一種基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法，包括樣品前處理、色譜質譜分離、代謝物結構鑒定、代謝物的定量分析、數(shù)據(jù)分析步驟。本發(fā)明采用極性溶劑和非極性溶劑分別萃取煙草根部極性代謝物和非極性代謝物，采用保留指數(shù)和質譜譜圖庫定性鑒定氣相色譜質譜所采集的所有代謝物，采用非靶標定量分析方法定量分析所采集的所有代謝物。該方法的建立為開展煙草根部代謝組學相關研究提供了重要的參考。
【專利說明】
一種基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學技術領域，具體涉及一種基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝 組學分析方法。
【背景技術】
[0002] 代謝組學是對生物系統(tǒng)因病理生理刺激以及基因、環(huán)境等改變所致動態(tài)多參數(shù)代 謝應答的定性定量研究。代謝組學是近年來迅速發(fā)展的一個研究領域，從1997年提出代謝 組學的概念以來，在植物、動物和微生物研究領域取得了卓有成效的成績，尤其在植物代謝 組學研究方面許多國內外知名大學和研究單位都開展了相關研究工作。
[0003] 代謝組學研究所采用的分析方法主要有核磁共振光譜法、液相色譜質譜法、氣相 色譜質譜法等。到目前為止，氣相色譜質譜由于其操作成本低、定性定量能力強以及對代謝 物的覆蓋面廣等特點，已經成為植物代謝組學研究最重要的分析方法之一。
[0004] 煙草是植物生物學研究非常重要的一種模式植物，也是非常重要的一種經濟植 物。目前，人們已在煙草品質、抗病、抗蟲等方面開展了大量的研究，這些研究主要是從基 因、環(huán)境等方面展開，而從代謝組學的角度開展研究的相關報道卻較少。這主要是因為代謝 組學目前仍是一種不斷完善和發(fā)展的研究方法。由于煙葉是煙草的主要經濟器官，人們對 于煙草的研究主要集中在煙葉上，不過煙草的很多重要代謝物(例如尼古丁 )都是通過根合 成，然后經莖轉至葉。同時煙草的很多疾病(例如黑脛病)與根和莖直接相關。因此建立煙草 根的代謝組學研究方法具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，包括樣品前處理、色譜質譜分離、代謝物結構鑒定、 代謝物的定量分析、數(shù)據(jù)分析步驟，具體包括： A、 樣品前處理:將新鮮的煙草根樣品剪成小塊置入研缽，加液氮冷凍，研磨，冷凍干燥 后得到凍干煙草根部樣本，于4 °C進行保存； B、 色譜質譜分離： 1) 極性代謝物的提取及衍生化:準確稱取20.0 mg的凍干煙草根部樣本于1.5 mL離心 管，加入370 yL甲醇、480 yL去離子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL內標溶液，超聲，離 心，取下清液600此，放入凍干機離心濃縮2小時以去掉溶劑，取出樣品加入100 yL甲氧胺 溶液，37 °C恒溫肟化90 min，加入80 yL MSTFA，37 °C恒溫硅烷化30 min，衍生完的樣品轉 至氣相色譜質譜儀分析，進樣量1 yL; 2) 非極性代謝物的提取:準確稱取100.0 mg凍干煙草根部樣本，加入4.9 mL二氯甲烷 和100 yL內標溶液，超聲30 min，離心，取上清液2 mL氮氣吹干，加入200 yL二氯甲烷復溶， 復溶后提取液轉至氣相色譜質譜儀分析，進樣量1 yL; C、 代謝物結構鑒定:采用質譜去卷積和譜圖庫檢索、保留指數(shù)、標準化合物驗證相結合 的方法進行化合物定性； D、 代謝物的定量分析:將代謝物的峰面積與內標物的峰面積相除，獲得相對定量信息， 具體計算公式如下：
其中，CjPCi分別代表代謝物X和內標的含量，yg/g; 八、和&分別代表代謝物X和內容的色譜峰面積； E、 數(shù)據(jù)分析:將每個分析樣本中極性代謝物和非極性代謝物的定量分析結果進行統(tǒng) 計，采用主成分分析和聚類分析作為多變量分析方法，進行樣本之間的相對關系研究，采用 T檢驗作為單變量統(tǒng)計分析方法，尋找關鍵代謝物。
