完的樣品轉(zhuǎn) 至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量1 yL; 2) 非極性代謝物的提取:準(zhǔn)確稱取100.0 mg凍干煙草柱頭樣本，加入4.9 mL二氯甲烷 和100 yL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲30 min，離心，取上清液2 mL氮?dú)獯蹈?，加?00 yL二氯甲烷復(fù)溶， 復(fù)溶后提取液轉(zhuǎn)至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量1 yL; C、 代謝物結(jié)構(gòu)鑒定:采用質(zhì)譜去卷積和譜圖庫檢索、保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化合物驗(yàn)證相結(jié)合 的方法進(jìn)行化合物定性； D、 代謝物的定量分析:將代謝物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積相除，獲得相對(duì)定量信息， 具體計(jì)算公式如下：
其中，CjPCi分別代表代謝物X和內(nèi)標(biāo)的含量，yg/g; 八、和&分別代表代謝物X和內(nèi)容的色譜峰面積； E、 數(shù)據(jù)分析:將每個(gè)分析樣本中極性代謝物和非極性代謝物的定量分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng) 計(jì)，采用主成分分析和聚類分析作為多變量分析方法，進(jìn)行樣本之間的相對(duì)關(guān)系研究，采用 T檢驗(yàn)作為單變量統(tǒng)計(jì)分析方法，尋找關(guān)鍵代謝物。
[0011] A步驟中研磨后的樣品粒徑為小于40目。
[0012] A步驟中冷凍干燥的真空度為0.18 mbar，溫度為-6°C〇 [0013] B步驟1沖所述的內(nèi)標(biāo)溶液為100 yg/mL的對(duì)羥基香豆酸水溶液。
[0014] B步驟1)中超聲的頻率為25~45 kHz，時(shí)間為20~30 min。
[0015] B步驟1)中離心的離心力彡5000g。
[0016] B步驟1)中凍干機(jī)離心濃縮的真空度為0.18 mbar，溫度為-6°C。
[0017] B步驟1)中所述的甲氧胺溶液的濃度為20 mg/ml。
[0018] B步驟2)中所述的內(nèi)標(biāo)溶液為100 yg/mL的桃醛的二氯甲烷溶液;所述的離心的離 心力彡10000g。
[0019] B步驟中色譜分析條件為：色譜柱為DB-5MS (30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)，程 序升溫條件為60°C保持1 min，5 °C/min升至280 °C，保持15 min;進(jìn)樣口溫度為250 °C; 進(jìn)樣體積為1 yL;載氣為氦氣;柱流量為1.1 mL/min;分流比為20:1;質(zhì)譜分析條件為:傳輸 線溫度為230 °C;離子源溫度210 °C;非極性代謝物的溶劑延遲時(shí)間為2 min，極性衍生化 樣品的溶劑延遲時(shí)間為7 min;質(zhì)量掃描范圍為m/z 35-400;質(zhì)譜掃描速度為5 Hz。
[0020]下面以盛開期煙草柱頭為例進(jìn)行分析，具體為： 1、樣品前處理 1.1實(shí)驗(yàn)試劑及裝置 甲醇（色譜級(jí)）購(gòu)買于德國(guó)Merck公司；超純水由Mi 11 ipore純化系統(tǒng)制備。對(duì)羥基香豆 酸和桃醛（內(nèi)標(biāo)化合物)購(gòu)買于百靈威公司；〇#輕質(zhì)柴油（用于保留指數(shù)計(jì)算)購(gòu)自當(dāng)?shù)丶佑?站。PE Clarus 600 GC-MS氣相色譜質(zhì)譜儀(美國(guó)PE公司）；SB-50D超聲波提取儀(寧波新芝 生物科技股份有限公司）；DB-5 MS毛細(xì)管色譜柱（30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)(美國(guó) Agilent公司）；MILLI-Q純水機(jī)(MILLIP0RE公司）；LD5-2A離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公 司）；CP2245分析天平(感量0.0001g，德國(guó)Sartorious公司）。
[0021] 1.2樣品前處理 樣品制備：將新鮮的煙草柱頭樣品放入研缽，加液氮冷凍，并迅速研磨粉碎（小于40 目）。磨好樣品迅速轉(zhuǎn)入凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥（真空度0.18 mbar，溫度-6 °C，凍干時(shí)間72 h)，除去水分，置于4°C冰箱保存。
