具有抗流感活性的扎那米韋膦酸酯同類物及流感病毒的奧司他韋易感性的測(cè)定的制作方法
【專利說(shuō)明】具有抗流感活性的扎那米韋滕酸酯同類物及流感病毒的奧 司他韋易感性的測(cè)定
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年5月10日、申請(qǐng)?zhí)枮?01180034218. 3、發(fā)明名稱為"具 有抗流感活性的扎那米韋膦酸酯同類物及流感病毒的奧司他韋易感性的測(cè)定"的申請(qǐng)的分 案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本申請(qǐng)為2011年5月10日提交的序號(hào)為PCT/US2011/035982的國(guó)際專利申請(qǐng)根 據(jù)第371節(jié)在國(guó)家階段提交并要求2010年5月10日提交的序號(hào)為61/333, 137且題為"測(cè) 定流感病毒的奧司他韋易感性的組合物和方法"的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通 過(guò)引入整體并入本文。
[0004] 序列
[0005] 本申請(qǐng)包括序列表。ASCII文本文件（創(chuàng)建于2011年7月26日，名為SEQLIST_ ASN51301US_ST25. txt，大小為714字節(jié)）的整體內(nèi)容通過(guò)引入整體并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0006] 本發(fā)明涉及有效對(duì)抗流感病毒的新型化合物。本發(fā)明涉及抑制來(lái)自H1N1、H5N1和 H3N2流感病毒的野生型和奧司他韋耐藥性病毒株的流感病毒的神經(jīng)氨酸酶的新型膦酸酯 化合物。本發(fā)明涉及抗藥病原體的檢測(cè)。具體地，本發(fā)明涉及奧司他韋耐藥性流感病毒的 檢測(cè)。更具體地，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明公開(kāi)的新型化合物檢測(cè)奧司他韋耐藥性流感病毒。
【背景技術(shù)】
[0007] 甲型流感病毒的爆發(fā)持續(xù)引起世界范圍內(nèi)廣泛的發(fā)病率和死亡率。僅在美國(guó)，每 年估計(jì)5-20%的人群感染甲型流感病毒，導(dǎo)致約200,000人住院治療和36,000人死亡。 制定全面的接種疫苗政策已成為降低流感發(fā)病率的有效措施。然而，病毒的頻繁遺傳漂變 需要每年都進(jìn)行疫苗的重配制，從而很可能導(dǎo)致接種疫苗中的病毒株與傳播中的病毒不匹 配。
[0008] 甲型流感病毒由9種結(jié)構(gòu)蛋白組成并且編碼具有調(diào)節(jié)功能的另外兩種非結(jié)構(gòu)NSl 蛋白。病毒基因組的節(jié)段性質(zhì)形成了在不同病毒株對(duì)細(xì)胞的交叉感染過(guò)程中發(fā)生基因重配 (基因組節(jié)段交換）的機(jī)制。根據(jù)其表面顯示的不同紅細(xì)胞凝集素（HA)和神經(jīng)氨酸酶（NA) 病毒蛋白，將甲型流感病毒分成不同亞型。甲型流感病毒亞型通過(guò)兩種病毒表面糖蛋白，紅 細(xì)胞凝集素（HA或H)和神經(jīng)氨酸酶（NA或N)來(lái)鑒定。每組流感病毒亞型均通過(guò)其H和N 蛋白組合來(lái)鑒定。有16種已知的HA亞型和9種已知的NA亞型。
[0009] 流感病毒是可感染包括人在內(nèi)的很多動(dòng)物種類的負(fù)鏈RNA片段病毒（negative sense segmented RNA virus)。流感基因組通過(guò)病毒編碼的RNA依賴性RNA聚合酶的復(fù) 制是在所有時(shí)間都產(chǎn)生具有不同基因序列的子代的易出錯(cuò)過(guò)程?；蚋淖兊幕畈《颈?稱為"抗原性漂變的"突變體。病毒基因組的節(jié)段性質(zhì)和感染不同動(dòng)物種類的可能性可 產(chǎn)生"抗原性漂變的"突變體（P.K. Cheng 等人，Emerg. Infect. Dis. 15,966(2009))。在 期望的條件下，顯性變異體可能成為針對(duì)人或動(dòng)物的突出病原菌。還不能完全了解導(dǎo)致 突變體進(jìn)化的多步驟篩選方法（L. Cohen-Daniel等人，J. Clin. Virol. 44, 138(2009); R. Wagner, Μ· Matrosovich, Η· D. Klenk, Rev. Med. Virol. 12, 159 (2002))。然而，疫苗常被 用于預(yù)防流感病毒感染，治療流感感染的最有用療法包括施用Tamiflu? (奧司他韋乙酯 的磷酸鹽，Roche Laboratories, Inc.)