[0007] 本發(fā)明采用極性溶劑和非極性溶劑分別萃取煙草根部極性代謝物和非極性代謝 物，采用保留指數(shù)和質譜譜圖庫定性鑒定氣相色譜質譜所采集的所有代謝物，采用非靶標 定量分析方法定量分析所采集的所有代謝物。該方法的建立為開展煙草根部代謝組學相關 研究提供了重要的參考。
【附圖說明】
[0008] 圖1為紅大和TN90根部的主成分分析得分圖（左)和載荷圖（右）； 圖2為紅大和TN90根部代謝物無監(jiān)督聚類分析圖； 圖3為紅大和TN90根部代謝物的T檢驗結果火山圖； 圖4為煙草根部極性代謝物的氣相色譜質譜分析總離子流圖； 圖5為煙草根部非極性代謝物的氣相色譜質譜分析總離子流圖。
【具體實施方式】
[0009] 下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以 限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0010] 本發(fā)明所述的基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法，包括樣品前處 理、色譜質譜分離、代謝物結構鑒定、代謝物的定量分析、數(shù)據(jù)分析步驟，具體包括： A、 樣品前處理:將新鮮的煙草根樣品剪成小塊置入研缽，加液氮冷凍，研磨，冷凍干燥 后得到凍干煙草根部樣本，于4 °C進行保存； B、 色譜質譜分離： 1) 極性代謝物的提取及衍生化:準確稱取20.0 mg的凍干煙草根部樣本于1.5 mL離心 管，加入370 yL甲醇、480 yL去離子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL內標溶液，超聲，離 心，取下清液600此，放入凍干機離心濃縮2小時以去掉溶劑，取出樣品加入100 yL甲氧胺 溶液，37 °C恒溫肟化90 min，加入80 yL MSTFA，37 °C恒溫硅烷化30 min，衍生完的樣品轉 至氣相色譜質譜儀分析，進樣量1 yL; 2) 非極性代謝物的提取:準確稱取100.0 mg凍干煙草根部樣本，加入4.9 mL二氯甲烷 和100 yL內標溶液，超聲30 min，離心，取上清液2 mL氮氣吹干，加入200 yL二氯甲烷復溶， 復溶后提取液轉至氣相色譜質譜儀分析，進樣量1 yL; C、 代謝物結構鑒定:采用質譜去卷積和譜圖庫檢索、保留指數(shù)、標準化合物驗證相結合 的方法進行化合物定性； D、 代謝物的定量分析:將代謝物的峰面積與內標物的峰面積相除，獲得相對定量信息， 具體計算公式如下：
其中，CjPCi分別代表代謝物X和內標的含量，yg/g; 八、和&分別代表代謝物X和內容的色譜峰面積； E、 數(shù)據(jù)分析:將每個分析樣本中極性代謝物和非極性代謝物的定量分析結果進行統(tǒng) 計，采用主成分分析和聚類分析作為多變量分析方法，進行樣本之間的相對關系研究，采用 T檢驗作為單變量統(tǒng)計分析方法，尋找關鍵代謝物。
[0011] A步驟中研磨后的樣品粒徑為小于40目。
[0012] A步驟中冷凍干燥的真空度為0.18 mbar，溫度為-6°C〇 [0013] B步驟1沖所述的內標溶液為100 yg/mL的對羥基香豆酸水溶液。
[0014] B步驟1)中超聲的頻率為25~45 kHz，時間為20~30 min。
[0015] B步驟1)中離心的離心力彡5000g。
[0016] B步驟1)中凍干機離心濃縮的真空度為0.18 mbar，溫度為-6°C。
[0017] B步驟1)中所述的甲氧胺溶液的濃度為20 mg/ml。
[0018] B步驟2)中所述的內標溶液為100 yg/mL的桃醛的二氯甲烷溶液;所述的離心的離 心力彡10000g。