[0022] 樣品提取及衍生化:將煙草柱頭中代謝物分為極性代謝物和非極性代謝物。其中 極性代謝物的提取和衍生化方法為:準(zhǔn)確稱取20.0 mg的凍干煙草柱頭樣本于1.5 mL離心 管，加入370 yL甲醇、480 yL去離子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL內(nèi)標(biāo)溶液(對(duì)羥基香 豆酸水溶液100 yg/mL)，超聲30 min，離心（離心力彡5000g)，取下清液600 yL，放入凍干機(jī) (真空度0.18 mbar，溫度-6 °C )離心濃縮2小時(shí)以去掉溶劑，取出樣品加入100 yL甲氧胺溶 液（20 mg/mL，吡啶溶液），37 °C恒溫肟化90 min，加入80 yL MSTFA，37 °C恒溫硅烷化30 min，衍生完的樣品轉(zhuǎn)至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量1 yL。
[0023] 非極性代謝物的提取方法:準(zhǔn)確稱取100.0 mg凍干煙草柱頭樣本，加入4.9 mL二 氯甲燒和100 yL內(nèi)標(biāo)溶液(桃醛的二氯甲燒溶液，100 yg/mL)，超聲30 min，離心(離心力彡 10000g)，取上清液2 mL氮?dú)獯蹈?，加?00 yL二氯甲烷復(fù)溶，復(fù)溶后提取液轉(zhuǎn)至氣相色譜 質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量1 yL。
[0024] 1.3色譜質(zhì)譜分析條件 為方便極性代謝物與非極性代謝物對(duì)比，本方法中兩種代謝物的色譜分離條件和質(zhì)譜 分析條件基本相同（除溶劑切割時(shí)間），具體的色譜質(zhì)譜條件如下： 色譜分析條件:色譜柱為DB-5MS (30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)，程序升溫條件為60 。(:保持1 min，5 °C/min升至280 °C，保持15 min;進(jìn)樣口溫度為250 °C;進(jìn)樣體積為1 yL; 載氣為氦氣;柱流量為1.1 mL/min;分流比為20:1。
[0025] 質(zhì)譜分析條件:傳輸線溫度為230 °C ;離子源溫度210 °C ;非極性代謝物的溶劑延 遲時(shí)間為2 min，極性衍生化樣品的溶劑延遲時(shí)間為7 min;質(zhì)量掃描范圍為m/z 35-400;質(zhì) 譜掃描速度為5 Hz。
[0026] 1.4代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定 由于代謝組學(xué)關(guān)注的是某種方法能檢測(cè)到的所有代謝物的變化情況，而其中絕大多數(shù) 代謝物很可能是傳統(tǒng)的代謝物分析中未關(guān)注的，因此對(duì)未知代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定是代謝組學(xué) 十分重要的研究?jī)?nèi)容。本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)譜去卷積和譜圖庫檢索、保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化合物驗(yàn)證相 結(jié)合的方法進(jìn)行化合物定性。
[0027] 質(zhì)譜去卷積和譜圖庫檢索：由于氣相色譜無法將所有代謝物徹底分離，因此氣相 色譜質(zhì)譜分析儀得到的某一時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)譜圖實(shí)際上可能是幾種化合物的質(zhì)譜圖的混合。本 實(shí)驗(yàn)采用AMDIS(V 2.7)軟件進(jìn)行質(zhì)譜圖去卷積和峰識(shí)別，獲得去除了基質(zhì)背景和重疊峰的 純凈質(zhì)譜圖。米用NIST MS Search 2.0配NIST mainlib數(shù)據(jù)庫、wileyregistry8e 數(shù)據(jù)庫 和fiehn代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物的初步結(jié)構(gòu)定性。
[0028] 保留指數(shù)定性：由于代謝物在相同類型氣相色譜柱上的保留指數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，本實(shí) 驗(yàn)采用保留指數(shù)進(jìn)行輔助結(jié)構(gòu)定性。具體方法為:將碳數(shù)連續(xù)的直鏈烷烴(〇#柴油）按照本 實(shí)驗(yàn)的色譜質(zhì)譜方法進(jìn)行分析，獲得這些烷烴的保留時(shí)間，然后根據(jù)以下公式進(jìn)行代謝物 的保留指數(shù)計(jì)算：
