含n-乙?；Y(jié)構(gòu)肝素寡糖的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物的分離純化領(lǐng)域，更具體涉及含N-乙酰化結(jié)構(gòu)肝素寡糖的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素(Heparin，HP)是帶有大量負(fù)電荷的線性糖胺聚糖，在細(xì)胞表面和細(xì)胞基質(zhì)中廣泛表達(dá)。HP與眾多的蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)控多種生物學(xué)功能。除了具有抗凝血及抗血拴生成的功能外，肝素還具有抗平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎癥、抗腫瘤及抗病毒等功能，而這些生物活性功能與肝素的特異結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。肝素聚糖鏈由50-200個重復(fù)的二糖單元構(gòu)成，肝素六糖和八糖通過特殊的序列與多種蛋白質(zhì)、酶等相互作用調(diào)控著肝素的生理功能。肝素六糖片段中C3位硫酸化和N位乙?；课皇歉嗡鼐哂锌鼓涂箮畎挴}病毒作用活性的必需位點(diǎn)。肝素的N位基團(tuán)是它與多種細(xì)胞增長因子相互結(jié)合的必要位點(diǎn)，并且具有抑制腫瘤細(xì)胞來源的類肝素酶的活性。最引人關(guān)注的是，低分子量肝素在臨床上有直接的抗癌活性，它有助于延長腫瘤患者的生存時間，這可能與肝素的微量結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系。因此對微量結(jié)構(gòu)肝素寡糖的序列分析，不僅對其結(jié)構(gòu)與功能的研宄具有重要意義，同時也為肝素作為有效的抑制劑提供了理論基礎(chǔ)。
[0003]HP 二糖是由己糖酸酸(Hexuronic acid, Hex A)與葡萄糖胺(Glucosamine，GlcN)以1-4糖苷鍵連接而成。肝素大部分結(jié)構(gòu)是高硫結(jié)構(gòu)，N-乙酰化結(jié)構(gòu)是它的稀有結(jié)構(gòu)，僅占整體的5%左右，這部分結(jié)構(gòu)對于肝素功能也是至關(guān)重要的。N-乙酰化結(jié)構(gòu)與硫酸類肝素中NS/NAc區(qū)域結(jié)構(gòu)相似。由于硫酸類肝素難于制備，天然來源的硫酸類肝素大概只有肝素量的1%。因此利用肝素制備HS類似的寡糖片段在思路和技術(shù)方法上具有創(chuàng)新性，也為肝素/硫酸類肝素結(jié)構(gòu)與功能的研宄提供了重要的乙酰寡糖庫。
[0004]由于質(zhì)譜精度高，可快速分析糖類精細(xì)結(jié)構(gòu)，近年來質(zhì)譜和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)被大量應(yīng)用于分析HP 二糖或寡糖。Kailemia MJ等應(yīng)用質(zhì)譜表征了一個類似肝素結(jié)構(gòu)的五糖藥物。Amster IJ等應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜分析了酶化學(xué)合成的肝素結(jié)構(gòu)。
[0005]本發(fā)明應(yīng)用酶I的特異性，能夠酶解肝素中高度硫酸化的二糖，使得低含量的N-乙?；嗡毓烟歉患聛?；之后利用多種色譜進(jìn)行分離，能一次性制備一系列由六糖(dp6)到十四糖(dpl4)的含N-乙?；Y(jié)構(gòu)寡糖。最后結(jié)合酶解，高效液相色譜分離，質(zhì)譜鑒定等方法確定寡糖的結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種含N-乙?；Y(jié)構(gòu)肝素寡糖的制備方法，即以低分子量的肝素為原料，經(jīng)過酶解、分離純化，得到4種六糖和3種八糖片段。本發(fā)明解決了含N-乙?；嗡毓烟请y制備及結(jié)構(gòu)測定問題，并使肝素/硫酸類肝素特殊結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系的研宄得以進(jìn)一步發(fā)展。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)施的: 一種含N-乙?；Y(jié)構(gòu)肝素寡糖的制備方法，包括以下步驟:
(O以低分子量肝素為原料，經(jīng)肝素酶I酶解富集含N-乙?；Y(jié)構(gòu)的寡糖；
(2)然后通過B1-GelP-1O凝膠色譜法分離得到系列肝素寡糖粗樣品；
(3)再利用強(qiáng)陰離子高效液相色譜方法對步驟(2)的粗樣品進(jìn)一步分離，分別提純得到4種六糖和3種八糖片段；
(4)最后利用肝素酶1、肝素酶II和肝素酶III復(fù)合酶解與強(qiáng)陰離子色譜法分析各純化寡糖的二糖組分，并結(jié)合肝素酶I底物特異性，分析4種六糖和3種八糖的序列結(jié)構(gòu)；最后利用質(zhì)譜法測定寡糖的分子量。
[0008]所述的步驟(I)具體為:將分子量為100?300 mg的肝素溶解在l~3ml、0.1 M、pH 7.0乙酸鈉緩沖溶液中，然后加入30?70mIU肝素酶I，在37° C水浴中酶解6~12h后，再加入30~70 mIU肝素酶I，繼續(xù)酶解6?12h ;然后加熱至100° C沸騰3min終止反應(yīng)，10000 rpm離心10 min，取上清液，凍干。