[0019] B步驟中色譜分析條件為：色譜柱為DB-5MS (30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)，程 序升溫條件為60°C保持1 min，5 °C/min升至280 °C，保持15 min;進樣口溫度為250 °C; 進樣體積為1 yL;載氣為氦氣;柱流量為1.1 mL/min;分流比為20:1;質譜分析條件為:傳輸 線溫度為230 °C;離子源溫度210 °C;非極性代謝物的溶劑延遲時間為2 min，極性衍生化 樣品的溶劑延遲時間為7 min;質量掃描范圍為m/z 35-400;質譜掃描速度為5 Hz。
[0020]下面以一月苗齡的煙草根為例進行分析，具體為： 1、樣品前處理 1.1實驗試劑及裝置 甲醇（色譜級）購買于德國Merck公司；超純水由Mi 11 ipore純化系統(tǒng)制備。對羥基香豆 酸和桃醛（內標化合物)購買于百靈威公司；〇#輕質柴油（用于保留指數(shù)計算)購自當?shù)丶佑?站。PE Clarus 600 GC-MS氣相色譜質譜儀(美國PE公司）；SB-50D超聲波提取儀(寧波新芝 生物科技股份有限公司）；DB-5 MS毛細管色譜柱（30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)(美國 Agilent公司）；MILLI-Q純水機(MILLIP0RE公司）；LD5-2A離心機(北京京立離心機有限公 司）；CP2245分析天平(感量0.0001g，德國Sartorious公司）。
[0021] 1.2樣品前處理 樣品制備:將新鮮的煙草根樣品剪成小塊放入研缽，加液氮冷凍，并迅速研磨粉碎(小 于40目）。磨好樣品迅速轉入凍干機進行冷凍干燥(真空度0.18 mbar，溫度-6°C，凍干時間 72 h)，除去水分，置于4°C冰箱保存。
[0022] 樣品提取及衍生化:將煙草根部中代謝物分為極性代謝物和非極性代謝物。其中 極性代謝物的提取和衍生化方法為:準確稱取20.0 mg的凍干煙草根部樣本于1.5 mL離心 管，加入370 yL甲醇、480 yL去離子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL內標溶液(對羥基香 豆酸水溶液100 yg/mL)，超聲30 min，離心（離心力彡5000g)，取下清液600 yL，放入凍干機 (真空度0.18 mbar，溫度-6 °C )離心濃縮2小時以去掉溶劑，取出樣品加入100 yL甲氧胺溶 液（20 mg/mL，吡啶溶液），37 °C恒溫肟化90 min，加入80 yL MSTFA，37 °C恒溫硅烷化30 min，衍生完的樣品轉至氣相色譜質譜儀分析，進樣量1 yL。
[0023] 非極性代謝物的提取方法:準確稱取100.0 mg凍干煙草根部樣本，加入4.9 mL二 氯甲燒和100 yL內標溶液(桃醛的二氯甲燒溶液，100 yg/mL)，超聲30 min，離心(離心力彡 10000g)，取上清液2 mL氮氣吹干，加入200 yL二氯甲烷復溶，復溶后提取液轉至氣相色譜 質譜儀分析，進樣量1 yL。
[0024] 1.3色譜質譜分析條件 為方便極性代謝物與非極性代謝物對比，本方法中兩種代謝物的色譜分離條件和質譜 分析條件基本相同（除溶劑切割時間），具體的色譜質譜條件如下： 色譜分析條件:色譜柱為DB-5MS (30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)，程序升溫條件為60 。(:保持1 min，5 °C/min升至280 °C，保持15 min;進樣口溫度為250 °C;進樣體積為1 yL; 載氣為氦氣;柱流量為1.1 mL/min;分流比為20:1。
[0025] 質譜分析條件:傳輸線溫度為230 °C ;離子源溫度210 °C ;非極性代謝物的溶劑延 遲時間為2 min，極性衍生化樣品的溶劑延遲時間為7 min;質量掃描范圍為m/z 35-400;質 譜掃描速度為5 Hz。
[0026] 1.4代謝物的結構鑒定 由于代謝組學關注的是某種方法能檢測到的所有代謝物的變化情況，而其中絕大多數(shù) 代謝物很可能是傳統(tǒng)的代謝物分析中未關注的，因此對未知代謝物的結構鑒定是代謝組學 十分重要的研究內容。本實驗采用質譜去卷積和譜圖庫檢索、保留指數(shù)、標準化合物驗證相 結合的方法進行化合物定性。