其中：指保留時(shí)間在碳數(shù)為η和n+1之間的某個(gè)代謝物的保留指數(shù);η代表直鏈烷烴 的碳數(shù);tx、tn、tn+1分別指代謝物X、碳數(shù)為η的直鏈烷烴、碳數(shù)為η+1的直鏈烷烴等的保留時(shí) 間。
[0029] 標(biāo)準(zhǔn)化合物驗(yàn)證:對(duì)經(jīng)質(zhì)譜庫和保留指數(shù)定性的化合物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化合物驗(yàn)證。即 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化合物按照本實(shí)驗(yàn)的色譜質(zhì)譜方法進(jìn)行分析，將得到的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖與煙草柱 頭樣品中待定化合物進(jìn)行比對(duì)，如果兩者均能吻合，則最終確定該化合物的定性結(jié)果。
[0030] 1.5代謝物的定量分析方法 由于無法或者難以獲得所有代謝物的標(biāo)準(zhǔn)化合物，以及代謝組學(xué)通常無需絕對(duì)定量， 代謝物的定量分析采用相對(duì)定量的方法。即假設(shè)代謝物在檢測(cè)器上的響應(yīng)與內(nèi)標(biāo)物一致， 將代謝物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積相除，獲得相對(duì)定量信息。具體計(jì)算公式如下：
其中，CjPC:*別代表代謝物X和內(nèi)標(biāo)的含量，六\和&分別代表代謝物X和內(nèi)標(biāo)的色譜峰 面積。
[0031] 1.6數(shù)據(jù)分析 將每個(gè)分析樣本中極性代謝物和非極性代謝物的定量分析結(jié)果整合成一個(gè)Excel數(shù)據(jù) 表(峰表），峰表中某一個(gè)代謝物的定量信息被歸入特定的一列（行），以便于多樣本間代謝 物含量的統(tǒng)計(jì)分析。采用主成分分析和聚類分析作為多變量分析方法，研究樣本之間的相 對(duì)關(guān)系研究，采用T檢驗(yàn)作為單變量統(tǒng)計(jì)分析方法，尋找關(guān)鍵代謝物。
[0032]下面以具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明： 實(shí)施例1 一一不同品種(K326和alata)煙草柱頭代謝組學(xué)研究 實(shí)驗(yàn)材料:盛開期的K326和alata品種煙草花的柱頭樣本各6個(gè)，樣品制備按照"樣品前 處理"部分所描述方法進(jìn)行。
[0033]實(shí)驗(yàn)方法： 極性代謝物的提取和衍生化方法為:準(zhǔn)確稱取20.0 mg的凍干煙草柱頭樣本于1.5 mL 離心管，加入370 yL甲醇、480 yL去離子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL內(nèi)標(biāo)溶液(對(duì)羥 基香豆酸水溶液100 yg/mL)，超聲30 min，離心(離心力彡5000g)，取下清液600 yL，放入凍 干機(jī)(真空度0.18 mbar，溫度-6°C)離心濃縮2小時(shí)，去掉溶劑，取出樣品加入100 yL甲氧胺 溶液（20 mg/mL，吡啶溶液），37°C水浴加熱90 min，加入80 yL MSTFA，37°C水浴30 min，衍 生完的樣品轉(zhuǎn)至氣相色譜質(zhì)譜分析儀分析，進(jìn)樣量1 yL。
[0034] 非極性代謝物的提取方法:準(zhǔn)確稱取100.0 mg的凍干煙草柱頭樣本，加入4.9 mL 二氯甲燒和100 yL內(nèi)標(biāo)溶液(桃醛的二氯甲燒溶液，100 yg/mL)，超聲30 min，離心(離心力 彡10000g)，取上清液2 mL氮?dú)獯蹈?，加?00 yL二氯甲烷復(fù)溶，復(fù)溶后提取液轉(zhuǎn)至氣相色 譜質(zhì)譜分析儀分析，進(jìn)樣量1 yL。
[0035] 色譜分析條件：色譜柱為DB-5MS (30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)程序升溫條件 為60°C保持1 min，5 °C/min升至280 °C，保持15 min;進(jìn)樣口溫度為250 °C;進(jìn)樣體積為1 yL;載氣為氦氣;柱流量為1.1 mL/min;分流比為20:1。
[0036] 質(zhì)譜分析條件:傳輸線溫度為230 °C ;離子源溫度210 °C ;非極性代謝物的溶劑延 遲時(shí)間為2 min，極性衍生化樣品的溶劑延遲時(shí)間為7 min;質(zhì)量掃描范圍為m/z 35-400;質(zhì) 譜掃描速度為5 Hz。采用質(zhì)譜去卷積和譜圖庫檢索、保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化合物驗(yàn)證相結(jié)合的方 法進(jìn)行化合物定性。采用內(nèi)標(biāo)相對(duì)定量的方法進(jìn)行定量。