和Relenza? (扎那米韋，Glaxo Wellcome, Inc.) (N. J. Cox, J. M. Hughes, N. Engl. J. Med. 341，1387 (1999))。奧司他韋（oseltamivir)和扎那 米韋（zanamivir)是防止子代病毒粒子在粘液分泌內(nèi)的釋放和散播并由此降低病毒感染 性的病毒唾液酸酶（神經(jīng)氨酸酶）抑制劑。作為在流感病毒表面表達(dá)的糖蛋白，神經(jīng)氨酸 酶（NA)對(duì)病毒復(fù)制和通過(guò)斷裂宿主細(xì)胞的表面唾液酸受體（sialo-receptor)與子代病毒 之間的鍵而產(chǎn)生的感染性至關(guān)重要。因此，基于結(jié)構(gòu)的策略來(lái)抑制NA已應(yīng)用于開(kāi)發(fā)抗流感 藥。
[0010] 扎那米韋（Relenza?) (von Itzstein，M.等人，Nature 1993, 363, 418. Dunn, C. J. ;Goa，K.L. Drugs 1999,58,761.)是治療流感的流行藥。克流感（Tamiflu)是前藥，該前 藥易于被肝酯酶水解產(chǎn)生相應(yīng)的作為活性抑制劑的羧酸奧司他韋而與病毒的神經(jīng)氨酸酶 (NA)活性位點(diǎn)內(nèi)的3個(gè)精氨酸殘基相互作用（Argll8、Arg292和Arg371) (von Itzstein，M. 等人，Nature 1993, 363, 418. Lew, W.等人，Curr. Med. Chem. 2000, 7, 663. Russell, R.J.等 人，Nature 2006,443,45.)。奧司他韋和扎那米韋均通過(guò)斷裂宿主細(xì)胞的表面涎蛋白受 體與子代病毒之間的鍵來(lái)抑制對(duì)病毒繁殖很重要的流感病毒NA。NA抑制劑設(shè)計(jì)為具有 (氧雜）環(huán)己烯支架以模擬唾液酸（N-乙酰神經(jīng)氨酸，其為用于與病毒NA的活性位點(diǎn)結(jié) 合的細(xì)胞表面糖蛋白的最外糖）酶促裂解的氧鑰過(guò)渡態(tài)。為適應(yīng)與羧酸奧司他韋結(jié)合， 需要生成大疏水袋的NA的誘導(dǎo)裝配，用于3-戊基側(cè)鏈（Collins, P. J.，等人，Nature 2008, 453, 1258.)。相比之下，扎那米韋對(duì)新進(jìn)化的耐藥性病毒沒(méi)有奧司他韋磷酸鹽那樣易 感。由于不需要生成疏水性結(jié)合袋，扎那米韋對(duì)NA突變體（例如，臨床相關(guān)的H274Y突變 體）的抑制能力不變。
[0011] 甲型流感（HlNl)病毒具有奧司他韋耐藥性，這歸功于神經(jīng)氨酸酶（NA)蛋白274 位組氨酸變?yōu)槔野彼幔℉274Y)的氨基酸變化。2008年洶涌而來(lái)的季節(jié)性HlNl中的奧司他 韋耐藥性H274Y突變體（A. Moscona, N. Engl. J. Med. 360, 953(2009))令人困惑，因?yàn)檫@些 突變的增長(zhǎng)在很多H274Y流行地區(qū)與奧司他韋的使用無(wú)關(guān)（J. Mossong等人，Antiviral Res. 84,91(2009) ;M. Jonges 等人，Antiviral Res. 83, 290(2009))。此外，在患者中報(bào)導(dǎo) 了 H274Y 奧司他韋耐藥性的全國(guó)流行性 HlNl (A. Gulland, Br. Med. J. 339, b4975 (2009))和 H5N1突變體（Q. M. Le等人，Nature 437, 1108(2005))，這表明這些突變體會(huì)影響流感療法 的選擇（I. Stephenson 等人，Clin. Infect. Dis. 48, 389 (2009)) 〇
[0012] □通過(guò)修飾甘油基部分支架以模擬唾液酸酶裂解中的氧鑰過(guò)渡態(tài)，已經(jīng)制 備了很多扎那米韋衍生物。膦酸酯基團(tuán)通常在藥物設(shè)計(jì)中用作羧酸鹽的生物電子等 排體（White, C.L.等人，了.]?〇1.81〇1.1995,245,623.5。11即，1(.八.；1^11(11161'，評(píng).〇16111· Rev. 2005, 105, 67. Streicher, H. ;Busseb, H. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 1047.)。相比于羧 酸鹽-胍鹽離子對(duì)，膦酸根離子會(huì)顯示與胍鹽離子更強(qiáng)的靜電作用。因此，期望扎那米韋膦 酸酯同類物可更強(qiáng)地對(duì)抗HlNl和H5N1病毒甚至H274Y突變體的神經(jīng)氨酸酶。親合力的增 強(qiáng)可歸功于生理?xiàng)l件下膦酸酯基團(tuán)與3個(gè)精氨酸殘基（A