[0027] 質譜去卷積和譜圖庫檢索：由于氣相色譜無法將所有代謝物徹底分離，因此氣相 色譜質譜分析儀得到的某一時間點的質譜圖實際上可能是幾種化合物的質譜圖的混合。本 實驗采用AMDIS(V 2.7)軟件進行質譜圖去卷積和峰識別，獲得去除了基質背景和重疊峰的 純凈質譜圖。米用NIST MS Search 2.0配NIST mainlib數(shù)據(jù)庫、wileyregistry8e 數(shù)據(jù)庫 和fiehn代謝組學數(shù)據(jù)庫進行代謝物的初步結構定性。
[0028] 保留指數(shù)定性：由于代謝物在相同類型氣相色譜柱上的保留指數(shù)相對穩(wěn)定，本實 驗采用保留指數(shù)進行輔助結構定性。具體方法為:將碳數(shù)連續(xù)的直鏈烷烴(〇#柴油）按照本 實驗的色譜質譜方法進行分析，獲得這些烷烴的保留時間，然后根據(jù)以下公式進行代謝物 的保留指數(shù)計算：
其中：指保留時間在碳數(shù)為η和n+1之間的某個代謝物的保留指數(shù);η代表直鏈烷烴 的碳數(shù);tx、tn、tn+1分別指代謝物X、碳數(shù)為η的直鏈烷烴、碳數(shù)為η+1的直鏈烷烴等的保留時 間。
[0029] 標準化合物驗證:對經質譜庫和保留指數(shù)定性的化合物進行標準化合物驗證。即 對標準化合物按照本實驗的色譜質譜方法進行分析，將得到的保留時間和質譜圖與煙草根 部樣品中待定化合物進行比對，如果兩者均能吻合，則最終確定該化合物的定性結果。
[0030] 1.5代謝物的定量分析方法 由于無法或者難以獲得所有代謝物的標準化合物，以及代謝組學通常無需絕對定量， 代謝物的定量分析采用相對定量的方法。即假設代謝物在檢測器上的響應與內標物一致， 將代謝物的峰面積與內標物的峰面積相除，獲得相對定量信息。具體計算公式如下：
其中，CjPCi分別代表代謝物X和內標的含量，AjPAi分別代表代謝物X和內標的色譜峰 面積。
[0031] 1.6數(shù)據(jù)分析 將每個分析樣本中極性代謝物和非極性代謝物的定量分析結果整合成一個Excel數(shù)據(jù) 表(峰表），峰表中某一個代謝物的定量信息被歸入特定的一列（行），以便于多樣本間代謝 物含量的統(tǒng)計分析。采用主成分分析和聚類分析作為多變量分析方法，研究樣本之間的相 對關系研究，采用T檢驗作為單變量統(tǒng)計分析方法，尋找關鍵代謝物。
[0032] 下面以具體實施案例對本發(fā)明做進一步說明： 實施例1 一一不同品種(紅大和TN90)煙草根部代謝組學研究 實驗材料:正常生長的紅大和TN90品種煙草樣本各6個，苗齡1個月。樣品制備按照"樣 品前處理"部分所描述方法進行。
[0033]實驗方法： 極性代謝物的提取和衍生化方法為:準確稱取20.0 mg的凍干煙草根部樣本于1.5 mL 離心管，加入370 yL甲醇、480 yL去離子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL內標溶液(對羥 基香豆酸水溶液100 yg/mL)，超聲30 min，離心(離心力彡5000g)，取下清液600 yL，放入凍 干機(真空度0.18 mbar，溫度-6°C)離心濃縮2小時，去掉溶劑，取出樣品加入100 yL甲氧胺 溶液（20 mg/mL，吡啶溶液），37°C水浴加熱90 min，加入80 yL MSTFA，37°C水浴30 min，衍 生完的樣品轉至氣相色譜質譜分析儀分析，進樣量1 yL。
[0034] 非極性代謝物的提取方法:準確稱取100.0 mg的凍干煙草根部樣本，加入4.9 mL 二氯甲燒和100 yL內標溶液(桃醛的二氯甲燒溶液，100 yg/mL)，超聲30 min，離心(離心力 彡10000g)，取上清液2 mL氮氣吹干，加入200 yL二氯甲烷復溶，復溶后提取液轉至氣相色 譜質譜分析儀分析，進樣量1 yL。
[0035] 色譜分析條件：色譜柱為DB-5MS (30 m X 0.25 mm X 0.25 μπι)程序升溫條件 為60°C保持1 min，5 °C/min升至280 °C，保持15 min;進樣口溫度為250 °C;進樣體積為1 yL;載氣為氦氣;柱流量為1.1 mL/min;分流比為20:1。