[0037] 代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定:采用質(zhì)譜去卷積和譜圖庫檢索、保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化合物驗(yàn)證相 結(jié)合的方法進(jìn)行化合物定性。采用AMDIS(V 2.7)軟件進(jìn)行質(zhì)譜圖去卷積和峰識(shí)別，獲得去 除了基質(zhì)背景和重疊峰的純凈質(zhì)譜圖。采用NIST MS Search 2.0配NIST mainlib數(shù)據(jù)庫、 wileyregistry8e數(shù)據(jù)庫和fiehn代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物的初步結(jié)構(gòu)定性。采用保留 指數(shù)進(jìn)行輔助結(jié)構(gòu)定性。具體方法為:將碳數(shù)連續(xù)的直鏈烷烴(〇#柴油)按照本實(shí)驗(yàn)的色譜 質(zhì)譜方法進(jìn)行分析，獲得這些烷烴的保留時(shí)間，然后根據(jù)以下公式進(jìn)行代謝物的保留指數(shù) 計(jì)算：
其中：RIX指保留時(shí)間在碳數(shù)為η和n+1之間的某個(gè)代謝物的保留指數(shù);η代表直鏈烷烴 的碳數(shù);tx、tn、tn+1分別指代謝物X、碳數(shù)為η的直鏈烷烴、碳數(shù)為η+1的直鏈烷烴等的保留時(shí) 間。
[0038] 代謝物的定量分析：由于無法或者難以獲得所有代謝物的標(biāo)準(zhǔn)化合物，以及代謝 組學(xué)通常無需絕對(duì)定量，代謝物的定量分析采用相對(duì)定量的方法。即假設(shè)代謝物在檢測(cè)器 上的響應(yīng)與內(nèi)標(biāo)物一致，將代謝物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積相除，獲得相對(duì)定量信息。具 體計(jì)算公式如下：
其中，Cx和CI分別代表代謝物X和內(nèi)標(biāo)的含量，Αχ和ΑΙ分別代表代謝物X和內(nèi)標(biāo)的色譜 峰面積。
[0039] 數(shù)據(jù)分析:采用主成分分析和聚類分析作為多變量分析方法，研究樣本之間的相 對(duì)關(guān)系研究，采用Τ檢驗(yàn)作為單變量統(tǒng)計(jì)分析方法，尋找關(guān)鍵代謝物。
[0040] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1、表2、圖1、圖2、圖3中。從圖1可以看出Κ326與alata在 主成分分析得分圖（圖1左）的二維平面上有明顯的分離，說明這兩種煙草的柱頭代謝物存 在著明顯的差異，而具體的差異代謝物在主成分分析得分圖（圖1右)上得到體現(xiàn)。
[0041] 對(duì)代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析（圖2)發(fā)現(xiàn)，alata和K326兩個(gè)品種形成兩個(gè)明顯的聚 類，而兩個(gè)大類中個(gè)別樣本間的層次關(guān)系也在圖2中得到充分體現(xiàn)。
[0042] 為了進(jìn)一步找到和驗(yàn)證差異性代謝物，對(duì)所有代謝物進(jìn)行T檢驗(yàn)分析，將分析的到 的P值和類間均值比（alata除以K326)做成火山圖（圖3)，取p值小于0.05，且均值比大于2或 小于〇. 5的代謝物在圖中用黃色標(biāo)出。從火山圖上可以直觀看到K326與alata兩種煙草柱頭 的顯著差異性代謝物。
[0043]表1部分柱頭代謝物的結(jié)構(gòu)定性結(jié)果
表2部分柱頭代謝物的相對(duì)定量分析峰表
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法，其特征在于包括樣品前處 理、色譜質(zhì)譜分離、代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、代謝物的定量分析、數(shù)據(jù)分析步驟，具體包括： A、 樣品前處理:將新鮮的煙草柱頭樣品放入研缽，加液氮冷凍，研磨，冷凍干燥后得到 凍干煙草柱頭樣本，于4°C進(jìn)行保存； B、 色譜質(zhì)譜分離： 1) 極性代謝物的提取及衍生化:準(zhǔn)確稱取20.0 mg的凍干煙草柱頭樣本于1.5 mL離心 管，加入370 yL甲醇、480 yL去離子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲，離 心，取下清液600此，放入凍干機(jī)離心濃縮2小時(shí)以去掉溶劑，取出樣品加入100 yL甲氧胺 溶液，37 °C恒溫肟化90 min，加入80 yL MSTFA，37 °C恒溫硅烷化30 min，衍生完的樣品轉(zhuǎn) 至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量I yL; 2) 非極性代謝物的提取:準(zhǔn)確稱取100.0 mg凍干煙草柱頭樣本，加入4.9 mL二氯甲烷 和100 yL內(nèi)標(biāo)溶液，超聲30 min，離心，取上清液2 mL氮?dú)獯蹈?