[0009]所述的步驟(2)具體為:將步驟(I)得到的凍干樣品用Iml 0.15?0.25M碳酸氫銨溶解，上樣到串聯(lián)B1-Gel凝膠層析柱；然后用0.15?0.25M碳酸氫銨洗脫，流速0.2ml/min,自動收集儀收集；分離的寡糖用紫外分光光度計(jì)檢測，檢測波長232 nm ;依次收集每個色譜峰對應(yīng)的糖片段；55° C加熱24h揮發(fā)碳酸氫銨，冷凍干燥獲得肝素寡糖粗樣品。
[0010]所述的步驟(3)具體為:利用強(qiáng)陰離子高效液相色譜分離粗樣品；色譜柱為ProPac離子柱，4.0 X 250mm ;色譜條件:流動相A為pH 2.0?4.0的超純水，流動相B為pH 2.0?4.0、1.5?2.5M NaCl溶液；具體操作方法為:先將步驟(2)制得的粗樣品溶解在Iml pH 2.0?4.0的水，注入樣品；色譜流速lml/min，先沖2ml ρΗ3.5的水；NaCl線性梯度從O至0.8 M、2.1 - 7.1 min, 0.8至1.5 M、7.1 - 47.1 min進(jìn)行洗脫，洗脫得到的寡糖用紫外分光光度計(jì)檢測，檢測波長232 nm ;收集各色譜峰對應(yīng)的寡糖樣品，以截留分子量500的透析膜透析2天，凍干，得到dp6a、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c純樣品。
[0011]所述的步驟(4)具體為:取7種步驟(3)制得的純樣品各100 yg，分別加入5mIU的肝素酶1、肝素酶II和肝素酶III復(fù)合酶解，并采用強(qiáng)陰離子交換色譜分析，色譜分離條件如下:流動相A為pH 2.0?4.0的超純水，流動相B為pH 2.0?4.0、1.5?2.5M NaCl ；樣品溶解于Iml pH 3.5的水；色譜流速lml/min ;先沖2ml pH3.5的水；NaCl線性梯度從0-0.5M、2.1-35.lmin，然后0.5-1.0M,35.1 - 57.1 min洗脫，洗脫得到的寡糖用紫外分光光度計(jì)檢測，檢測波長232 nm;得到寡糖結(jié)構(gòu)為:
dp6a Δ HexA-GlcNS-HexA-GlcNS-HexA2S-GlcNS6S ；
dp6b Δ HexA2S-GlcNS6S- HexA2S_GlcNAc- HexA 2S_GlcNS6S ；
dp6c Δ HexA-GlcNS6S-HexA-GlcNAc6S-HexA2S-GlcNS6S ；
dp6d Δ HexA-GlcNS6S- HexA 2S_GlcNAc6S- HexA 2S_GlcNS6S ；
dp8a Δ HexA2S-GlcNS-[HexA2S-GlcNAc-HexA_GlcNS]-HexA2S_GlcNS6S ；
dp8b Δ HexA2S-GlcNS6S-[HexA2S-GlcNAc-HexA_GlcNS]-HexA2S_GlcNS6S ；
dp8c Δ HexA2S-GlcNS6S-[ HexA 2S_GlcNAc- HexA-GlcNAc6S]- HexA 2S_GlcNS6S ;
最后利用質(zhì)譜法測定寡糖的分子量。
[0012]肝素酶1、I1、III的復(fù)合配比為1:1:1。
[0013]所述步驟(4)中質(zhì)譜法的檢測條件為:離子化模式:ESI源；負(fù)離子模式；霧化氣為高純N2，流速1.50 L / min;干燥氣為高純N2，流速10 L / min ;加熱模塊溫度200°C ;曲形脫溶劑管的溫度為200°C ;離子源電壓4.5 kV ;檢測器電壓1.6kV ;質(zhì)量掃描范圍:m / z200 ?2000 ；
測定方法:分別準(zhǔn)確吸取 10 μ1、50 Pg/ml 的 dp6a、dp6b、dp6c、dp6d、dp8a、dp8b、dp8c，在負(fù)離子模式下，手動注入質(zhì)譜儀；測得分子離子峰質(zhì)荷比為:dp6a，[M-2H]2_ m/z704.5428 ;dp6b，[M-2HF m/z 805.4776 ;dp6c，[M-2HF m/z 765.5191 ;dp6d，[M-2H]2-m/z805.4681 ;dp8a，[M-3H] m/z 649.0288 ;dp8b，[M-3H] m/z 689.6623 ;dp8c，[M-3H] m/z675.6822。
【附圖說明】
[0014]圖1為B1-Gel P_10凝膠色譜柱分離肝素寡糖的色譜圖；
圖2強(qiáng)陰離子色譜分離dp6和dp8 ;
圖 3 dp6a，dp6b，dp6c 和 dp6d 質(zhì)譜圖；
圖4 dp8a，dp8b和dp8c質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1
1)將200mg低分子量肝素溶解在2.0ml、0.1 M、pH 7.0乙酸鈉緩沖溶液中(含0.1mM乙酸鈣和lOOyg/ml BSA)，加入50 mIU肝素酶I，在37° C水浴中酶解12h后，再加入50mIU肝素酶I繼續(xù)酶解12 h ;然后加熱至100° C沸騰3min終止反應(yīng)，10000 rpm離心lOmin，取上清液，凍干；
2)取凍干的樣品用Iml0.2M碳酸氫銨溶解，上樣到串聯(lián)B1-Gel層析柱，0.2M碳酸氫銨洗脫，流速0.2ml/min，自動收集儀收集；分離的寡糖用紫外分光光度計(jì)檢測，檢測波長232 nm;依次收集每個色譜峰對應(yīng)的糖片段，55° C加熱24h揮發(fā)碳酸氫銨，冷凍干燥獲