[0036] 質譜分析條件:傳輸線溫度為230 °C ;離子源溫度210 °C ;非極性代謝物的溶劑延 遲時間為2 min，極性衍生化樣品的溶劑延遲時間為7 min;質量掃描范圍為m/z 35-400;質 譜掃描速度為5 Hz。采用質譜去卷積和譜圖庫檢索、保留指數(shù)、標準化合物驗證相結合的方 法進行化合物定性。采用內標相對定量的方法進行定量。
[0037] 代謝物的結構鑒定:采用質譜去卷積和譜圖庫檢索、保留指數(shù)、標準化合物驗證相 結合的方法進行化合物定性。采用AMDIS(V 2.7)軟件進行質譜圖去卷積和峰識別，獲得去 除了基質背景和重疊峰的純凈質譜圖。采用NIST MS Search 2.0配NIST mainlib數(shù)據(jù)庫、 wileyregistry8e數(shù)據(jù)庫和fiehn代謝組學數(shù)據(jù)庫進行代謝物的初步結構定性。采用保留 指數(shù)進行輔助結構定性。具體方法為:將碳數(shù)連續(xù)的直鏈烷烴(〇#柴油)按照本實驗的色譜 質譜方法進行分析，獲得這些烷烴的保留時間，然后根據(jù)以下公式進行代謝物的保留指數(shù) 計算：
其中：RIX指保留時間在碳數(shù)為η和n+1之間的某個代謝物的保留指數(shù);η代表直鏈烷烴 的碳數(shù);tx、tn、tn+1分別指代謝物X、碳數(shù)為η的直鏈烷烴、碳數(shù)為η+1的直鏈烷烴等的保留時 間。
[0038] 代謝物的定量分析：由于無法或者難以獲得所有代謝物的標準化合物，以及代謝 組學通常無需絕對定量，代謝物的定量分析采用相對定量的方法。即假設代謝物在檢測器 上的響應與內標物一致，將代謝物的峰面積與內標物的峰面積相除，獲得相對定量信息。具 體計算公式如下：
其中，Cx和CI分別代表代謝物X和內標的含量，Αχ和ΑΙ分別代表代謝物X和內標的色譜 峰面積。
[0039] 數(shù)據(jù)分析:采用主成分分析和聚類分析作為多變量分析方法，研究樣本之間的相 對關系研究，采用Τ檢驗作為單變量統(tǒng)計分析方法，尋找關鍵代謝物。
[0040] 實驗結果:實驗結果列于表1、表2、圖1、圖2、圖3中。從圖1可以看出紅大與ΤΝ90在 主成分分析得分圖（圖1左）的二維平面上有明顯的分離，說明這兩種煙草的根部代謝物存 在著明顯的差異，而具體的差異代謝物在主成分分析得分圖（圖1右)上得到體現(xiàn)。
[0041] 對代謝物數(shù)據(jù)進行聚類分析（圖2)發(fā)現(xiàn)，ΤΝ90和紅大兩個品種形成兩個明顯的聚 類，而兩個大類中個別樣本間的層次關系也在圖2中得到充分體現(xiàn)。
[0042] 為了進一步找到和驗證差異性代謝物，對所有代謝物進行Τ檢驗分析，將分析的到 的Ρ值和類間均值比（紅大除以ΤΝ90)做成火山圖（圖3)，取ρ值小于0.05，且均值比大于2或 小于0.5的代謝物在圖中用黃色標出。從火山圖上可以直觀看到紅大與ΤΝ90兩種煙草根部 的顯著差異性代謝物。
[0043] 表1部分根部代謝物的結構定性結果
表2部分根部代謝物的相對定量分析峰表
【主權項】
1. 一種基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法，其特征在于包括樣品前處 理、色譜質譜分離、代謝物結構鑒定、代謝物的定量分析、數(shù)據(jù)分析步驟，具體包括： A、 樣品前處理:將新鮮的煙草根樣品剪成小塊置入研缽，加液氮冷凍，研磨，冷凍干燥 后得到凍干煙草根部樣本，于4 tC進行保存； B、 色譜質譜分離： 1) 極性代謝物的提取及衍生化:準確稱取20.0 mg的凍干煙草根部樣本于1.5 mL離心 管，加入370 yL甲醇、480 yL去離子水、450 yL甲基叔丁基醚和200 yL內標溶液，超聲，離 心，取下清液600此，放入凍干機離心濃縮2小時以去掉溶劑，取出樣品加入100 yL甲氧胺 溶液，37 °C恒溫肟化90 min，加入80 yL MSTFA，37 °C恒溫硅烷化30 min，衍生完的樣品轉 