，加?00 yL二氯甲烷復(fù)溶， 復(fù)溶后提取液轉(zhuǎn)至氣相色譜質(zhì)譜儀分析，進(jìn)樣量I yL; C、 代謝物結(jié)構(gòu)鑒定:采用質(zhì)譜去卷積和譜圖庫檢索、保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化合物驗(yàn)證相結(jié)合 的方法進(jìn)行化合物定性； D、 代謝物的定量分析:將代謝物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積相除，獲得相對(duì)定量信息， 具體計(jì)算公式如下：其中，CjPCi分別代表代謝物X和內(nèi)標(biāo)的含量，yg/g; AjPA1*別代表代謝物X和內(nèi)容的色譜峰面積； E、 數(shù)據(jù)分析：將每個(gè)分析樣本中極性代謝物和非極性代謝物的定量分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng) 計(jì)，采用主成分分析和聚類分析作為多變量分析方法，進(jìn)行樣本之間的相對(duì)關(guān)系研究，采用 T檢驗(yàn)作為單變量統(tǒng)計(jì)分析方法，尋找關(guān)鍵代謝物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法，其特征在 于A步驟中研磨后的樣品粒徑為小于40目。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法，其特征在 于A步驟中冷凍干燥的真空度為0.18mbar，溫度為-6 °C。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法，其特征在 于B步驟1)中所述的內(nèi)標(biāo)溶液為100 yg/mL的對(duì)羥基香豆酸水溶液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法，其特征在 于B步驟1)中超聲的頻率為25~45 kHz，時(shí)間為20~30min。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法，其特征在 于B步驟1)中離心的離心力彡5000g。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法，其特征在 于B步驟1)中凍干機(jī)離心濃縮的真空度為0.18 mbar，溫度為-6°C。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法，其特征在 于B步驟1)中所述的甲氧胺溶液的濃度為20 mg/ml。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法，其特征在 于B步驟2)中所述的內(nèi)標(biāo)溶液為100 yg/mL的桃醛的二氯甲烷溶液;所述的離心的離心力多 1000 Og010. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于氣相色譜質(zhì)譜的煙草柱頭代謝組學(xué)分析方法，其特征在 于B步驟中色譜分析條件為:色譜柱為DB-5MS (30 m X 0.25 mm X 0.25 μL?)，程序升溫 條件為60°C保持I min，5 °C/min升至280 °C，保持15 min;進(jìn)樣口溫度為250 °C;進(jìn)樣體 積為I yL;載氣為氦氣;柱流量為I. I mL/min;分流比為20:1;質(zhì)譜分析條件為:傳輸線溫度 為230 °C ;離子源溫度210 °C ;非極性代謝物的溶劑延遲時(shí)間為2 min，極性衍生化樣品的 溶劑延遲時(shí)間為7 min;質(zhì)量掃描范圍為m/z 35-400;質(zhì)譜掃描速度為5 Hz。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK106018626SQ201610608785
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月29日
【發(fā)明人】李勇, 逄濤, 師君麗, 馬文廣
【申請(qǐng)人】云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院