至氣相色譜質譜儀分析，進樣量I yL; 2) 非極性代謝物的提取:準確稱取100.0 mg凍干煙草根部樣本，加入4.9 mL二氯甲烷 和100 yL內標溶液，超聲30 min，離心，取上清液2 mL氮氣吹干，加入200 yL二氯甲烷復溶， 復溶后提取液轉至氣相色譜質譜儀分析，進樣量I yL; C、 代謝物結構鑒定:采用質譜去卷積和譜圖庫檢索、保留指數(shù)、標準化合物驗證相結合 的方法進行化合物定性； D、 代謝物的定量分析:將代謝物的峰面積與內標物的峰面積相除，獲得相對定量信息， 具體計算公式如下：其中，Cx和&分別代表代謝物X和內標的含量，yg/g; AjPA1*別代表代謝物X和內容的色譜峰面積； E、 數(shù)據(jù)分析：將每個分析樣本中極性代謝物和非極性代謝物的定量分析結果進行統(tǒng) 計，采用主成分分析和聚類分析作為多變量分析方法，進行樣本之間的相對關系研究，采用 T檢驗作為單變量統(tǒng)計分析方法，尋找關鍵代謝物。2. 根據(jù)權利要求1所述的基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法，其特征在 于A步驟中研磨后的樣品粒徑為小于40目。3. 根據(jù)權利要求1所述的基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法，其特征在 于A步驟中冷凍干燥的真空度為0.18 mbar，溫度為-6 °C。4. 根據(jù)權利要求1所述的基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法，其特征在 于B步驟1)中所述的內標溶液為100 yg/mL的對羥基香豆酸水溶液。5. 根據(jù)權利要求1所述的基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法，其特征在 于B步驟1)中超聲的頻率為25~45 kHz，時間為20~30 min。6. 根據(jù)權利要求1所述的基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法，其特征在 于B步驟1)中離心的離心力彡5000g。7. 根據(jù)權利要求1所述的基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法，其特征在 于B步驟1)中凍干機離心濃縮的真空度為0.18 mbar，溫度為-6°C。8. 根據(jù)權利要求1所述的基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法，其特征在 于B步驟1)中所述的甲氧胺溶液的濃度為20 mg/ml。9. 根據(jù)權利要求1所述的基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法，其特征在 于B步驟2)中所述的內標溶液為100 yg/mL的桃醛的二氯甲烷溶液;所述的離心的離心力多 1000 Og010. 根據(jù)權利要求1所述的基于氣相色譜質譜的煙草根部代謝組學分析方法，其特征在 于B步驟中色譜分析條件為:色譜柱為DB-5MS (30 m X 0.25 mm X 0.25 μL?)，程序升溫 條件為60°C保持I min，5 °C/min升至280 °C，保持15 min;進樣口溫度為250 °C;進樣體 積為I yL;載氣為氦氣;柱流量為I. I mL/min;分流比為20:1;質譜分析條件為:傳輸線溫度 為230 °C ;離子源溫度210 °C ;非極性代謝物的溶劑延遲時間為2 min，極性衍生化樣品的 溶劑延遲時間為7 min;質量掃描范圍為m/z 35-400;質譜掃描速度為5 Hz。
【文檔編號】G01N30/88GK106018653SQ201610608885
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月29日
【發(fā)明人】李勇, 逄濤, 師君麗, 鄧建華
【申請人】云南省煙草農業(yè)科學研究院